Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje rezultate preporučujemo upotrebu novije verzije vašeg pretraživača (ili isključivanje načina kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stila ili JavaScripta.
Crveni ginseng se u tradicionalnoj azijskoj medicini koristi stotinama godina.U ovoj studiji procijenili smo sposobnost četiri vrste crvenog ginsenga (kineski crveni ginseng, korejski crveni ginseng A, korejski crveni ginseng B i korejski crveni ginseng C) uzgojenih u različitim regijama da inhibiraju stvaranje i rast pluća uzrokovanih kancerogenom. tumori.Test benzo(a)pirena (B(a)P) sproveden je na A/J miševima, a ustanovljeno je da je korejski crveni ginseng B najefikasniji u smanjenju tumorskog opterećenja među četiri vrste crvenog ginsenga.Osim toga, analizirali smo sadržaj različitih ginsenozida (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5) u četiri ekstrakta crvenog ginsenga i utvrdili da korejski crveni ginseng B ima najviše visoke razine ginsenozida Rg3 (G-Rg3), što sugerira da G-Rg3 može igrati važnu ulogu u njegovoj terapijskoj efikasnosti.Ovaj rad pokazuje da G-Rg3 ima relativno nisku bioraspoloživost.Međutim, kada je G-Rg3 istovremeno primijenjen s P-gp inhibitorom verapamilom, efluks G-Rg3 u Caco-2 ćelije je smanjen, brzina crijevne apsorpcije G-Rg3 je povećana na modelu štakora, a G-Rg3 je povećana.U Caco-2 ćelijama se smanjuje odliv Rg3, a nivo koncentracije Rg3 opada.G-Rg3 je povećan u crijevima i plazmi, a njegova sposobnost da spriječi tumore je također poboljšana u modelu B(a)P-indukovane tumorigeneze kod štakora.Također smo otkrili da G-Rg3 smanjuje B(a)P-indukovanu citotoksičnost i formiranje adukta DNK u ljudskim plućnim stanicama, te obnavlja ekspresiju i aktivnost enzima faze II putem Nrf2 puta, što može biti povezano s potencijalnim mehanizmom djelovanja. G inhibicije -Rg3..O pojavi tumora pluća.Naša studija pokazuje potencijalno važnu ulogu G-Rg3 u ciljanju tumora pluća na mišjim modelima.Oralna bioraspoloživost ovog ginsenozida je poboljšana ciljanjem P-glikoproteina, omogućavajući molekulu da ispoljava antikancerogene efekte.
Najčešći tip raka pluća je karcinom pluća ne-malih ćelija (NSCLC), koji je jedan od vodećih uzroka smrti od raka u Kini i Sjevernoj Americi1,2.Glavni faktor koji povećava rizik od razvoja ne-malih ćelija raka pluća je pušenje.Dim cigarete sadrži više od 60 kancerogenih tvari, uključujući benzo(a)piren (B(a)P), nitrozamine i radioaktivne izotope od raspada radona.3 Policiklički aromatični ugljovodonici B(a)P glavni su uzrok toksičnosti u cigaretama dim.Nakon izlaganja B(a)P, citokrom P450 ga pretvara u B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid (BPDE), koji reaguje sa DNK i formira BPDE-DNK adukt 4. Osim toga, ovi adukti induciraju tumorigenezu pluća kod miševa sa tumorskim stadijem i histopatologijom sličnim tumorima pluća kod ljudi5.Ova karakteristika čini B(a)P-induciran model karcinoma pluća prikladnim sistemom za procjenu jedinjenja sa mogućim antikancerogenim svojstvima.
Jedna od mogućih strategija za prevenciju razvoja karcinoma pluća u grupama visokog rizika, posebno kod pušača, je primjena kemopreventivnih sredstava za suzbijanje razvoja intraepitelnih neoplastičnih lezija i na taj način spriječiti njihovu kasniju progresiju u malignitet.Studije na životinjama pokazuju da su različita hemopreventivna sredstva efikasna6.Naš prethodni izvještaj7 istakao je dobre preventivne efekte crvenog ginsenga na rak pluća.Ova biljka se vekovima koristila u tradicionalnoj azijskoj medicini za produženje života i zdravlja, a dokumentovano je da ima antitumorsko dejstvo8.
Aktivni faktor ginsenga je ginsenozid, koji se koristi kao kompozitni marker za procjenu kvaliteta ekstrakata ginsenga.Kvantitativna analiza sirovih ekstrakata ginsenga obično uključuje upotrebu nekoliko ginsenozida, uključujući RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 i Rc9,10.Ginsenozidi imaju malu kliničku primjenu zbog njihove vrlo slabe oralne bioraspoloživosti11.Iako mehanizam za ovu slabu biodostupnost nije jasan, uzrok može biti efluks ginsenozida uzrokovan P-glikoproteinom (P-gp)12.P-gp je jedan od najvažnijih transportera efluksa u superfamiliji transportera kaseta koji se vezuju za ATP, koji koristi energiju hidrolize ATP-a za oslobađanje intracelularnih supstanci u vanjsko okruženje.P-gp transporteri su obično široko rasprostranjeni u crijevima, bubrezima, jetri i krvno-moždanoj barijeri13.P-gp igra ključnu ulogu u crijevnoj apsorpciji, a inhibicija P-gp povećava oralnu apsorpciju i dostupnost nekih lijekova protiv raka12,14.Primjeri inhibitora koji su ranije korišteni u literaturi su verapamil i ciklosporin A15.Ovaj rad uključuje uspostavljanje mišjeg sistema za proučavanje B(a)P-indukovanog karcinoma pluća kako bi se procijenila sposobnost različitih ekstrakata crvenog ginsenga iz Kine i Koreje da utiču na maligne bolesti.Ekstrakti su pojedinačno analizirani kako bi se identificirali specifični ginsenozidi koji mogu utjecati na kancerogenezu.Verapamil je zatim korišten za ciljanje P-gp i poboljšanje oralne bioraspoloživosti i terapijske efikasnosti ginsenozida koji ciljaju na rak.
