Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport permanent, estem mostrant el lloc sense estil ni JavaScript.
El ginseng vermell s'ha utilitzat en la medicina tradicional asiàtica durant centenars d'anys.En aquest estudi, hem avaluat la capacitat de quatre tipus de ginseng vermell (ginseng vermell xinès, ginseng vermell coreà A, ginseng vermell coreà B i ginseng vermell coreà C) cultivats a diferents regions per inhibir la formació i el creixement del pulmó induït per carcinogens. tumors.Es va realitzar una prova de benzo(a)pirè (B(a)P) en ratolins A/J, i es va trobar que el ginseng vermell coreà B era el més eficaç per reduir la càrrega tumoral entre les quatre varietats de ginseng vermell.A més, vam analitzar el contingut de diversos ginsenòsids (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5) en quatre extractes de ginseng vermell i vam trobar que el ginseng vermell coreà B tenia els nivells més alts de ginsenòsid Rg3 (G-Rg3), cosa que suggereix que G-Rg3 pot tenir un paper important en la seva eficàcia terapèutica.Aquest treball demostra que G-Rg3 té una biodisponibilitat relativament baixa.Tanmateix, quan es va administrar G-Rg3 conjuntament amb l'inhibidor de P-gp verapamil, l'eflux de G-Rg3 a les cèl·lules Caco-2 es va reduir, la taxa d'absorció intestinal de G-Rg3 es va augmentar en un model de rata i G-Rg3. va augmentar.A les cèl·lules Caco-2, el flux de sortida de Rg3 disminueix i el nivell de concentració de Rg3 disminueix.G-Rg3 augmenta a l'intestí i al plasma, i la seva capacitat per prevenir tumors també es millora en un model de rata de tumorigènesi induïda per B(a)P.També vam trobar que G-Rg3 va reduir la citotoxicitat induïda per B(a)P i la formació d'adductes d'ADN a les cèl·lules pulmonars humanes i va restaurar l'expressió i l'activitat dels enzims de fase II a través de la via Nrf2, que pot estar relacionada amb el mecanisme d'acció potencial. de la inhibició de G -Rg3..Sobre l'aparició de tumors pulmonars.El nostre estudi demostra un paper potencialment important per a G-Rg3 en l'orientació als tumors pulmonars en models de ratolí.La biodisponibilitat oral d'aquest ginsenòsid es millora dirigint-se a la glicoproteïna P, la qual cosa permet que la molècula exerceixi efectes anticancerígens.
El tipus més comú de càncer de pulmó és el càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC), que és una de les principals causes de mort per càncer a la Xina i Amèrica del Nord1,2.El principal factor que augmenta el risc de desenvolupar càncer de pulmó de cèl·lules no petites és el tabaquisme.El fum de la cigarreta conté més de 60 carcinògens, incloent benzo(a)pirè (B(a)P), nitrosamines i isòtops radioactius de la descomposició del radó.3 Els hidrocarburs aromàtics policíclics B(a)P són la principal causa de toxicitat en el cigarret. fum.En exposar-se a B(a)P, el citocrom P450 el converteix en B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epòxid (BPDE), que reacciona amb l'ADN per formar l'adducte BPDE-DNA 4. A més, aquests els aductes indueixen la tumorigènesi pulmonar en ratolins amb estadi tumoral i histopatologia similar als tumors pulmonars humans5.Aquesta característica fa que el model de càncer de pulmó induït per B(a)P sigui un sistema adequat per avaluar compostos amb possibles propietats anticancerígenes.
Una possible estratègia per prevenir el desenvolupament del càncer de pulmó en grups d'alt risc, especialment fumadors, és l'ús d'agents quimiopreventius per suprimir el desenvolupament de lesions neoplàsiques intraepitelials i evitar així la seva progressió posterior a la malignitat.Els estudis en animals mostren que diversos agents quimiopreventius són efectius6.El nostre informe anterior7 va destacar els bons efectes preventius del ginseng vermell sobre el càncer de pulmó.Aquesta herba s'ha utilitzat durant segles en la medicina tradicional asiàtica per allargar la vida i la salut, i s'ha documentat que té efectes antitumorals8.
