Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, който използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добри резултати препоръчваме да използвате по-нова версия на вашия браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние показваме сайта без стилове или JavaScript.
Червеният женшен се използва в традиционната азиатска медицина от стотици години.В това проучване ние оценихме способността на четири вида червен женшен (китайски червен женшен, корейски червен женшен A, корейски червен женшен B и корейски червен женшен C), отглеждани в различни региони, да инхибират образуването и растежа на предизвикани от канцерогени бели дробове тумори.Беше проведен тест с бензо(а)пирен (B(a)P) върху A/J мишки и беше установено, че корейският червен женшен B е най-ефективен за намаляване на туморното натоварване сред четирите разновидности на червен женшен.В допълнение, ние анализирахме съдържанието на различни гинзенозиди (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5) в четири екстракта от червен женшен и установихме, че корейският червен женшен B има най-високите нива на гинзенозид Rg3 (G-Rg3), което предполага, че G-Rg3 може да играе важна роля в неговата терапевтична ефикасност.Тази работа показва, че G-Rg3 има относително ниска бионаличност.Въпреки това, когато G-Rg3 се прилага едновременно с инхибитора на P-gp верапамил, ефлуксът на G-Rg3 в Caco-2 клетките е намален, скоростта на чревната абсорбция на G-Rg3 е повишена в модел на плъх и G-Rg3 беше увеличена.В Caco-2 клетките изтичането на Rg3 намалява и нивото на концентрация на Rg3 намалява.G-Rg3 се увеличава в червата и плазмата и способността му да предотвратява тумори също се засилва в плъх модел на B(a)P-индуцирана туморогенеза.Ние също така открихме, че G-Rg3 намалява B(a)P-индуцираната цитотоксичност и образуването на ДНК адукт в човешки белодробни клетки и възстановява експресията и активността на фаза II ензими чрез Nrf2 пътя, което може да е свързано с потенциалния механизъм на действие на G инхибиране -Rg3..За появата на белодробни тумори.Нашето проучване демонстрира потенциално важна роля за G-Rg3 при насочване към белодробни тумори в миши модели.Оралната бионаличност на този гинзенозид се подобрява чрез насочване към P-гликопротеин, което позволява на молекулата да упражнява противоракови ефекти.
Най-често срещаният тип рак на белия дроб е недребноклетъчният рак на белия дроб (NSCLC), който е една от водещите причини за смърт от рак в Китай и Северна Америка1,2.Основният фактор, който повишава риска от развитие на недребноклетъчен рак на белия дроб, е тютюнопушенето.Цигареният дим съдържа повече от 60 канцерогена, включително бензо(а)пирен (B(a)P), нитрозамини и радиоактивни изотопи от разпадането на радон.3 Полицикличните ароматни въглеводороди B(a)P са основната причина за токсичност в цигарите дим.При излагане на B(a)P, цитохром P450 го превръща в B(a)P-7,8-дихидродиол-9,10-епоксид (BPDE), който реагира с ДНК, за да образува BPDE-ДНК адукт 4. Освен това, тези адуктите индуцират белодробна туморогенеза при мишки с туморен стадий и хистопатология, подобна на човешки белодробни тумори5.Тази характеристика прави B(a)P-индуцирания модел на рак на белия дроб подходяща система за оценка на съединения с възможни противоракови свойства.
Една възможна стратегия за предотвратяване на развитието на рак на белия дроб при групи с висок риск, особено пушачи, е използването на химиопревантивни агенти за потискане на развитието на интраепителни неопластични лезии и по този начин за предотвратяване на последващото им прогресиране до злокачествено заболяване.Проучванията върху животни показват, че различни химиопревантивни средства са ефективни6.Нашият предишен доклад7 подчертава добрите превантивни ефекти на червения женшен върху рака на белия дроб.Тази билка се използва от векове в традиционната азиатска медицина за удължаване на живота и здравето и е документирано, че има антитуморни ефекти8.
Активният фактор на женшен е гинзенозид, който се използва като съставен маркер за оценка на качеството на екстрактите от женшен.Количественият анализ на екстракти от суров женшен обикновено включва използването на няколко гинзенозиди, включително RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 и Rc9,10.Гинзенозидите имат малка клинична употреба поради тяхната много слаба орална бионаличност11.Въпреки че механизмът за тази лоша бионаличност не е ясен, ефлуксът на гинзенозиди, причинен от P-гликопротеин (P-gp)12, може да е причината.P-gp е един от най-важните ефлуксни транспортери в суперсемейството на ATP-свързващи касетни транспортери, което използва енергията на хидролизата на ATP, за да освободи вътреклетъчни вещества във външната среда.P-gp транспортерите обикновено са широко разпространени в червата, бъбреците, черния дроб и кръвно-мозъчната бариера13.P-gp играе критична роля в чревната абсорбция и инхибирането на P-gp увеличава оралната абсорбция и наличността на някои противоракови лекарства 12,14.Примери за инхибитори, използвани преди това в литературата, са верапамил и циклоспорин А15.Тази работа включва създаване на мишка система за изследване на B(a)P-индуциран рак на белия дроб, за да се оцени способността на различни екстракти от червен женшен от Китай и Корея да повлияват злокачествените заболявания.Екстрактите са индивидуално анализирани, за да се идентифицират специфични гинзенозиди, които могат да повлияят на карциногенезата.След това верапамил се използва за насочване към P-gp и подобряване на оралната бионаличност и терапевтичната ефикасност на насочените към рак гинзенозиди.