Mehanizam kojim saponini ginsenga vrše terapeutske efekte na karcinogenezu ostaje nejasan.Istraživanja su pokazala da različiti ginsenozidi mogu smanjiti oštećenje DNK uzrokovano kancerogenima smanjenjem oksidativnog stresa i aktiviranjem enzima za detoksikaciju faze II, čime se sprječava oštećenje stanica.Glutation S-transferaza (GST) je tipičan enzim faze II koji je neophodan za smanjenje oštećenja DNK uzrokovanih kancerogenima17.Faktor 2 povezan s nuklearnim eritroidom 2 (Nrf2) je važan faktor transkripcije koji regulira redoks homeostazu i aktivira ekspresiju enzima faze II i citoprotektivne antioksidativne odgovore18.Naša studija je takođe ispitala efekte identifikovanih ginsenozida na smanjenje citotoksičnosti izazvane B(a)P i formiranje adukta BPDE-DNK, kao i indukciju enzima faze II modulacijom Nrf2 puta u normalnim ćelijama pluća.
Uspostavljanje mišjeg modela B(a)P-indukovanog karcinoma u skladu je s prethodnim radom5.Slika 1A prikazuje eksperimentalni dizajn 20-tjednog tretmana modela raka miša izazvanog B(a)P, vodom (kontrola), ekstraktom kineskog crvenog ginsenga (CRG), ekstraktom korejskog crvenog ginsenga A (KRGA) i korejskim crvenim ginseng.Ekstrakt B (KRGB) i ekstrakt korejskog crvenog ginsenga C (KRGC).Nakon 20 sedmica tretmana crvenim ginsengom, miševi su žrtvovani gušenjem CO2.Slika 1B prikazuje makroskopske tumore pluća kod životinja tretiranih različitim vrstama crvenog ginsenga, a slika 1C prikazuje reprezentativni svjetlosni mikrograf uzorka tumora.Opterećenje tumorom životinja tretiranih KRGB-om (1,5 ± 0,35) bilo je niže nego kod kontrolnih životinja (0,82 ± 0,2, P < 0,05), kao što je prikazano na slici 1D.Prosječan stepen inhibicije opterećenja tumorom bio je 45%.Drugi testirani ekstrakti crvenog ginsenga nisu pokazali tako značajne promjene u opterećenju tumorom (P > 0,05).Nisu uočene očigledne nuspojave na mišjem modelu tokom 20 sedmica liječenja crvenim ginsengom, uključujući promjenu tjelesne težine (podaci nisu prikazani) i toksičnost za jetru ili bubrege (Slika 1E,F).
Ekstrakt crvenog ginsenga liječi razvoj tumora pluća kod A/J miševa.(A) Eksperimentalni dizajn.(B) Veliki tumori pluća na mišjem modelu.Tumori su označeni strelicama.a: Kineski crveni ginseng grupa.b: grupa A korejskog crvenog ginsenga.c: Korejski crveni ginseng grupa B. d: Korejski crveni ginseng grupa C. d: Kontrolna grupa.(C) Svetlosni mikrosnimak koji pokazuje tumor pluća.Uvećanje: 100. b: 400. (D) Opterećenje tumorom u grupi ekstrakta crvenog ginsenga.(E) Nivoi jetrenog enzima ALT u plazmi.(F) Nivoi bubrežnog enzima u plazmi Cr.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.*P <0,05.
Ekstrakti crvenog ginsenga identificirani u ovoj studiji analizirani su tandem masenom spektrometrijom ultraučinkovite tečne hromatografije (UPLC-MS/MS) kako bi se kvantifikovali sljedeći ginsenozidi: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5.Uslovi UPLC i MS korišteni za mjerenje analita opisani su u prethodnom izvještaju19.UPLC-MS/MS hromatogrami četiri ekstrakta crvenog ginsenga prikazani su na slici 2A.Postojale su značajne razlike u sadržaju ukupnog ginsenozida, s najvećim ukupnim sadržajem ginsenozida u CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Slika 2B).Prilikom procjene pojedinačnih ginsenozida (slika 2C), KRGB je pokazao najviši nivo G-Rg3 u poređenju sa drugim ginsenozidima (58,33 ± 3,81 μmol/L za G-Rg3s i 41,56 ± 2,88 μmol/L za G-Rg3r).L).tip crvenog ginsenga (P < 0,001).G-Rg3 se javlja kao par stereoizomera G-Rg3r i G-Rg3s, koji se razlikuju po položaju hidroksilne grupe na ugljeniku 20 (slika 2D).Rezultati pokazuju da G-Rg3r ili G-Rg3 mogu imati važan antikancerogeni potencijal u B(a)P-induciranom modelu raka miša.