El factor actiu del ginseng és el ginsenòsid, que s'utilitza com a marcador compost per avaluar la qualitat dels extractes de ginseng.L'anàlisi quantitativa dels extractes de ginseng brut normalment implica l'ús de diversos ginsenòsids, inclosos RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 i Rc9,10.Els ginsenòsids tenen poc ús clínic a causa de la seva molt pobra biodisponibilitat oral11.Tot i que el mecanisme d'aquesta pobra biodisponibilitat no està clar, l'eflux de ginsenòsids causat per la glicoproteïna P (P-gp)12 pot ser la causa.P-gp és un dels transportadors d'eflux més importants de la superfamília de transportadors de casset d'unió a ATP, que utilitza l'energia de la hidròlisi de l'ATP per alliberar substàncies intracel·lulars a l'entorn extern.Els transportadors de P-gp solen estar àmpliament distribuïts a l'intestí, el ronyó, el fetge i la barrera hematoencefàlica13.P-gp té un paper crític en l'absorció intestinal, i la inhibició de P-gp augmenta l'absorció oral i la disponibilitat d'alguns fàrmacs anticancerígens12,14.Exemples d'inhibidors utilitzats anteriorment a la literatura són el verapamil i la ciclosporina A15.Aquest treball consisteix a establir un sistema de ratolí per estudiar el càncer de pulmó induït per B(a)P per avaluar la capacitat de diferents extractes de ginseng vermell de la Xina i Corea per afectar malalties malignes.Els extractes es van analitzar individualment per identificar ginsenòsids específics que poden afectar la carcinogènesi.Aleshores, el verapamil es va utilitzar per orientar la P-gp i millorar la biodisponibilitat oral i l'eficàcia terapèutica dels ginsenòsids dirigits al càncer.
El mecanisme pel qual les saponines de ginseng exerceixen efectes terapèutics sobre la carcinogènesi encara no està clar.La investigació ha demostrat que diversos ginsenòsids poden reduir el dany a l'ADN causat pels carcinògens reduint l'estrès oxidatiu i activant els enzims de desintoxicació de fase II, evitant així el dany cel·lular.La glutatió S-transferasa (GST) és un enzim típic de fase II que es requereix per reduir el dany a l'ADN causat pels carcinògens17.El factor 2 relacionat amb l'eritroide nuclear 2 (Nrf2) és un important factor de transcripció que regula l'homeòstasi redox i activa l'expressió dels enzims de fase II i les respostes antioxidants citoprotectores18.El nostre estudi també va examinar els efectes dels ginsenòsids identificats en la reducció de la citotoxicitat induïda per B (a) P i la formació d'aductes BPDE-DNA, així com la inducció d'enzims de fase II modulant la via Nrf2 a les cèl·lules pulmonars normals.
L'establiment d'un model de ratolí de càncer induït per B (a) P és coherent amb el treball anterior5.La figura 1A mostra el disseny experimental d'un tractament de 20 setmanes d'un model de càncer de ratolí induït per B (a) P, aigua (control), extracte de ginseng vermell xinès (CRG), extracte de ginseng vermell coreà A (KRGA) i vermell coreà. ginseng.Extracte B (KRGB) i extracte de ginseng vermell coreà C (KRGC).Després de 20 setmanes de tractament amb ginseng vermell, els ratolins van ser sacrificats per asfíxia amb CO2.La figura 1B mostra tumors pulmonars macroscòpics en animals tractats amb diferents tipus de ginseng vermell, i la figura 1C mostra una micrografia de llum representativa d'una mostra de tumor.La càrrega tumoral dels animals tractats amb KRGB (1, 5 ± 0, 35) va ser inferior a la dels animals de control (0, 82 ± 0, 2, P < 0, 05), tal com es mostra a la figura 1D.El grau mitjà d'inhibició de la càrrega tumoral va ser del 45%.Altres extractes de ginseng vermell provats no van mostrar canvis tan significatius en la càrrega tumoral (P > 0,05).No es van observar efectes secundaris evidents en el model de ratolí durant 20 setmanes de tractament amb ginseng vermell, incloent cap canvi en el pes corporal (dades no mostrades) i cap toxicitat hepàtica o renal (figura 1E, F).
L'extracte de ginseng vermell tracta el desenvolupament de tumors pulmonars en ratolins A/J.(A) Disseny experimental.(B) Tumors pulmonars grans en un model de ratolí.Els tumors s'indiquen amb fletxes.a: grup de ginseng vermell xinès.b: grup A de ginseng vermell coreà.c: ginseng vermell coreà grup B. d: grup de ginseng vermell coreà C. d: grup control.(C) Micrografia lleugera que mostra un tumor pulmonar.Ampliació: 100. b: 400. (D) Càrrega tumoral en el grup d'extracte de ginseng vermell.(E) Nivells plasmàtics de l'enzim hepàtic ALT.(F) Nivells plasmàtics de l'enzim renal Cr.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard.*P <0,05.
Els extractes de ginseng vermell identificats en aquest estudi es van analitzar mitjançant espectrometria de masses en tàndem de cromatografia líquida d'ultra rendiment (UPLC-MS/MS) per quantificar els següents ginsenòsids: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3 , Rh2, F1, Rk1 i Rg5.Les condicions UPLC i MS utilitzades per mesurar els analits es van descriure en un informe anterior19.A la figura 2A es mostren els cromatogrames UPLC-MS/MS de quatre extractes de ginseng vermell.Hi va haver diferències significatives en el contingut total de ginsenòsids, amb el contingut total de ginsenòsids més alt en CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (figura 2B).En avaluar els ginsenòsids individuals (figura 2C), KRGB va mostrar el nivell més alt de G-Rg3 en comparació amb altres ginsenòsids (58,33 ± 3,81 μmol/L per a G-Rg3s i 41,56 ± 2,88 μmol/L per a G-Rg3r).L).tipus de ginseng vermell (P <0,001).G-Rg3 es presenta com un parell d'estereoisòmers G-Rg3r i G-Rg3s, que difereixen en la posició del grup hidroxil al carboni 20 (Fig. 2D).Els resultats indiquen que G-Rg3r o G-Rg3 poden tenir un potencial anticancerígen important en un model de ratolí de càncer induït per B (a) P.