Механизмът, чрез който сапонините от женшен упражняват терапевтичен ефект върху канцерогенезата, остава неясен.Изследванията показват, че различни гинзенозиди могат да намалят увреждането на ДНК, причинено от канцерогени, чрез намаляване на оксидативния стрес и активиране на ензимите за детоксикация фаза II, като по този начин предотвратяват увреждането на клетките.Глутатион S-трансфераза (GST) е типичен ензим от фаза II, който е необходим за намаляване на увреждането на ДНК, причинено от канцерогени17.Свързаният с ядрения еритроид 2 фактор 2 (Nrf2) е важен транскрипционен фактор, който регулира редокс хомеостазата и активира експресията на фаза II ензими и цитопротективни антиоксидантни реакции18.Нашето проучване също изследва ефектите на идентифицираните гинзенозиди върху намаляването на B(a)P-индуцираната цитотоксичност и образуването на BPDE-DNA адукт, както и индуциране на фаза II ензими чрез модулиране на Nrf2 пътя в нормални белодробни клетки.
Установяването на миши модел на B(a)P-индуциран рак е в съответствие с предишната работа5.Фигура 1А показва експерименталния дизайн на 20-седмично лечение на модел на рак на мишка, индуциран от B(a)P, вода (контрола), екстракт от китайски червен женшен (CRG), екстракт от корейски червен женшен A (KRGA) и корейски червен женшен.Екстракт B (KRGB) и екстракт C от корейски червен женшен (KRGC).След 20 седмици лечение с червен женшен, мишките бяха умъртвени чрез задушаване с CO2.Фигура 1B показва макроскопски белодробни тумори при животни, третирани с различни видове червен женшен, а Фигура 1C показва представителна светлинна микроснимка на туморна проба.Туморното натоварване на третирани с KRGB животни (1.5 ± 0.35) е по-ниско от това на контролните животни (0.82 ± 0.2, P <0.05), както е показано на Фигура 1D.Средната степен на инхибиране на туморното натоварване е 45%.Други тествани екстракти от червен женшен не показват толкова значителни промени в туморното натоварване (P > 0,05).Не са наблюдавани очевидни странични ефекти при миши модел по време на 20 седмици лечение с червен женшен, включително липса на промяна в телесното тегло (данните не са показани) и липса на чернодробна или бъбречна токсичност (Фигура 1E,F).
Екстрактът от червен женшен лекува развитието на белодробен тумор при A/J мишки.(A) Експериментален дизайн.(B) Големи белодробни тумори в миши модел.Туморите са обозначени със стрелки.a: Група китайски червен женшен.b: група А на корейски червен женшен.c: корейски червен женшен група B. d: корейски червен женшен група C. d: контролна група.(C) Светлинна микроснимка, показваща белодробен тумор.Увеличение: 100. b: 400. (D) Туморно натоварване в групата с екстракт от червен женшен.(E) Плазмени нива на чернодробния ензим ALT.(F) Плазмени нива на бъбречния ензим Cr.Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение.*P <0,05.
Екстрактите от червен женшен, идентифицирани в това проучване, са анализирани чрез ултра-ефективна течна хроматография тандемна масспектрометрия (UPLC-MS/MS) за количествено определяне на следните гинзенозиди: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5.Условията UPLC и MS, използвани за измерване на аналитите, са описани в предишен доклад19.UPLC-MS/MS хроматограми на четири екстракта от червен женшен са показани на Фигура 2А.Има значителни разлики в общото съдържание на гинзенозид, с най-високо общо съдържание на гинзенозид в CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Фигура 2B).При оценката на отделните гинзенозиди (Фигура 2C), KRGB показа най-високото ниво на G-Rg3 в сравнение с други гинзенозиди (58,33 ± 3,81 μmol/L за G-Rg3s и 41,56 ± 2,88 μmol/L за G -Rg3r).L).тип червен женшен (P <0.001).G-Rg3 се среща като двойка стереоизомери G-Rg3r и G-Rg3s, които се различават в позицията на хидроксилната група при въглерод 20 (фиг. 2D).Резултатите показват, че G-Rg3r или G-Rg3 могат да имат важен противораков потенциал в B(a)P-индуциран миши модел на рак.
Съдържание на гинзенозиди в различни екстракти от червен женшен.(A) UPLC-MS/MS хроматограми на четири екстракта от червен женшен.(B) Оценка на общото съдържание на гинзенозид в посочените екстракти.(C) Откриване на отделни гинзенозиди в етикетирани екстракти.(D) Структури на гинзенозидни стереоизомери G-Rg3r и G-Rg3s.Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение от трикратни определяния.***P <0,001.