Sadržaj ginsenozida u raznim ekstraktima crvenog ginsenga.(A) UPLC-MS/MS hromatogrami četiri ekstrakta crvenog ginsenga.(B) Procjena ukupnog sadržaja ginsenozida u navedenim ekstraktima.(C) Detekcija pojedinačnih ginsenozida u označenim ekstraktima.(D) Strukture stereoizomera ginsenozida G-Rg3r i G-Rg3s.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.***P <0,001.
UPLC-MS/MS studija zahtijevala je kvantifikaciju ginsenozida u uzorcima crijeva i krvi nakon 20 sedmica liječenja.Tretman KRGB-om pokazao je prisustvo samo 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 u krvi.Nisu otkriveni preostali ginsenozidi, što ukazuje na slabu oralnu bioraspoloživost i stoga smanjenu izloženost ovim ginsenozidima.
Ćelijska linija adenokarcinoma debelog crijeva Caco-2 je morfološki i biokemijski slična epitelnim stanicama crijeva čovjeka, što pokazuje svoju korisnost u procjeni transporta enterocita kroz crijevnu epitelnu barijeru.Ova analiza je zasnovana na ranijoj studiji 20 .Slike 3A,B,C,D,E,F prikazuju reprezentativne slike transcelularnog transporta G-Rg3r i G-Rg3 koristeći Caco-2 monoslojni model.Transcelularni transport G-Rg3r ili G-Rg3 preko Caco-2 monoslojeva od bazolateralne do apikalne strane (Pb-a) bio je značajno veći nego sa apikalne na bazolateralnu stranu (Pa-b).Za G-Rg3r, srednja vrijednost Pa-b bila je 0,38 ± 0,06, koja se povećala na 0,73 ± 0,06 nakon tretmana sa 50 μmol/L verapamila i na 1,14 ± 0,09 nakon tretmana sa 100 μmol/L verapamila (p < 0,01, 0,01 odnosno slika 2);3A).Opservacije za G-Rg3 su pratile sličan obrazac (slika 3B), a rezultati su pokazali da tretman verapamilom poboljšava transport G-Rg3r i G-Rg3.Tretman verapamilom je također rezultirao značajnim smanjenjem srednjih omjera efluksa Pb-a i G-Rg3r i G-Rg3s (Slika 3C,D,E,F), što ukazuje da liječenje verapamilom smanjuje sadržaj ginsenozida u Caco-2 efluksnim stanicama..
Transcelularni transport G-Rg3 u monoslojevima Caco-2 i intestinalna apsorpcija u testu perfuzije štakora.(A) Pa-b vrijednost G-Rg3r grupe u Caco-2 monosloju.(B) Pa-b vrijednost G-Rg3s grupa u Caco-2 monosloju.(C) Pb vrijednost G-Rg3r grupe u Caco-2 monosloju.(D) Pb vrijednost G-Rg3s grupa u Caco-2 monosloju.(E) Odnos prinosa G-Rg3r grupa u Caco-2 monosloju.(F) Odnos prinosa G-Rg3 grupa u Caco-2 monosloju.(G) Procenat intestinalne apsorpcije G-Rg3r u testu perfuzije kod pacova.(H) Procenat intestinalne apsorpcije G-Rg3 u testu perfuzije kod pacova.Permeabilnost i apsorpcija su upoređivani bez dodatka verapamila.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija pet nezavisnih eksperimenata.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
U skladu s ranijim radom20, ortotopska intestinalna perfuzija pacova je izvršena kako bi se utvrdilo da li se apsorpcija G-Rg3 u crijevima povećava nakon tretmana verapamilom.Slike 3G,H prikazuju reprezentativne testove perfuzije za procjenu procenta intestinalne apsorpcije G-Rg3r i G-Rg3 kod pacova modela raka tokom gore navedenih vremenskih perioda.Početni procenat slabog unosa G-Rg3r od približno 10% povećao se na više od 20% nakon tretmana sa 50 μM verapamila i na više od 25% nakon tretmana sa 100 μM verapamila.Isto tako, G-Rg3, koji je imao početnu apsorpciju od 10%, također je pokazao vrhunac od preko 20% nakon tretmana sa 50 μM verapamila i skoro 30% nakon tretmana sa 100 μM verapamila, što sugerira da inhibicija P-gp od strane verapamila povećava crijevna G-apsorpcija Rg3 u mišjem modelu raka pluća.
Prema gornjoj metodi, B(a)P-inducirani model miševi su nasumično podijeljeni u šest grupa, kao što je prikazano na slici 4A.Nije uočen značajan gubitak težine ili klinički znaci toksičnosti u grupi koja je tretirana G-Rg3 u poređenju sa kontrolnom grupom (podaci nisu prikazani).Nakon 20 sedmica tretmana, sakupljena su pluća svakog miša.Slika 4B prikazuje makroskopske tumore pluća kod miševa u gornjim tretiranim grupama, a slika 4C prikazuje reprezentativnu svjetlosnu mikrografiju reprezentativnog tumora.Što se tiče opterećenja tumorom u svakoj grupi (slika 4D), vrijednosti za miševe tretirane G-Rg3r i G-Rg3s su bile 0,75 ± 0,29 mm3 i 0,81 ± 0,30 mm3, respektivno, dok su vrijednosti za G miševe tretirane sa -Rg3s su 1,63 odnosno ±0,40 mm3.kontrolni miševi (p < 0,001), što ukazuje da tretman G-Rg3 smanjuje opterećenje tumorom kod miševa.Primjena verapamila dodatno je pojačala ovo smanjenje: vrijednosti kod verapamil+ G-Rg3r miševa su se smanjile sa 0,75 ± 0,29 mm3 na 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), a vrijednosti za verapamil+ sa 0,81 ± 0,30 mm3 ± 0,21 su smanjene na ± 0,29 mm3 (p < 0,01). mm3 kod miševa tretiranih G. -Rg3s (p < 0,05), što ukazuje da verapamil može pojačati inhibitorni efekat G-Rg3 na tumorigenezu.Opterećenje tumorom nije pokazalo značajne razlike između kontrolne grupe i verapamil grupe, grupe G-Rg3r i G-Rg3s grupe, te grupe verapamil+G-Rg3r i verapamil+G-Rg3s grupe.Štaviše, nije bilo značajnih toksičnosti za jetru ili bubrege povezane s evaluiranim tretmanima (Slika 4E,F).