Contingut de ginsenòsids en diversos extractes de ginseng vermell.(A) Cromatogrames UPLC-MS/MS de quatre extractes de ginseng vermell.(B) Estimació del contingut total de ginsenòsids en els extractes indicats.(C) Detecció de ginsenòsids individuals en extractes marcats.(D) Estructures dels estereoisòmers de ginsenòsids G-Rg3r i G-Rg3s.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard de determinacions per triplicat.***P <0,001.
L'estudi UPLC-MS/MS va requerir la quantificació de ginsenòsids en mostres intestinals i de sang després de 20 setmanes de tractament.El tractament amb KRGB va mostrar la presència de només 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 a la sang.No es van detectar ginsenòsids restants, cosa que indica una mala biodisponibilitat oral i, per tant, una exposició reduïda a aquests ginsenòsids.
La línia cel·lular d'adenocarcinoma de còlon Caco-2 és morfològicament i bioquímicament similar a les cèl·lules epitelials intestinals humanes, demostrant la seva utilitat per avaluar el transport d'enteròcits a través de la barrera epitelial intestinal.Aquesta anàlisi es va basar en un estudi anterior 20 .Les figures 3A, B, C, D, E, F mostren imatges representatives del transport transcel·lular de G-Rg3r i G-Rg3 mitjançant un model de monocapa Caco-2.El transport transcel·lular de G-Rg3r o G-Rg3 a través de les monocapes de Caco-2 del costat basolateral a apical (Pb-a) va ser significativament més gran que del costat apical a basolateral (Pa-b).Per a G-Rg3r, el valor mitjà de Pa-b va ser de 0,38 ± 0,06, que va augmentar a 0,73 ± 0,06 després del tractament amb 50 μmol/L de verapamil i a 1,14 ± 0,09 després del tractament amb 100 μmol/L de verapamil (p < 0,001 i 0,01). respectivament; figura 2).3A).Les observacions de G-Rg3 van seguir un patró similar (Fig. 3B), i els resultats van mostrar que el tractament amb verapamil millorava el transport de G-Rg3r i G-Rg3.El tractament amb verapamil també va provocar una disminució significativa de les proporcions mitjanes d'eflux de Pb-a i G-Rg3r i G-Rg3s (figura 3C, D, E, F), cosa que indica que el tractament amb verapamil redueix el contingut de ginsenòsids a les cèl·lules d'eflux Caco-2..
Transport transcel·lular de G-Rg3 en monocapes de Caco-2 i absorció intestinal en un assaig de perfusió en rata.(A) Valor Pa-b del grup G-Rg3r a la monocapa Caco-2.(B) Valor Pa-b dels grups G-Rg3s a la monocapa Caco-2.( C ) Valor de Pb del grup G-Rg3r a la monocapa de Caco-2.(D) Valor de Pb dels grups G-Rg3s a la monocapa Caco-2.(E) Relació de rendiment dels grups G-Rg3r en una monocapa de Caco-2.(F) Relació de rendiment dels grups G-Rg3 en una monocapa de Caco-2.(G) Percentatge d'absorció intestinal de G-Rg3r en un assaig de perfusió en rates.(H) Percentatge d'absorció intestinal de G-Rg3 en un assaig de perfusió en rates.Es va comparar la permeabilitat i l'absorció sense afegir verapamil.Les dades s'expressen com la mitjana ± desviació estàndard de cinc experiments independents.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
D'acord amb el treball anterior20, es va realitzar una perfusió intestinal ortotòpica de rates per determinar si l'absorció de G-Rg3 a l'intestí augmenta després del tractament amb verapamil.Les figures 3G, H mostren assajos de perfusió representatius per avaluar el percentatge d'absorció intestinal de G-Rg3r i G-Rg3 en rates model de càncer durant els períodes de temps anteriors.El percentatge inicial de captació feble de G-Rg3r d'aproximadament un 10% va augmentar a més del 20% després del tractament amb 50 μM de verapamil i a més del 25% després del tractament amb 100 μM de verapamil.Així mateix, G-Rg3, que va tenir una captació inicial del 10%, també va mostrar un pic superior al 20% després del tractament amb 50 μM de verapamil i gairebé un 30% després del tractament amb 100 μM de verapamil, cosa que suggereix que la inhibició de P-gp per verapamil millora. G-absorció intestinal Rg3 en un model de ratolí de càncer de pulmó.