Изследването UPLC-MS/MS изисква количествено определяне на гинзенозиди в чревни и кръвни проби след 20 седмици лечение.Лечението с KRGB показва наличието само на 0.0063 ± 0.0005 μg/ml Rg5 в кръвта.Не са открити останали гинзенозиди, което показва лоша орална бионаличност и следователно намалена експозиция на тези гинзенозиди.
Клетъчната линия Caco-2 на аденокарцином на дебелото черво е морфологично и биохимично подобна на човешките чревни епителни клетки, демонстрирайки нейната полезност при оценката на ентероцитния транспорт през чревната епителна бариера.Този анализ се основава на по-ранно проучване 20 .Фигури 3A, B, C, D, E, F показват представителни изображения на трансцелуларен транспорт на G-Rg3r и G-Rg3, използвайки Caco-2 монослоен модел.Трансцелуларният транспорт на G-Rg3r или G-Rg3 през Caco-2 монослоеве от базолатералната към апикалната страна (Pb-a) е значително по-висок, отколкото от апикалната към базолатералната страна (Pa-b).За G-Rg3r средната стойност на Pa-b е 0,38 ± 0,06, която се повишава до 0,73 ± 0,06 след лечение с 50 μmol/L верапамил и до 1,14 ± 0,09 след лечение със 100 μmol/L верапамил (p <0,01 и 0,001, съответно; Фигура 2).3А).Наблюденията за G-Rg3 следват подобен модел (фиг. 3B) и резултатите показват, че лечението с верапамил подобрява транспорта на G-Rg3r и G-Rg3.Лечението с верапамил също така води до значително намаляване на средните съотношения на ефлукс на Pb-a и G-Rg3r и G-Rg3s (Фигура 3C, D, E, F), което показва, че лечението с верапамил намалява съдържанието на гинзенозид в ефлуксните клетки на Caco-2..
Трансцелуларен транспорт на G-Rg3 в Caco-2 монослоеве и чревна абсорбция в анализ на перфузия на плъх.(A) Pa-b стойност на G-Rg3r група в Caco-2 монослой.(B) Pa-b стойност на G-Rg3s групи в Caco-2 монослой.(C) Pb стойност на G-Rg3r група в Caco-2 монослой.(D) Pb стойност на G-Rg3s групи в Caco-2 монослой.(E) Коефициент на добив на G-Rg3r групи в Caco-2 монослой.(F) Коефициент на добив на G-Rg3 групи в Caco-2 монослой.(G) Процент на чревна абсорбция на G-Rg3r при анализ на перфузия при плъхове.(H) Процент на чревна абсорбция на G-Rg3 при анализ на перфузия при плъхове.Пропускливостта и абсорбцията са сравнени без добавяне на верапамил.Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение от пет независими експеримента.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
В съответствие с по-ранна работа20, беше извършена ортотопична чревна перфузия на плъхове, за да се определи дали абсорбцията на G-Rg3 в червата се увеличава след лечение с верапамил.Фигури 3G,H показват представителни анализи на перфузия за оценка на процента на чревна абсорбция на G-Rg3r и G-Rg3 при плъхове модел на рак по време на горните периоди от време.Първоначалният процент на слабо усвояване на G-Rg3r от приблизително 10% се повишава до повече от 20% след лечение с 50 μM верапамил и до повече от 25% след лечение със 100 μM верапамил.По същия начин, G-Rg3, който има първоначално усвояване от 10%, също показва пик от над 20% след лечение с 50 μM верапамил и почти 30% след лечение със 100 μM верапамил, което предполага, че инхибирането на P-gp от верапамил повишава чревна G-абсорбция Rg3 в миши модел на рак на белия дроб.
Съгласно горния метод, B(a)P-индуцирани ракови моделни мишки бяха разделени на случаен принцип в шест групи, както е показано на Фигура 4А.Не са наблюдавани значителна загуба на тегло или клинични признаци на токсичност в групата на лечение с G-Rg3 в сравнение с контролната група (данните не са показани).След 20 седмици лечение, белите дробове на всяка мишка бяха събрани.Фигура 4В показва макроскопични белодробни тумори при мишки в горните групи за лечение, а Фигура 4С показва представителна светлинна микроснимка на представителен тумор.По отношение на туморното натоварване във всяка група (фиг. 4D), стойностите за мишки, третирани с G-Rg3r и G-Rg3s, са съответно 0,75 ± 0,29 mm3 и 0,81 ± 0,30 mm3, докато стойностите за G мишки, третирани с с -Rg3s бяха съответно 1,63 ±0,40 mm3.контролни мишки (p <0.001), което показва, че лечението с G-Rg3 намалява туморното натоварване при мишки.Прилагането на верапамил допълнително засилва това намаление: стойностите при верапамил+ G-Rg3r мишки намаляват от 0,75 ± 0,29 mm3 до 0,33 ± 0,25 mm3 (p <0,01), а стойностите за верапамил+ от 0,81 ± 0,30 mm3 намаляват до 0,29 ± 0,21 mm3 при мишки, третирани с G. -Rg3s (р <0,05), което показва, че верапамил може да засили инхибиторния ефект на G-Rg3 върху туморогенезата.Туморното натоварване не показва значителни разлики между контролната група и групата на верапамил, групата на G-Rg3r и групата на G-Rg3s и групата на верапамил+G-Rg3r и групата на верапамил+G-Rg3s.Освен това не е имало значителна чернодробна или бъбречна токсичност, свързана с оценените лечения (Фигура 4E, F).