Opterećenje tumorom nakon tretmana G-Rg3 i nivoi G-Rg3r i G-Rg3 u plazmi ili crijevima u naznačenim grupama.(A) Eksperimentalni dizajn.(B) Makroskopski tumori u modelu miša.Tumori su označeni strelicama.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r u kombinaciji sa verapamilom.d: G-Rg3 u kombinaciji sa verapamilom.d: Verapamil.e: kontrola.(C) Optički mikrosnimak tumora pri uvećanju.Odgovor: 100x.b: 400X.(D) Utjecaj tretmana G-Rg3 + verapamil na opterećenje tumorom kod A/J miševa.(E) Nivoi jetrenog enzima ALT u plazmi.(F) Nivoi bubrežnog enzima u plazmi Cr.(G) Nivoi G-Rg3r ili G-Rg3 u plazmi navedenih grupa.(H) Nivoi G-Rg3r ili G-Rg3s u crijevima navedenih grupa.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Nivoi G-Rg3 kod B(a)P-indukovanog modela karcinoma miševa su procijenjeni pomoću UPLC-MS/MS nakon 20-nedjeljnog perioda liječenja prema metodi opisanoj u odjeljku Metode.Slike 4G i H prikazuju nivoe G-Rg3 u plazmi i crevima, respektivno.Nivo G-Rg3r u plazmi bio je 0,44 ± 0,32 μmol/L i povećan na 1,17 ± 0,47 μmol/L uz istovremenu primjenu verapamila (p < 0,001), dok je intestinalni nivo G-Rg3r bio 0,53 ± µg/l.Kada se kombinuje sa verapamilom, g se povećao na 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Za G-Rg3, rezultati su pratili sličan obrazac, što ukazuje da je tretman verapamilom povećao oralnu bioraspoloživost G-Rg3 kod A/J miševa.
Test vitalnosti ćelija je korišten za procjenu citotoksičnosti B(a)P i G-Rg3 na hEL ćelijama.Citotoksičnost izazvana B(a)P u hEL ćelijama prikazana je na slici 5A, dok su netoksična svojstva G-Rg3r i G-Rg3 prikazana na slikama 5A i 5B.5B, C. Da bi se procenio citoprotektivni efekat G-Rg3, B(a)P je istovremeno davan sa različitim koncentracijama G-Rg3r ili G-Rg3 u hEL ćelije.Kao što je prikazano na slici 5D, G-Rg3r u koncentracijama od 5 μM, 10 μM i 20 μM vratio je vitalnost ćelije na 58,3%, 79,3% i 77,3%, respektivno.Slični rezultati se mogu vidjeti i u grupi G-Rg3s.Kada su koncentracije G-Rg3 bile 5 µM, 10 µM i 20 µM, vitalnost ćelija je vraćena na 58,3%, 72,7% i 76,7%, respektivno (Slika 5E).).Prisustvo BPDE-DNK adukata je mjereno korištenjem ELISA kompleta.Naši rezultati su pokazali da su nivoi adukta BPDE-DNK povećani u grupi tretiranoj B(a)P u poređenju sa kontrolnom grupom, ali u poređenju sa G-Rg3 zajedničkim tretmanom, nivoi adukta BPDE-DNK u B(a)P grupi B u tretiranoj grupi, nivoi adukta DNK su značajno smanjeni.Rezultati tretmana samo sa B(a)P prikazani su na slici 5F (1,87 ± 0,33 naspram 3,77 ± 0,42 za G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 naspram 3,77 ± 0,42 za G -Rg3s, p < 0,001).