Segons el mètode anterior, els ratolins model de càncer induït per B (a) P es van dividir aleatòriament en sis grups, tal com es mostra a la figura 4A.No es va observar cap pèrdua de pes significativa ni signes clínics de toxicitat en el grup de tractament G-Rg3 en comparació amb el grup control (dades no mostrades).Després de 20 setmanes de tractament, es van recollir els pulmons de cada ratolí.La figura 4B mostra tumors pulmonars macroscòpics en ratolins dels grups de tractament anteriors, i la figura 4C mostra una micrografia de llum representativa d'un tumor representatiu.Pel que fa a la càrrega tumoral de cada grup (Fig. 4D), els valors dels ratolins tractats amb G-Rg3r i G-Rg3s van ser de 0,75 ± 0,29 mm3 i 0,81 ± 0,30 mm3, respectivament, mentre que els valors dels ratolins tractats amb G. amb -Rg3s eren 1,63 respectivament ±0,40 mm3.ratolins control (p <0, 001), cosa que indica que el tractament amb G-Rg3 va reduir la càrrega tumoral en ratolins.L'administració de verapamil va millorar encara més aquesta reducció: els valors dels ratolins verapamil+ G-Rg3r van disminuir de 0,75 ± 0,29 mm3 a 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) i els valors de verapamil+ van disminuir de 0,81 ± 0,30 mm3 a 0,30 ± 0,30 mm3 ± 0,29 ± 0,29 ± 0,01. mm3 en ratolins tractats amb G. -Rg3s (p <0, 05), cosa que indica que el verapamil pot millorar l'efecte inhibidor de G-Rg3 sobre la tumorigènesi.La càrrega tumoral no va mostrar diferències significatives entre el grup control i el grup verapamil, el grup G-Rg3r i el grup G-Rg3s, i el grup verapamil + G-Rg3r i el grup verapamil + G-Rg3s.A més, no hi va haver toxicitats hepàtiques o renals significatives associades amb els tractaments avaluats (figura 4E, F).
Càrrega tumoral després del tractament amb G-Rg3 i nivells plasmàtics o intestinals de G-Rg3r i G-Rg3 als grups indicats.(A) Disseny experimental.(B) Tumors macroscòpics en un model de ratolí.Els tumors s'indiquen amb fletxes.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r en combinació amb verapamil.d: G-Rg3 en combinació amb verapamil.d: Verapamil.e: control.(C) Micrografia òptica del tumor amb augment.Resposta: 100x.b: 400X.(D) Efecte del tractament amb G-Rg3 + verapamil sobre la càrrega tumoral en ratolins A/J.(E) Nivells plasmàtics de l'enzim hepàtic ALT.(F) Nivells plasmàtics de l'enzim renal Cr.(G) Nivells plasmàtics de G-Rg3r o G-Rg3 dels grups indicats.(H) Nivells de G-Rg3r o G-Rg3s als intestins dels grups indicats.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard de determinacions per triplicat.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Els nivells de G-Rg3 als ratolins model de càncer induït per B (a) P es van avaluar mitjançant UPLC-MS/MS després d'un període de tractament de 20 setmanes segons el mètode descrit a la secció Mètodes.Les figures 4G i H mostren nivells plasmàtics i intestinals de G-Rg3, respectivament.Els nivells plasmàtics de G-Rg3r eren de 0,44 ± 0,32 μmol/L i van augmentar a 1,17 ± 0,47 μmol/L amb l'administració concomitant de verapamil (p <0,001), mentre que els nivells intestinals de G-Rg3r eren de 0,53 ± 0,08 μg/l.Quan es combina amb verapamil, g va augmentar fins a 1,35 ± 0,13 μg/g (p <0,001).Per a G-Rg3, els resultats van seguir un patró similar, cosa que indica que el tractament amb verapamil va augmentar la biodisponibilitat oral de G-Rg3 en ratolins A/J.
Es va utilitzar l'assaig de viabilitat cel·lular per avaluar la citotoxicitat de B (a) P i G-Rg3 a les cèl·lules hEL.La citotoxicitat induïda per B (a) P a les cèl·lules hEL es mostra a la figura 5A, mentre que les propietats no tòxiques de G-Rg3r i G-Rg3 es mostren a les figures 5A i 5B.5B, C. Per avaluar l'efecte citoprotector de G-Rg3, es va coadministrar B(a)P amb diverses concentracions de G-Rg3r o G-Rg3 a les cèl·lules hEL.Tal com es mostra a la figura 5D, G-Rg3r a concentracions de 5 μM, 10 μM i 20 μM va restaurar la viabilitat cel·lular al 58, 3%, 79, 3% i 77, 3%, respectivament.També es poden veure resultats similars al grup G-Rg3s.Quan les concentracions de G-Rg3s eren de 5 µM, 10 µM i 20 µM, la viabilitat cel·lular es va restaurar al 58,3%, 72,7% i 76,7%, respectivament (figura 5E).).La presència d'aductes BPDE-ADN es va mesurar mitjançant un kit ELISA.Els nostres resultats van mostrar que els nivells d'adducte de BPDE-ADN van augmentar al grup tractat amb B (a) P en comparació amb el grup control, però en comparació amb el cotractament G-Rg3, els nivells d'adducte de BPDE-ADN al grup B (a) P. B en el grup tractat, els nivells d'aductes d'ADN es van reduir significativament.Els resultats del tractament amb B(a)P només es mostren a la figura 5F (1,87 ± 0,33 enfront de 3,77 ± 0,42 per a G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 enfront de 3,77 ± 0,42 per a G -Rg3s, p <0,001).