Туморна тежест след лечение с G-Rg3 и плазмени или чревни нива на G-Rg3r и G-Rg3 в посочените групи.(A) Експериментален дизайн.(B) Макроскопски тумори в миши модел.Туморите са обозначени със стрелки.а: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r в комбинация с верапамил.d: G-Rg3 в комбинация с верапамил.d: верапамил.e: контрол.(C) Оптична микроснимка на тумора при увеличение.Отговор: 100x.b: 400X.(D) Ефект от лечението с G-Rg3 + верапамил върху туморното натоварване при A/J мишки.(E) Плазмени нива на чернодробния ензим ALT.(F) Плазмени нива на бъбречния ензим Cr.(G) Плазмени нива на G-Rg3r или G-Rg3 от посочените групи.(H) Нива на G-Rg3r или G-Rg3s в червата на посочените групи.Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение от трикратни определяния.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Нивата на G-Rg3 в B(a)P-индуцирани ракови моделни мишки бяха оценени чрез UPLC-MS/MS след 20-седмичен период на лечение съгласно метода, описан в раздела Методи.Фигури 4G и H показват съответно плазмени и чревни нива на G-Rg3.Плазмените нива на G-Rg3r са 0,44 ± 0,32 μmol/L и се повишават до 1,17 ± 0,47 μmol/L при едновременно приложение на верапамил (p < 0,001), докато нивата на чревния G-Rg3r са 0,53 ± 0,08 µg/l.Когато се комбинира с верапамил, g се повишава до 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).За G-Rg3 резултатите следват подобен модел, което показва, че лечението с верапамил повишава оралната бионаличност на G-Rg3 при A/J мишки.
Анализът на клетъчната жизнеспособност беше използван за оценка на цитотоксичността на B(a)P и G-Rg3 върху hEL клетки.Цитотоксичността, индуцирана от B(a)P в hEL клетки, е показана на Фигура 5А, докато нетоксичните свойства на G-Rg3r и G-Rg3 са показани на Фигури 5А и 5В.5B, C. За да се оцени цитопротективният ефект на G-Rg3, B(a)P се прилага съвместно с различни концентрации на G-Rg3r или G-Rg3 в hEL клетки.Както е показано на Фигура 5D, G-Rg3r при концентрации от 5 μM, 10 μM и 20 μM възстановява жизнеспособността на клетките съответно до 58,3%, 79,3% и 77,3%.Подобни резултати могат да се видят и в групата G-Rg3s.Когато концентрациите на G-Rg3s бяха 5 µM, 10 µM и 20 µM, клетъчната жизнеспособност беше възстановена съответно до 58,3%, 72,7% и 76,7% (Фигура 5E).).Наличието на BPDE-DNA адукти се измерва с помощта на комплект ELISA.Нашите резултати показват, че нивата на BPDE-DNA адукт са повишени в групата, лекувана с B(a)P, в сравнение с контролната група, но в сравнение с G-Rg3 съвместно лечение, нивата на BPDE-DNA адукт в B(a)P групата B в третираната група нивата на ДНК адукт са значително намалени.Резултатите от лечението само с B(a)P са показани на Фигура 5F (1,87 ± 0,33 спрямо 3,77 ± 0,42 за G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 спрямо 3,77 ± 0,42 за G -Rg3s, p < 0,001).
Клетъчна жизнеспособност и образуване на BPDE-DNA адукт в hEL клетки, третирани с G-Rg3 и B(a)P.(A) Жизнеспособност на hEL клетки, третирани с B(a)P.(B) Жизнеспособност на hEL клетки, третирани с G-Rg3r.(C) Жизнеспособност на hEL клетки, третирани с G-Rg3.(D) Жизнеспособност на hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3r.(E) Жизнеспособност на hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3.(F) Нива на BPDE-DNA адукт в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3.Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение от трикратни определяния.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Експресията на GST ензим беше открита след съвместно лечение с 10 μM B(a)P и 10 μM G-Rg3r или G-Rg3s.Нашите резултати показват, че B(a)P потиска експресията на GST (59,7 ± 8,2% в групата G-Rg3r и 39 ± 4,5% в групата G-Rg3s), а B(a)P се свързва с G-Rg3r , или с G-Rg3r, или с G-Rg3r.Съвместното лечение с G-Rg3s възстанови експресията на GST.GST експресия (103.7 ± 15.5% в групата G-Rg3r и 110 ± 11.1% в групата G-Rg3s, p <0.05 и p <0.001, съответно, Фиг. 6A, B и C).GST активността беше оценена с помощта на комплект за анализ на активността.Нашите резултати показват, че групата на комбинирано лечение има по-висока активност на GST в сравнение с групата само на B(a)P (96,3 ± 6,6% спрямо 35,7 ± 7,8% в групата на G-Rg3r спрямо 92,3 ± 6,5 в групата на G-Rg3r ).% спрямо 35,7 ± 7,8% в групата с G-Rg3s, p < 0,001, Фигура 6D).