Vijabilnost ćelije i formiranje adukta BPDE-DNK u hEL ćelijama tretiranim sa G-Rg3 i B(a)P.(A) Vijabilnost hEL ćelija tretiranih sa B(a)P.(B) Vijabilnost hEL ćelija tretiranih sa G-Rg3r.(C) Vijabilnost hEL ćelija tretiranih sa G-Rg3.(D) Viabilnost hEL ćelija tretiranih sa B(a)P i G-Rg3r.(E) Vijabilnost hEL ćelija tretiranih sa B(a)P i G-Rg3.(F) Nivoi adukta BPDE-DNK u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ekspresija GST enzima je otkrivena nakon zajedničkog tretmana sa 10 μM B(a)P i 10 μM G-Rg3r ili G-Rg3s.Naši rezultati su pokazali da je B(a)P potisnuo ekspresiju GST (59,7 ± 8,2% u G-Rg3r grupi i 39 ± 4,5% u G-Rg3s grupi), a B(a)P je bio povezan sa bilo kojim od G-Rg3r , ili sa G-Rg3r, ili sa G-Rg3r.Zajednički tretman sa G-Rg3s vratio je GST ekspresiju.Ekspresija GST (103,7 ± 15,5% u G-Rg3r grupi i 110 ± 11,1% u G-Rg3s grupi, p < 0,05 i p < 0,001, respektivno, sl. 6A, B i C).GST aktivnost je procijenjena korištenjem kompleta za analizu aktivnosti.Naši rezultati su pokazali da je grupa sa kombinovanim tretmanom imala veću aktivnost GST u poređenju sa grupom koja je primala samo B(a)P (96,3 ± 6,6% naspram 35,7 ± 7,8% u grupi G-Rg3r naspram 92,3 ± 6,5 u grupi G-Rg3r ).% naspram 35,7 ± 7,8% u grupi G-Rg3s, p < 0,001, Slika 6D).
Ekspresija GST i Nrf2 u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3.(A) Detekcija GST ekspresije Western blottingom.(B) Kvantitativna ekspresija GST u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3r.(C) Kvantitativna ekspresija GST u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3s.(D) GST aktivnost u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3.(E) Detekcija ekspresije Nrf2 Western blottingom.(F) Kvantitativna ekspresija Nrf2 u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3r.(G) Kvantitativna ekspresija Nrf2 u hEL ćelijama tretiranim sa B(a)P i G-Rg3s.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Da bi se razjasnili putevi uključeni u G-Rg3 posredovanu supresiju B(a)P-indukovane tumorigeneze, ekspresija Nrf2 je procijenjena Western blotingom.Kao što je prikazano na slikama 6E,F,G, u poređenju sa kontrolnom grupom, smanjen je samo nivo Nrf2 u B(a)P grupi;međutim, u poređenju sa grupom koja je primala B(a)P, nivoi B(a) Nrf2 u PG-Rg3 grupi su povećani (106 ± 9,5% za G-Rg3r naspram 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% za G-Rg3r naspram 41 ± 9,8% za G-Rg3s, p < 0,01).
Preventivnu ulogu Nrf2 potvrdili smo supresijom ekspresije Nrf2 upotrebom specifične male interferirajuće RNK (siRNA).Nokdaun Nrf2 je potvrđen Western blotingom (slika 7A,B).Kao što je prikazano na slikama 7C,D, zajednički tretman hEL ćelija sa B(a)P i G-Rg3 rezultirao je smanjenjem broja adukata BPDE-DNK (1,47 ± 0,21) u poređenju sa tretmanom sa B(a)P sam u kontrolnoj siRNA grupi.) G-Rg3r je bio 4,13 ± 0,49, G-Rg3s je bio 1,8 ± 0,32 i 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Međutim, inhibitorni efekat G-Rg3 na formiranje BPDE-DNK ukinut je Nrf2 nokdaunom.U grupi siNrf2, nije bilo značajne razlike u formiranju adukta BPDE-DNK između zajedničkog tretmana B(a)P i G-Rg3 i samog B(a)P tretmana (3,0 ± 0,21 za G-Rg3r naspram 3,56 ± 0,32 ).za G-Rg3r naspram 3,6 za G-Rg3s naspram ±0,45 naspram 4,0±0,37, p > 0,05).
Učinak nokdauna Nrf2 na formiranje adukta BPDE-DNK u hEL stanicama.(A) Nrf2 nokdaun je potvrđen Western blotingom.(B) Kvantifikacija intenziteta Nrf2 pojasa.(C) Učinak nokdauna Nrf2 na nivoe adukta BPDE-DNK u hEL ćelijama tretiranim B(a)P i G-Rg3r.(D) Učinak nokdauna Nrf2 na nivoe adukta BPDE-DNK u hEL ćelijama tretiranim B(a)P i G-Rg3.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ova studija procijenila je preventivne efekte različitih ekstrakata crvenog ginsenga na mišjem modelu B(a)P-induciranog karcinoma pluća, a liječenje KRGB-om značajno je smanjilo opterećenje tumorom.S obzirom da G-Rg3 ima najveći sadržaj u ovom ekstraktu ginsenga, proučavana je važna uloga ovog ginsenozida u inhibiciji tumorigeneze.I G-Rg3r i G-Rg3 (dva epimera G-Rg3) značajno su smanjili opterećenje tumorom u mišjem modelu B(a)P-induciranog karcinoma.G-Rg3r i G-Rg3 ispoljavaju antikancerogene efekte indukujući apoptozu tumorskih ćelija21, inhibiraju rast tumora22, zaustavljaju ćelijski ciklus23 i utiču na angiogenezu24.Takođe se pokazalo da G-Rg3 inhibira ćelijske metastaze25, a dokumentovana je i sposobnost G-Rg3 da pojača efekte hemoterapije i radioterapije26,27.Poon i saradnici su pokazali da tretman G-Rg3 može smanjiti genotoksične efekte B(a)P28.Ova studija pokazuje terapeutski potencijal G-Rg3 u ciljanju kancerogenih molekula iz okoline i prevenciji raka.