Viabilitat cel·lular i formació d'adductes BPDE-DNA a cèl·lules hEL tractades amb G-Rg3 i B (a) P.(A) Viabilitat de les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P.(B) Viabilitat de les cèl·lules hEL tractades amb G-Rg3r.(C) Viabilitat de les cèl·lules hEL tractades amb G-Rg3.( D ) Viabilitat de les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3r.(E) Viabilitat de les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3.( F ) Nivells d'adducte BPDE-DNA a les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard de determinacions per triplicat.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
L'expressió de l'enzim GST es va detectar després del cotractament amb 10 μM de B (a) P i 10 μM de G-Rg3r o G-Rg3s.Els nostres resultats van mostrar que B (a) P va suprimir l'expressió GST (59,7 ± 8,2% al grup G-Rg3r i 39 ± 4,5% al grup G-Rg3s), i B (a) P es va associar amb G-Rg3r. , o amb G-Rg3r, o amb G-Rg3r.El cotractament amb G-Rg3s va restaurar l'expressió GST.Expressió GST (103,7 ± 15,5% en el grup G-Rg3r i 110 ± 11,1% en el grup G-Rg3s, p <0,05 i p <0,001, respectivament, Fig. 6A, B i C).L'activitat GST es va avaluar mitjançant un kit d'assaig d'activitat.Els nostres resultats van mostrar que el grup de tractament combinat tenia una activitat GST més alta en comparació amb el grup només B(a)P (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% en el grup G-Rg3r vs. 92,3 ± 6,5 en el grup G-Rg3r). ).% vs 35,7 ± 7,8% en el grup G-Rg3s, p <0,001, figura 6D).
Expressió de GST i Nrf2 en cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3.(A) Detecció de l'expressió GST mitjançant Western blotting.(B) Expressió quantitativa de GST en cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3r.( C ) Expressió quantitativa de GST en cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3s.(D) Activitat GST a les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3.(E) Detecció de l'expressió Nrf2 mitjançant Western blotting.(F) Expressió quantitativa de Nrf2 en cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3r.(G) Expressió quantitativa de Nrf2 en cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3s.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard de determinacions per triplicat.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Per dilucidar les vies implicades en la supressió mediada per G-Rg3 de la tumorigènesi induïda per B (a) P, es va avaluar l'expressió de Nrf2 mitjançant Western blotting.Com es mostra a les figures 6E, F, G, en comparació amb el grup control, només es va reduir el nivell de Nrf2 al grup de tractament B (a) P;tanmateix, en comparació amb el grup de tractament B(a)P, els nivells de B(a) Nrf2 al grup PG-Rg3 van augmentar (106 ± 9,5% per a G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% per a G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% per a G-Rg3s, p <0,01).
Vam confirmar el paper preventiu de Nrf2 suprimint l'expressió de Nrf2 mitjançant un petit ARN interferent específic (siRNA).La derrota de Nrf2 es va confirmar mitjançant Western blotting (Fig. 7A, B).Com es mostra a les figures 7C, D, el cotractament de cèl·lules hEL amb B (a) P i G-Rg3 va donar lloc a una disminució del nombre d'aductes BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) en comparació amb el tractament amb B (a) P sol al grup de siRNA de control.) G-Rg3r va ser de 4,13 ± 0,49, G-Rg3s va ser d'1,8 ± 0,32 i 4,1 ± 0,57, p <0,01).Tanmateix, l'efecte inhibidor de G-Rg3 sobre la formació de BPDE-ADN va ser abolit per la derrota de Nrf2.En el grup siNrf2, no hi va haver cap diferència significativa en la formació d'adductes BPDE-DNA entre el cotractament B(a)P i G-Rg3 i el tractament amb B(a)P sol (3,0 ± 0,21 per a G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32). ).per a G-Rg3r versus 3,6 per a G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Efecte de la derrota de Nrf2 sobre la formació d'adductes BPDE-ADN a les cèl·lules hEL.(A) La derrota de Nrf2 es va confirmar mitjançant Western Blotting.(B) Quantificació de la intensitat de la banda Nrf2.( C ) Efecte de la derrota de Nrf2 sobre els nivells d'aducte BPDE-DNA a les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3r.( D ) Efecte de la derrota de Nrf2 sobre els nivells d'adducte de BPDE-DNA a les cèl·lules hEL tractades amb B (a) P i G-Rg3.Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard de determinacions per triplicat.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Aquest estudi va avaluar els efectes preventius de diversos extractes de ginseng vermell en un model de ratolí de càncer de pulmó induït per B(a)P, i el tractament amb KRGB va reduir significativament la càrrega tumoral.Tenint en compte que G-Rg3 té el contingut més alt en aquest extracte de ginseng, s'ha estudiat el paper important d'aquest ginsenòsid en la inhibició de la tumorigènesi.Tant G-Rg3r com G-Rg3 (dos epímers de G-Rg3) van reduir significativament la càrrega tumoral en un model de ratolí de càncer induït per B (a) P.G-Rg3r i G-Rg3 exerceixen efectes anticancerígens induint l'apoptosi de les cèl·lules tumorals21, inhibint el creixement del tumor22, aturant el cicle cel·lular23 i afectant l'angiogènesi24.També s'ha demostrat que G-Rg3 inhibeix la metàstasi cel·lular25, i s'ha documentat la capacitat de G-Rg3 per millorar els efectes de la quimioteràpia i la radioteràpia26,27.Poon et al van demostrar que el tractament amb G-Rg3 podria reduir els efectes genotòxics de B (a) P28.Aquest estudi demostra el potencial terapèutic de G-Rg3 per dirigir-se a molècules cancerígenes ambientals i prevenir el càncer.