Експресия на GST и Nrf2 в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3.(A) Откриване на GST експресия чрез Western blotting.(B) Количествена експресия на GST в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3r.(C) Количествена експресия на GST в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3s.(D) GST активност в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3.(E) Откриване на Nrf2 експресия чрез Western blotting.(F) Количествена експресия на Nrf2 в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3r.(G) Количествена експресия на Nrf2 в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3s.Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение от трикратни определяния.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
За да се изяснят пътищата, включени в G-Rg3-медиираната супресия на B(a)P-индуцирана туморогенеза, експресията на Nrf2 беше оценена чрез Western blotting.Както е показано на фигури 6E, F, G, в сравнение с контролната група, само нивото на Nrf2 в групата на лечение с B(a)P е намалено;въпреки това, в сравнение с групата на лечение с B(a)P, нивата на B(a) Nrf2 в групата с PG-Rg3 са повишени (106 ± 9,5% за G-Rg3r спрямо 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% за G-Rg3r спрямо 41 ± 9,8% за G-Rg3s, p <0,01).
Ние потвърдихме превантивната роля на Nrf2 чрез потискане на експресията на Nrf2, използвайки специфична малка интерферираща РНК (siRNA).Нокдаунът на Nrf2 беше потвърден чрез Western blotting (фиг. 7A, B).Както е показано на фигури 7C,D, съвместното третиране на hEL клетки с B(a)P и G-Rg3 води до намаляване на броя на адуктите BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) в сравнение с лечението с B(a)P самостоятелно в контролната siRNA група.) G-Rg3r беше 4,13 ± 0,49, G-Rg3s беше 1,8 ± 0,32 и 4,1 ± 0,57, p <0,01).Въпреки това, инхибиторният ефект на G-Rg3 върху образуването на BPDE-DNA беше премахнат чрез нокдаун на Nrf2.В групата на siNrf2 няма значителна разлика в образуването на BPDE-DNA адукт между B(a)P и G-Rg3 съвместно лечение и само лечение с B(a)P (3,0 ± 0,21 за G-Rg3r срещу 3,56 ± 0,32 ).за G-Rg3r спрямо 3,6 за G-Rg3s срещу ±0,45 спрямо 4,0±0,37, p > 0,05).
Ефект на нокдаун на Nrf2 върху образуването на BPDE-DNA адукт в hEL клетки.(A) Нокдаунът на Nrf2 беше потвърден чрез Western blotting.(B) Количествено определяне на интензитета на Nrf2 лентата.(C) Ефект на нокдаун на Nrf2 върху нивата на BPDE-DNA адукт в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3r.(D) Ефект на нокдаун на Nrf2 върху нивата на BPDE-DNA адукт в hEL клетки, третирани с B(a)P и G-Rg3.Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение от трикратни определяния.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Това проучване оценява превантивните ефекти на различни екстракти от червен женшен върху миши модел на B(a)P-индуциран рак на белия дроб, а лечението с KRGB значително намалява туморната тежест.Като се има предвид, че G-Rg3 има най-високо съдържание в този екстракт от женшен, е проучена важната роля на този гинзенозид за инхибиране на туморогенезата.Както G-Rg3r, така и G-Rg3 (два епимера на G-Rg3) значително намаляват туморното натоварване в миши модел на B(a)P-индуциран рак.G-Rg3r и G-Rg3 упражняват противоракови ефекти чрез индуциране на апоптоза на туморни клетки21, инхибиране на туморния растеж22, спиране на клетъчния цикъл23 и повлияване на ангиогенезата24.Доказано е също, че G-Rg3 инхибира клетъчните метастази25 и способността на G-Rg3 да засилва ефектите от химиотерапията и лъчетерапията е документирана26,27.Poon et al показаха, че лечението с G-Rg3 може да намали генотоксичните ефекти на B(a)P28.Това проучване демонстрира терапевтичния потенциал на G-Rg3 за насочване към канцерогенни молекули в околната среда и предотвратяване на рак.
Въпреки техния добър профилактичен потенциал, лошата орална бионаличност на гинзенозидите представлява предизвикателство за клиничната употреба на тези молекули.Фармакокинетичният анализ на пероралното приложение на гинзенозиди при плъхове показва, че неговата бионаличност е все още под 5%29.Тези тестове показват, че след 20-седмичния период на лечение само кръвните нива на Rg5 намаляват.Въпреки че основният механизъм на лошата бионаличност остава да бъде изяснен, се смята, че P-gp участва в ефлукса на гинзенозидите.Тази работа демонстрира за първи път, че приложението на верапамил, блокер на P-gp, повишава оралната бионаличност на G-Rg3r и G-Rg3s.По този начин, това откритие предполага, че G-Rg3r и G-Rg3s действат като субстрати на P-gp за регулиране на неговия ефлукс.