Uprkos njihovom dobrom profilaktičkom potencijalu, loša oralna bioraspoloživost ginsenozida predstavlja izazov za kliničku upotrebu ovih molekula.Farmakokinetička analiza oralne primjene ginsenozida kod pacova pokazala je da je njihova bioraspoloživost još uvijek manja od 5%29.Ovi testovi su pokazali da se nakon 20-tjednog perioda liječenja smanjio samo nivo Rg5 u krvi.Iako osnovni mehanizam slabe bioraspoloživosti tek treba da bude razjašnjen, smatra se da je P-gp uključen u efluks ginsenozida.Ovaj rad je po prvi put pokazao da primjena verapamila, blokatora P-gp, povećava oralnu bioraspoloživost G-Rg3r i G-Rg3s.Dakle, ovaj nalaz sugerira da G-Rg3r i G-Rg3 djeluju kao supstrati P-gp za regulaciju njegovog efluksa.
Ovaj rad pokazuje da kombinovano liječenje verapamilom povećava oralnu bioraspoloživost G-Rg3 u mišjem modelu raka pluća.Ovaj nalaz je podržan povećanim intestinalnim transcelularnim transportom G-Rg3 nakon blokade P-gp, čime se povećava njegova apsorpcija.Testovi na Caco2 ćelijama pokazali su da tretman verapamilom smanjuje efluks G-Rg3r i G-Rg3s uz poboljšanje propusnosti membrane.Studija Yang et al.Studije su pokazale da liječenje ciklosporinom A (još jedan blokator P-gp) povećava bioraspoloživost ginsenozida Rh2 sa početne vrijednosti od 1%20 na više od 30%.Ginsenozidna jedinjenja K i Rg1 su takođe pokazala slične rezultate30,31.Kada su verapamil i ciklosporin A istovremeno davani, efluks jedinjenja K u Caco-2 ćelije je značajno smanjen sa 26,6 na manje od 3, dok su se njegovi intracelularni nivoi povećali 40 puta30.U prisustvu verapamila, nivoi Rg1 su se povećali u epitelnim ćelijama pluća pacova, što ukazuje na ulogu P-gp u efluksu ginsenozida, kao što su pokazali Meng et al.31.Međutim, verapamil nije imao isti efekat na efluks nekih ginsenozida (kao što su Rg1, F1, Rh1 i Re), što ukazuje da na njih ne utiču P-gp supstrati, kao što su pokazali Liang et al.32 .Ovo zapažanje može biti povezano sa uključivanjem drugih transportera i alternativnih struktura ginsenozida.
Mehanizam preventivnog dejstva G-Rg3 na rak je nejasan.Prethodne studije su pokazale da G-Rg3 sprječava oštećenje DNK i apoptozu smanjenjem oksidativnog stresa i upale16,33, što može biti osnovni mehanizam za prevenciju B(a)P-inducirane tumorigeneze.Neki izvještaji pokazuju da se genotoksičnost izazvana B(a)P može smanjiti modulacijom enzima faze II da bi se formirao BPDE-DNA34.GST je tipičan enzim faze II koji inhibira stvaranje BPDE-DNK adukta promovišući vezivanje GSH za BPDE, čime se smanjuje oštećenje DNK izazvano B(a)P35.Naši rezultati pokazuju da tretman G-Rg3 smanjuje B(a)P-indukovanu citotoksičnost i formiranje adukta BPDE-DNK u hEL ćelijama i obnavlja ekspresiju i aktivnost GST in vitro.Međutim, ovi efekti su izostali u odsustvu Nrf2, što sugerira da G-Rg3 inducira citoprotektivne efekte putem Nrf2 puta.Nrf2 je glavni faktor transkripcije za enzime detoksikacije faze II koji promoviše uklanjanje ksenobiotika36.Aktivacija Nrf2 puta inducira citoprotekciju i smanjuje oštećenje tkiva37.Štaviše, nekoliko izvještaja podržava ulogu Nrf2 kao tumor supresora u karcinogenezi38.Naša studija pokazuje da indukcija Nrf2 puta G-Rg3 igra važnu regulatornu ulogu u genotoksičnosti izazvanoj B(a)P izazivanjem detoksikacije B(a)P aktivacijom enzima faze II, čime se inhibira proces tumorigeneze.
Naš rad otkriva potencijal crvenog ginsenga u prevenciji B(a)P-induciranog karcinoma pluća kod miševa kroz važno učešće ginsenozida G-Rg3.Loša oralna biodostupnost ovog molekula otežava njegovu kliničku primjenu.Međutim, ova studija po prvi put pokazuje da je G-Rg3 supstrat P-gp, a primjena inhibitora P-gp povećava bioraspoloživost G-Rg3 in vitro i in vivo.G-Rg3 smanjuje B(a)P-indukovanu citotoksičnost regulacijom Nrf2 puta, što može biti potencijalni mehanizam za njegovu preventivnu funkciju.Naša studija potvrđuje potencijal ginsenozida G-Rg3 za prevenciju i liječenje raka pluća.