Malgrat el seu bon potencial profilàctic, la poca biodisponibilitat oral dels ginsenòsids suposa un repte per a l'ús clínic d'aquestes molècules.L'anàlisi farmacocinètica de l'administració oral de ginsenòsids a rates va mostrar que la seva biodisponibilitat encara és inferior al 5%29.Aquestes proves van demostrar que després del període de tractament de 20 setmanes, només els nivells sanguinis de Rg5 van disminuir.Encara que el mecanisme subjacent de la mala biodisponibilitat encara està per dilucidar, es creu que la P-gp està implicada en l'eflux de ginsenòsids.Aquest treball va demostrar per primera vegada que l'administració de verapamil, un bloquejador de P-gp, augmenta la biodisponibilitat oral de G-Rg3r i G-Rg3s.Així, aquesta troballa suggereix que G-Rg3r i G-Rg3s actuen com a substrats de P-gp per regular el seu flux.
Aquest treball demostra que el tractament combinat amb verapamil augmenta la biodisponibilitat oral de G-Rg3 en un model de ratolí de càncer de pulmó.Aquesta troballa es recolza en un augment del transport transcel·lular intestinal de G-Rg3 després del bloqueig de P-gp, augmentant així la seva absorció.Els assajos en cèl·lules Caco2 van demostrar que el tractament amb verapamil va reduir l'eflux de G-Rg3r i G-Rg3s alhora que millorava la permeabilitat de la membrana.Un estudi de Yang et al.Els estudis han demostrat que el tractament amb ciclosporina A (un altre bloquejador de P-gp) augmenta la biodisponibilitat del ginsenòsid Rh2 des d'un valor inicial de l'1%20 a més del 30%.Els compostos de ginsenòsids K i Rg1 també van mostrar resultats similars30,31.Quan es van administrar conjuntament verapamil i ciclosporina A, l'eflux del compost K a les cèl·lules Caco-2 es va reduir significativament de 26,6 a menys de 3, mentre que els seus nivells intracel·lulars van augmentar 40 vegades30.En presència de verapamil, els nivells de Rg1 van augmentar a les cèl·lules epitelials del pulmó de rata, cosa que suggereix un paper de la P-gp en l'eflux de ginsenòsids, tal com mostra Meng et al.31.No obstant això, el verapamil no va tenir el mateix efecte sobre l'eflux d'alguns ginsenòsids (com Rg1, F1, Rh1 i Re), cosa que indica que no es veuen afectats pels substrats de P-gp, com mostra Liang et al.32 .Aquesta observació pot estar relacionada amb la implicació d'altres transportadors i estructures alternatives de ginsenòsids.
El mecanisme de l'efecte preventiu de G-Rg3 sobre el càncer no està clar.Estudis anteriors han demostrat que G-Rg3 prevé el dany a l'ADN i l'apoptosi reduint l'estrès oxidatiu i la inflamació16,33, que pot ser el mecanisme subjacent per prevenir la tumorigènesi induïda per B(a)P.Alguns informes indiquen que la genotoxicitat induïda per B(a)P es pot reduir mitjançant la modulació dels enzims de fase II per formar BPDE-DNA34.GST és un enzim típic de fase II que inhibeix la formació d'adductes de BPDE-ADN promovent la unió de GSH a BPDE, reduint així el dany de l'ADN induït per B (a) P35.Els nostres resultats mostren que el tractament amb G-Rg3 redueix la citotoxicitat induïda per B (a) P i la formació d'aductes BPDE-DNA a les cèl·lules hEL i restaura l'expressió i l'activitat de GST in vitro.Tanmateix, aquests efectes estaven absents en absència de Nrf2, cosa que suggereix que G-Rg3 indueix efectes citoprotectors a través de la via Nrf2.Nrf2 és un factor de transcripció important per als enzims de desintoxicació de fase II que promou l'eliminació de xenobiòtics36.L'activació de la via Nrf2 indueix la citoprotecció i redueix el dany tissular37.A més, diversos informes han donat suport al paper de Nrf2 com a supressor de tumors en la carcinogènesi38.El nostre estudi mostra que la inducció de la via Nrf2 per G-Rg3 té un paper regulador important en la genotoxicitat induïda per B (a) P provocant la desintoxicació de B (a) P activant enzims de fase II, inhibint així el procés de tumorigènesi.