Тази работа демонстрира, че комбинираното лечение с верапамил повишава оралната бионаличност на G-Rg3 в миши модел на рак на белия дроб.Това откритие се подкрепя от увеличения чревен трансцелуларен транспорт на G-Rg3 при блокада на P-gp, като по този начин се увеличава неговата абсорбция.Анализи в Caco2 клетки показват, че лечението с верапамил намалява ефлукса на G-Rg3r и G-Rg3s, като същевременно подобрява пропускливостта на мембраната.Проучване на Yang et al.Проучванията показват, че лечението с циклоспорин А (друг блокер на P-gp) повишава бионаличността на гинзенозид Rh2 от изходна стойност от 1%20 до повече от 30%.Гинзенозидните съединения K и Rg1 също показват подобни резултати30,31.Когато верапамил и циклоспорин А се прилагат едновременно, ефлуксът на съединение К в Caco-2 клетки е значително намален от 26,6 до по-малко от 3, докато неговите вътреклетъчни нива се увеличават 40 пъти30.В присъствието на верапамил нивата на Rg1 се повишават в епителните клетки на белите дробове на плъх, което предполага роля на P-gp в ефлукса на гинзенозид, както е показано от Meng et al.31.Въпреки това, верапамил няма същия ефект върху ефлукса на някои гинзенозиди (като Rg1, F1, Rh1 и Re), което показва, че те не се влияят от P-gp субстрати, както е показано от Liang et al.32 .Това наблюдение може да е свързано с участието на други транспортери и алтернативни гинзенозидни структури.
Механизмът на превантивния ефект на G-Rg3 върху рака е неясен.Предишни проучвания показват, че G-Rg3 предотвратява увреждането на ДНК и апоптозата чрез намаляване на оксидативния стрес и възпалението 16, 33, което може да бъде основният механизъм за предотвратяване на B(a)P-индуцирана туморогенеза.Някои доклади показват, че генотоксичността, предизвикана от B(a)P, може да бъде намалена чрез модулиране на фаза II ензими за образуване на BPDE-DNA34.GST е типичен фаза II ензим, който инхибира образуването на BPDE-DNA адукт чрез насърчаване на свързването на GSH с BPDE, като по този начин намалява увреждането на ДНК, предизвикано от B(a)P35.Нашите резултати показват, че лечението с G-Rg3 намалява B(a)P-индуцираната цитотоксичност и образуването на BPDE-DNA адукт в hEL клетки и възстановява GST експресията и активността in vitro.Тези ефекти обаче липсват в отсъствието на Nrf2, което предполага, че G-Rg3 индуцира цитопротективни ефекти чрез пътя на Nrf2.Nrf2 е основен транскрипционен фактор за фаза II детоксикационни ензими, който насърчава клирънса на ксенобиотиците36.Активирането на пътя на Nrf2 индуцира цитопротекция и намалява увреждането на тъканите37.Освен това, няколко доклада подкрепят ролята на Nrf2 като туморен супресор в канцерогенезата38.Нашето проучване показва, че индуцирането на пътя на Nrf2 от G-Rg3 играе важна регулаторна роля в B(a)P-индуцираната генотоксичност, като причинява детоксикация на B(a)P чрез активиране на фаза II ензими, като по този начин инхибира процеса на туморогенеза.
Нашата работа разкрива потенциала на червения женшен за предотвратяване на B(a)P-индуциран рак на белия дроб при мишки чрез важното участие на гинзенозид G-Rg3.Слабата орална бионаличност на тази молекула възпрепятства нейното клинично приложение.Въпреки това, това проучване показва за първи път, че G-Rg3 е субстрат на P-gp и прилагането на инхибитор на P-gp повишава бионаличността на G-Rg3 in vitro и in vivo.G-Rg3 намалява B(a)P-индуцираната цитотоксичност чрез регулиране на Nrf2 пътя, което може да бъде потенциален механизъм за неговата превантивна функция.Нашето проучване потвърждава потенциала на гинзенозид G-Rg3 за превенция и лечение на рак на белия дроб.