Šestonedeljne ženke A/J miševa (20 ± 1 g) i 7 nedelja stari mužjaci Wistar pacova (250 ± 20 g) dobijeni su iz The Jackson Laboratory (Bar Harbor, SAD) i Instituta za zoologiju Wuhan.Univerzitet (Wuhan, Kina).Centar za sakupljanje kineskih tipskih kultura (Wuhan, Kina) nam je dao Caco-2 i hEL ćelije.Sigma-Aldrich (St. Louis, SAD) je izvor B(a)P i trikaprina.Pročišćeni ginsenozidi G-Rg3r i G-Rg3s, dimetil sulfoksid (DMSO), komplet za ispitivanje proliferacije CellTiter-96 (MTS), verapamil, minimalni esencijalni medij (MEM) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Čengdu, Kina).QIAamp DNA mini kit i komplet ELISA adukta BPDE-DNK kupljeni su od Qiagena (Stanford, Kalifornija, SAD) i Cell Biolabs-a (San Dijego, Kalifornija, SAD).Komplet za analizu GST aktivnosti i komplet za analizu ukupnog proteina (standardna BCA metoda) kupljeni su od Solarbio (Peking, Kina).Svi ekstrakti crvenog ginsenga pohranjeni su u laboratoriji Mingyu 7. Baptistički univerzitet u Hong Kongu (Hong Kong, Kina) i Korea Cancer Center (Seul, Koreja) su komercijalni izvori CRG ekstrakta i raznih ekstrakata crvenog ginsenga različitog korejskog porijekla (uključujući KRGA, KRGB i KRGC).Crveni ginseng se pravi od korijena 6-godišnjeg svježeg ginsenga.Ekstrakt crvenog ginsenga se dobija tri puta pranjem ginsenga vodom, zatim koncentriranjem vodenog ekstrakta i konačno sušenjem na niskoj temperaturi da se dobije prah ekstrakta ginsenga.Antitijela (anti-Nrf2, anti-GST i β-aktin), anti-zečji imunoglobulin G (IgG), konjugirani s peroksidazom hrena, reagens za transfekciju, kontrolna siRNA i Nrf2 siRNA kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija) .), SAD).
Caco2 i hEL ćelije su uzgajane u posudama za ćelijsku kulturu od 100 mm2 sa MEM koji sadrži 10% FBS na 37 °C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2.Da bi se odredio efekat uslova tretmana, hEL ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama B(a)P i G-Rg3 u MEM tokom 48 h.Ćelije se mogu dalje analizirati ili sakupljati kako bi se pripremili ekstrakti bez ćelija.
Sve eksperimente je odobrio Komitet za eksperimentalnu etiku na životinjama Medicinskog fakulteta Tongji, Univerziteta nauke i tehnologije Huazhong (br. odobrenja 2019; registracijski broj 4587TH).Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa relevantnim smjernicama i propisima, a studija je provedena u skladu sa smjernicama Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE).Osmonedeljnim A/J miševima je prvo intraperitonealno ubrizgan B(a)P u rastvoru trikaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Nakon nedelju dana, miševi su nasumično podeljeni u kontrolne grupe i različite grupe za tretman, po 15 miševa u svakoj grupi, i davani su jednom dnevno.Nakon 20 sedmica tretmana, životinje su žrtvovane CO2 asfiksijom.Pluća su sakupljena i fiksirana 24 sata.Broj površinskih tumora i pojedinačne veličine tumora kvantificirani su za svako plućno krilo pod mikroskopom za seciranje.Procjene zapremine tumora (V) su izračunate korištenjem sljedećeg izraza: V (mm3) = 4/3πr3, gdje je r prečnik tumora.Neto zbir svih volumena tumora u plućima miševa predstavlja ukupni volumen tumora, a prosječni ukupni volumen tumora u svakoj grupi predstavlja opterećenje tumorom.Uzorci pune krvi i crijeva su sakupljeni i pohranjeni na -80°C za UPLC-MS/MS određivanje.Serum je sakupljen i automatski hemijski analizator je korišten za analizu nivoa alanin aminotransferaze (ALT) i kreatinina u serumu (Cr) za procjenu funkcije jetre i bubrega.
Prikupljeni uzorci su uklonjeni iz hladnjače, odmrznuti, izvagani i stavljeni u epruvete kao što je gore opisano.Tome je dodato 0,5 μM florizina (interni standard) u 0,8 ml rastvora metanola.Tkivo je zatim homogenizovano upotrebom Tissue-Tearor-a i homogenat je zatim prebačen u epruvetu za mikrocentrifugu od 1,5 ml.Smjesa je centrifugirana na 15500 o/min 15 minuta.Nakon uklanjanja 1,0 ml supernatanta, osušiti dušikom.Za oporavak je korišteno dvije stotine mikrolitara metanola.Krv se prikuplja i obrađuje na jednoj liniji i koristi se kao referenca za sva mjerenja.
Transwell ploče sa 24 jažice su zasijane sa 1,0 × 105 Caco-2 ćelija po jažici da bi se procenilo potencijalno poboljšanje transporta G-Rg3 dodatkom verapamila.Nakon 3 sedmice kulture, ćelije su isprane sa HBSS i prethodno inkubirane na 37°C.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, ili mješavina sa 50 ili 100 μM verapamila) je ubrizgano na bazolateralnu ili apikalnu stranu monosloja, a 600 μL otopine HBSS je dodano u drugi strana.Sakupite 100 µl podloge za kulturu u naznačeno vrijeme (0, 15, 30, 45, 60, 90 i 120 minuta) i dodajte 100 µl HBSS-a da biste popunili ovu zapreminu.Uzorci su čuvani na -4 °C do detekcije pomoću UPLC-MS/MS.Izraz Papp = dQ/(dT × A × C0) se koristi za kvantifikaciju prividne jednosmjerne apikalne i bazolateralne permeabilnosti i obrnuto (Pa-b i Pb-a, respektivno);dQ/dT je promjena koncentracije, A (0,6 cm2) je površina monosloja, a C0 je početna koncentracija donora.Odnos efluksa se izračunava kao Pb-a/Pa-b, što predstavlja brzinu efluksa ispitivanog lijeka.