El nostre treball revela el potencial del ginseng vermell per prevenir el càncer de pulmó induït per B (a) P en ratolins mitjançant la important implicació del ginsenòsid G-Rg3.La poca biodisponibilitat oral d'aquesta molècula dificulta la seva aplicació clínica.Tanmateix, aquest estudi mostra per primera vegada que G-Rg3 és un substrat de P-gp, i l'administració d'un inhibidor de P-gp augmenta la biodisponibilitat de G-Rg3 in vitro i in vivo.G-Rg3 redueix la citotoxicitat induïda per B(a)P regulant la via Nrf2, que pot ser un mecanisme potencial per a la seva funció preventiva.El nostre estudi confirma el potencial del ginsenòsid G-Rg3 per a la prevenció i el tractament del càncer de pulmó.
Es van obtenir ratolins A/J femelles de sis setmanes (20 ± 1 g) i rates Wistar mascles de 7 setmanes (250 ± 20 g) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, EUA) i l'Institut de Zoologia de Wuhan.Universitat (Wuhan, Xina).El Centre de recollida de cultura de tipus xinès (Wuhan, Xina) ens va proporcionar cèl·lules Caco-2 i hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA) és una font de B(a)P i tricaprina.Els ginsenòsids purificats G-Rg3r i G-Rg3s, sulfòxid de dimetil (DMSO), kit d'assaig de proliferació CellTiter-96 (MTS), verapamil, medi essencial mínim (MEM) i sèrum boví fetal (FBS) es van comprar a Chengdu Must Bio-Technology .Co, Ltd.(Chengdu, Xina).El kit QIAamp DNA mini i el kit ELISA d'adducte BPDE-DNA es van comprar a Qiagen (Stanford, CA, EUA) i Cell Biolabs (San Diego, CA, EUA).El kit d'assaig d'activitat GST i el kit d'assaig de proteïnes totals (mètode BCA estàndard) es van comprar a Solarbio (Beijing, Xina).Tots els extractes de ginseng vermell s'emmagatzemen al Laboratori Mingyu 7. La Universitat Baptista de Hong Kong (Hong Kong, Xina) i el Korea Cancer Center (Seül, Corea) són fonts comercials d'extracte de CRG i diversos extractes de ginseng vermell de diversos orígens coreans (incloent-hi KRGA, KRGB). i KRGC).El ginseng vermell s'elabora amb les arrels de ginseng fresc de 6 anys.L'extracte de ginseng vermell s'obté rentant el ginseng amb aigua tres vegades, després concentrant l'extracte aquós i, finalment, assecant a baixa temperatura per obtenir extracte de ginseng en pols.Es van comprar anticossos (anti-Nrf2, anti-GST i β-actina), immunoglobulina G anti-conill (IgG) conjugada amb peroxidasa de rave picant, reactiu de transfecció, siRNA de control i siRNA Nrf2 a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), EUA).
Les cèl·lules Caco2 i hEL es van cultivar en plats de cultiu cel·lular de 100 mm2 amb MEM que contenien un 10% de FBS a 37 ° C en una atmosfera humidificada d'un 5% de CO2.Per determinar l'efecte de les condicions de tractament, les cèl·lules hEL es van incubar amb diferents concentracions de B (a) P i G-Rg3 en MEM durant 48 h.Les cèl·lules es poden analitzar o recollir més per preparar extractes sense cèl·lules.
Tots els experiments van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal Experimental del Tongji Medical College, Universitat de Ciència i Tecnologia de Huazhong (núm. d'aprovació 2019; número de registre 4587TH).Tots els experiments es van realitzar d'acord amb les directrius i regulacions pertinents, i l'estudi es va dur a terme d'acord amb les directrius de Recerca en animals: Informe d'experiments in vivo (ARRIVE).Els ratolins A/J de vuit setmanes d'edat es van injectar per primera vegada per via intraperitoneal amb B (a) P en solució de tricaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Després d'una setmana, els ratolins es van dividir aleatòriament en grups de control i diferents grups de tractament, 15 ratolins a cada grup, i es van sondar una vegada al dia.Després de 20 setmanes de tractament, els animals van ser sacrificats per asfíxia de CO2.Els pulmons es van recollir i es van fixar durant 24 hores.El nombre de tumors superficials i les mides individuals del tumor es van quantificar per a cada pulmó sota un microscopi de dissecció.Les estimacions del volum del tumor (V) es van calcular mitjançant l'expressió següent: V (mm3) = 4/3πr3, on r és el diàmetre del tumor.La suma neta de tots els volums del tumor als pulmons dels ratolins va representar el volum total del tumor, i el volum total mitjà del tumor a cada grup va representar la càrrega del tumor.Es van recollir mostres de sang sencera i intestinals i es van emmagatzemar a -80 ° C per a la determinació UPLC-MS/MS.Es va recollir sèrum i es va utilitzar un analitzador químic automatitzat per analitzar els nivells d'alanina aminotransferasa (ALT) i creatinina sèrica (Cr) per avaluar la funció hepàtica i renal.