Шестседмични женски A/J мишки (20 ± 1 g) и 7-седмични мъжки плъхове Wistar (250 ± 20 g) бяха получени от The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) и Wuhan Institute of Zoology.Университет (Ухан, Китай).Китайският център за събиране на типови култури (Ухан, Китай) ни предостави Caco-2 и hEL клетки.Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, САЩ) е източник на B(a)P и трикаприн.Пречистени гинзенозиди G-Rg3r и G-Rg3s, диметилсулфоксид (DMSO), комплект за анализ на пролиферация CellTiter-96 (MTS), верапамил, минимална есенциална среда (MEM) и фетален говежди серум (FBS) бяха закупени от Chengdu Must Bio-Technology .ООД.(Чънду, Китай).Мини комплектът QIAamp DNA и комплектът ELISA за адукт на BPDE-DNA бяха закупени от Qiagen (Станфорд, Калифорния, САЩ) и Cell Biolabs (Сан Диего, Калифорния, САЩ).Комплект за анализ на GST активност и комплект за анализ на общ протеин (стандартен BCA метод) бяха закупени от Solarbio (Пекин, Китай).Всички екстракти от червен женшен се съхраняват в Mingyu Laboratory 7. Хонконгският баптистки университет (Хонконг, Китай) и Корейският раков център (Сеул, Корея) са търговски източници на екстракт от CRG и различни екстракти от червен женшен с различен корейски произход (включително KRGA, KRGB и KRGC).Червеният женшен се прави от корените на 6-годишен пресен женшен.Екстрактът от червен женшен се получава чрез измиване на женшен с вода три пъти, след това концентриране на водния екстракт и накрая изсушаване при ниска температура, за да се получи екстракт от женшен на прах.Антитела (анти-Nrf2, анти-GST и β-актин), конюгиран с пероксидаза от хрян анти-заешки имуноглобулин G (IgG), реагент за трансфекция, контролна siRNA и Nrf2 siRNA бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), САЩ).
Клетките Caco2 и hEL се култивират в 100 mm2 блюда за клетъчни култури с MEM, съдържащ 10% FBS при 37 °C във влажна атмосфера от 5% CO2.За да се определи ефектът от условията на лечение, hEL клетките се инкубират с различни концентрации на B (a) P и G-Rg3 в MEM за 48 часа.Клетките могат да бъдат допълнително анализирани или събрани за приготвяне на безклетъчни екстракти.
Всички експерименти бяха одобрени от Комитета по етика на експерименталните животни към Медицинския колеж Tongji, Университета за наука и технологии Huazhong (Одобрение № 2019; Регистрационен № 4587TH).Всички експерименти са извършени в съответствие със съответните насоки и разпоредби и изследването е проведено в съответствие с насоките за изследване на животни: Докладване на експерименти in vivo (ARRIVE).Осемседмични A/J мишки първо бяха инжектирани интраперитонеално с B(a)P в разтвор на трикаприн (100 mg/kg, 0.2 ml).След една седмица мишките бяха разделени на случаен принцип в контролни групи и различни групи за лечение, по 15 мишки във всяка група и им се дава сонда веднъж на ден.След 20 седмици лечение, животните бяха умъртвени чрез CO2 асфиксия.Белите дробове бяха събрани и фиксирани за 24 часа.Броят на повърхностните тумори и индивидуалните размери на тумора се определят количествено за всеки бял дроб под дисекционен микроскоп.Оценките на обема на тумора (V) се изчисляват с помощта на следния израз: V (mm3) = 4/3πr3, където r е диаметърът на тумора.Нетната сума от всички обеми на тумора в белите дробове на мишки представлява общия обем на тумора, а средният общ обем на тумора във всяка група представлява натоварването на тумора.Цяла кръв и чревни проби се събират и съхраняват при -80°C за UPLC-MS/MS определяне.Беше събран серум и беше използван автоматизиран химичен анализатор за анализиране на нивата на аланин аминотрансфераза (ALT) и серумен креатинин (Cr) за оценка на чернодробната и бъбречната функция.
Събраните проби бяха извадени от хладилния склад, размразени, претеглени и поставени в епруветки, както е описано по-горе.Към това се добавя 0.5 μM флоризин (вътрешен стандарт) в 0.8 ml метанолов разтвор.След това тъканта се хомогенизира с помощта на Tissue-Tearor и хомогенатът след това се прехвърля в 1,5 ml микроцентрофужна епруветка.Сместа се центрофугира при 15500 rpm за 15 минути.След отстраняване на 1,0 ml от супернатанта се изсушава с азот.Двеста микролитра метанол бяха използвани за възстановяване.Кръвта се събира и обработва на една линия и се използва като еталон за всички измервания.
24-ямкови Transwell плаки се посяват с 1.0 × 105 Caco-2 клетки на ямка, за да се оцени потенциалното усилване на транспорта на G-Rg3 чрез добавяне на верапамил.След 3 седмици култивиране, клетките се промиват с HBSS и се инкубират предварително при 37°С.400 μL от 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s или смес с 50 или 100 μM верапамил) се инжектират върху базолатералната или апикалната страна на монослоя и 600 μL разтвор на HBSS се добавят към другия страна.Съберете 100 µl културална среда в определените моменти (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути) и добавете 100 µl HBSS, за да допълните този обем.Пробите се съхраняват при -4 °C до откриване чрез UPLC-MS/MS.Изразът Papp = dQ/(dT × A × C0) се използва за количествено определяне на видимата еднопосочна апикална и базолатерална пропускливост и обратно (съответно Pa-b и Pb-a);dQ/dT е промяната в концентрацията, A (0,6 cm2) е повърхностната площ на монослоя, а C0 е първоначалната концентрация на донор.Коефициентът на изтичане се изчислява като Pb-a/Pa-b, което представлява скоростта на изтичане на изследваното лекарство.