Mužjaci Wistar pacova su gladni 24 sata, pili su samo vodu i anestezirali intravenskom injekcijom 3,5% rastvora pentobarbitala.Intubirana silikonska cijev ima kraj duodenuma kao ulaz i kraj ileuma kao izlaz.Koristite peristaltičku pumpu za pumpanje ulaza sa 10 µM G-Rg3r ili G-Rg3s u izotoničnom HBSS pri brzini protoka od 0,1 ml/min.Efekat verapamila je procenjen dodavanjem 50 μM ili 100 μM jedinjenja u 10 μM G-Rg3r ili G-Rg3s.UPLC-MS/MS je izveden na perfuzionim ekstraktima prikupljenim u vremenskim tačkama 60, 90, 120 i 150 minuta nakon početka perfuzije.Procenat apsorpcije je kvantifikovan formulom % apsorpcije = (1 – Cout/Cin) × 100%;koncentracija G-Rg3 na izlazu i ulazu izražena je sa Cout i Cin, respektivno.
hEL ćelije su posađene u ploče sa 96 jažica pri gustini od 1 × 104 ćelije po jažici i tretirane sa B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ili G-Rg3 otopljenim u DMSO .Lijekovi su zatim razrijeđeni podlogom za kulturu do različitih koncentracija (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) tokom 48 sati.Koristeći komercijalno dostupan MTS komplet za analizu, ćelije su podvrgnute standardnom protokolu i zatim izmjerene pomoću čitača mikroploče na 490 nm.Nivo vijabilnosti ćelija u grupama ko-tretiranim sa B(a)P (10 μM) i G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) procenjen je prema gore navedenoj metodi i upoređen sa netretiranom grupom.
hEL ćelije su posađene u ploče sa 6 jažica pri gustini od 1 × 105 ćelija/jažici i tretirane sa 10 μMB(a)P u prisustvu ili odsustvu 10 μM G-Rg3.Nakon 48 sati tretmana, DNK je ekstrahovan iz hEL ćelija koristeći QIAamp DNA Mini Kit prema protokolu proizvođača.Formiranje BPDE-DNK adukata je detektovano korišćenjem ELISA kompleta BPDE-DNA adukta.Relativni nivoi adukta BPDE-DNK mjereni su pomoću čitača mikroploča mjerenjem apsorbancije na 450 nm.
hEL ćelije su posađene u ploče sa 96 jažica pri gustini od 1 × 104 ćelije po jažici i tretirane sa 10 μMB(a)P u odsustvu ili prisustvu 10 μM G-Rg3 tokom 48 h.GST aktivnost je mjerena korištenjem komercijalnog kompleta za analizu GST aktivnosti prema protokolu proizvođača.Relativna GST aktivacija je mjerena apsorbancijom na 450 nm pomoću čitača mikroploče.
hEL ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om, a zatim lizirane upotrebom pufera za radioimunoprecipitacijski test koji sadrži inhibitore proteaze i inhibitore fosfataze.Nakon kvantifikacije proteina korištenjem kompleta za analizu ukupnog proteina, 30 μg proteina u svakom uzorku je odvojeno sa 12% SDS-PAGE i prebačeno na PVDF membranu elektroforezom.Membrane su blokirane sa 5% obranog mleka i inkubirane sa primarnim antitelima preko noći na 4°C.Nakon inkubacije sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena, dodani su reagensi poboljšane hemiluminiscencije kako bi se vizualizirao signal vezivanja.Intenzitet svake trake proteina je kvantifikovan korišćenjem softvera ImageJ.
Za analizu svih podataka, izraženih kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, korišten je softver GraphPad Prism 7.0.Varijacija između tretiranih grupa je procenjena korišćenjem Studentovog t testa ili jednosmerne analize varijanse, sa P vrednošću <0,05 koja ukazuje na statističku značajnost.
Svi podaci dobijeni ili analizirani tokom ove studije uključeni su u ovaj objavljeni članak i datoteke sa dodatnim informacijama.
Torre, LA, Siegel, RL i Jemal, A. Statistika raka pluća.prilog.Istekao.lijek.biologija.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Duvanski karcinogeni, njihovi biomarkeri i rak izazvan duvanom.Nat.Kapelan za rak.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH i Venitt, S. DNK i proteinski adukti u ljudskim tkivima nastali kao rezultat izlaganja duvanskom dimu.internacionalnost.J. Cancer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA i Yu M. Efekat Houttuynia cordata i silibinina na tumorigenezu pluća izazvanu benzo(a)pirenom kod A/J miševa.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Prirodni proizvod protiv raka izolovan od kineskih medicinskih materijala.vilica.lijek.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Efikasnost polifenona E, crvenog ginsenga i rapamicina na tumorigenezu pluća izazvanu benzo(a)pirenom kod A/J miševa.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS i Yuan, KS Red, uključenost u terapiju raka.vilica.J. Nutt.lijek.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS i Gao, L. Ginsenosides u korijenu i lišću američkog ginsenga.J. Agric.Hemija hrane.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA i Yuan KS Farmakologija ginsenga: mnoge komponente i mnogi efekti.biohemija.farmakologija.58, 1685–1693 (1999).
Vrijeme objave: Sep-17-2023