Мъжки плъхове Wistar са били гладни в продължение на 24 часа, пиели са само вода и са били анестезирани с интравенозна инжекция от 3,5% разтвор на пентобарбитал.Интубираната силиконова тръба има края на дванадесетопръстника като вход и края на илеума като изход.Използвайте перисталтична помпа, за да изпомпвате входа с 10 µM G-Rg3r или G-Rg3s в изотоничен HBSS при скорост на потока от 0,1 ml/min.Ефектът на верапамил се оценява чрез добавяне на 50 μM или 100 μM от съединението към 10 μM G-Rg3r или G-Rg3s.UPLC-MS/MS се извършва върху перфузионни екстракти, събрани във времеви точки 60, 90, 120 и 150 минути след началото на перфузията.Процентът на абсорбция се определя количествено по формулата % абсорбция = (1 – Cout/Cin) × 100%;концентрацията на G-Rg3 на изхода и входа се изразява съответно с Cout и Cin.
hEL клетките се посяват в 96-ямкови плаки при плътност от 1 × 104 клетки на ямка и се третират с B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) или G-Rg3, разтворен в DMSO .След това лекарствата се разреждат с културална среда до различни концентрации (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) в продължение на 48 часа.Като се използва наличен в търговската мрежа комплект за анализ на MTS, клетките се подлагат на стандартен протокол и след това се измерват с помощта на четец на микроплаки при 490 nm.Нивото на клетъчна жизнеспособност на групите, третирани съвместно с B(a)P (10 μM) и G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) се оценява съгласно горния метод и се сравнява с нетретираната група.
hEL клетките се посяват в 6-ямкови плаки при плътност от 1 × 105 клетки/ямка и се третират с 10 μMB(a)P в присъствието или отсъствието на 10 μM G-Rg3.След 48 часа третиране, ДНК се екстрахира от hEL клетки с помощта на QIAamp DNA Mini Kit съгласно протокола на производителя.Образуването на BPDE-DNA адукти се открива с помощта на BPDE-DNA адукт ELISA комплект.Относителните нива на BPDE-DNA адукт се измерват с помощта на четец на микроплаки чрез измерване на абсорбцията при 450 nm.
hEL клетките се посяват в 96-ямкови плаки при плътност от 1 × 104 клетки на ямка и се третират с 10 μMB (a) P в отсъствие или присъствие на 10 μM G-Rg3 за 48 часа.GST активността се измерва с помощта на търговски комплект за анализ на GST активност съгласно протокола на производителя.Относителното GST активиране се измерва чрез абсорбция при 450 nm, като се използва четец на микроплаки.
hEL клетките се промиват с ледено студен PBS и след това се лизират с помощта на буфер за радиоимунопреципитационен анализ, съдържащ протеазни инхибитори и фосфатазни инхибитори.След количествено определяне на протеин с помощта на комплект за общ протеинов анализ, 30 μg протеин във всяка проба се отделят с 12% SDS-PAGE и се прехвърлят към PVDF мембрана чрез електрофореза.Мембраните се блокират с 5% обезмаслено мляко и се инкубират с първични антитела за една нощ при 4°C.След инкубиране с вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян, бяха добавени усилени хемилуминесцентни реагенти за визуализиране на сигнала за свързване.Интензитетът на всяка протеинова лента се определя количествено с помощта на софтуера ImageJ.
Софтуерът GraphPad Prism 7.0 беше използван за анализ на всички данни, изразени като средно ± стандартно отклонение.Вариацията между групите на лечение беше оценена с помощта на t тест на Student или еднопосочен анализ на дисперсията, с P стойност <0,05, показваща статистическа значимост.
Всички данни, получени или анализирани по време на това проучване, са включени в тази публикувана статия и файлове с допълнителна информация.
Torre, LA, Siegel, RL и Jemal, A. Статистика за рака на белия дроб.наречие.Просрочен.лекарство.биология.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Тютюневи канцерогени, техните биомаркери и рак, предизвикан от тютюн.Нац.Раков свещеник.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH и Venitt, S. ДНК и протеинови адукти в човешки тъкани в резултат на излагане на тютюнев дим.интернационалност.J. Рак.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA и Yu M. Ефект на Houttuynia cordata и силибинин върху индуцирана от бензо(а)пирен белодробна туморогенеза при A/J мишки.Рак 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Противораков естествен продукт, изолиран от китайски медицински материали.челюст.лекарство.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Ефикасност на полифенон Е, червен женшен и рапамицин върху индуцирана от бензо (а) пирен белодробна туморогенеза при A/J мишки.Рак 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS и Yuan, KS Red, участие в лечението на рак.челюст.J. Nutt.лекарство.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS и Gao, L. Ginsenosides в корените и листата на американския женшен.J. Agric.Химия на храните.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA и Yuan KS Фармакология на женшен: много компоненти и много ефекти.биохимия.фармакология.58, 1685–1693 (1999).
Време на публикуване: 17 септември 2023 г