Les mostres recollides es van treure de l'emmagatzematge en fred, es van descongelar, es van pesar i es van col·locar en tubs tal com es descriu anteriorment.A això s'hi va afegir 0,5 μM de florizina (estàndard intern) en 0,8 ml de solució de metanol.A continuació, el teixit es va homogeneïtzar amb Tissue-Tearor i l'homogeneïtat es va transferir posteriorment a un tub de microcentrífuga d'1,5 ml.La mescla es va centrifugar a 15500 rpm durant 15 minuts.Després d'eliminar 1,0 ml de sobrenedant, assecar amb nitrogen.Es van utilitzar dos-cents microlitres de metanol per a la recuperació.La sang es recull i es processa en una línia i s'utilitza com a referència per a totes les mesures.
Les plaques Transwell de 24 pous es van sembrar amb 1, 0 × 105 cèl·lules Caco-2 per pou per avaluar la millora potencial del transport de G-Rg3 mitjançant l'addició de verapamil.Després de 3 setmanes de cultiu, les cèl·lules es van rentar amb HBSS i es van preincubar a 37 ° C.Es van injectar 400 μL de 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s o una barreja amb 50 o 100 μM de verapamil) al costat basolateral o apical de la monocapa i 600 μL de solució HBSS a l'altra. costat.Recollir 100 µl de medi de cultiu en els moments indicats (0, 15, 30, 45, 60, 90 i 120 minuts) i afegir 100 µl de HBSS per completar aquest volum.Les mostres es van emmagatzemar a -4 ° C fins a la detecció per UPLC-MS/MS.L'expressió Papp = dQ/(dT × A × C0) s'utilitza per quantificar la permeabilitat apical i basolateral unidireccional aparent i viceversa (Pa-b i Pb-a, respectivament);dQ/dT és el canvi de concentració, A (0,6 cm2) és la superfície de la monocapa i C0 és la concentració inicial del donant.La relació d'eflux es calcula com a Pb-a/Pa-b, que representa la taxa d'eflux del fàrmac d'estudi.
Les rates Wistar mascles van ser dejunades durant 24 hores, van beure només aigua i es van anestesiar amb una injecció intravenosa de solució de pentobarbital al 3,5%.El tub de silicona intubat té l'extrem del duodè com a entrada i l'extrem de l'ili com a sortida.Utilitzeu una bomba peristàltica per bombar l'entrada amb 10 µM de G-Rg3r o G-Rg3s en HBSS isotònic a un cabal de 0,1 ml/min.L'efecte del verapamil es va avaluar afegint 50 μM o 100 μM del compost a 10 μM de G-Rg3r o G-Rg3s.UPLC-MS/MS es va realitzar en extractes de perfusió recollits als punts de temps 60, 90, 120 i 150 minuts després de l'inici de la perfusió.El percentatge d'absorció es quantifica mitjançant la fórmula % d'absorció = (1 – Cout/Cin) × 100%;la concentració de G-Rg3 a la sortida i l'entrada s'expressa per Cout i Cin, respectivament.
Les cèl·lules hEL es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat d'1 × 104 cèl·lules per pou i es van tractar amb B (a) P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) o G-Rg3 dissolt en DMSO .A continuació, es van diluir els fàrmacs amb medi de cultiu a diverses concentracions (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) durant 48 hores.Utilitzant un kit d'assaig MTS disponible comercialment, les cèl·lules es van sotmetre a un protocol estàndard i després es van mesurar mitjançant un lector de microplaques a 490 nm.El nivell de viabilitat cel·lular dels grups cotractats amb B (a) P (10 μM) i G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) es va avaluar segons el mètode anterior i es va comparar amb el grup no tractat.
Les cèl·lules hEL es van sembrar en plaques de 6 pous a una densitat d'1 × 105 cèl·lules/pou i es van tractar amb 10 μMB (a) P en presència o absència de 10 μM G-Rg3.Després de 48 hores de tractament, es va extreure l'ADN de les cèl·lules hEL mitjançant el QIAamp DNA Mini Kit segons el protocol del fabricant.La formació d'adductes BPDE-DNA es va detectar mitjançant un kit ELISA d'adductes BPDE-DNA.Els nivells relatius d'adducte BPDE-ADN es van mesurar mitjançant un lector de microplaques mesurant l'absorbància a 450 nm.
Les cèl·lules hEL es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat d'1 × 104 cèl·lules per pou i es van tractar amb 10 μMB (a) P en absència o presència de 10 μM G-Rg3 durant 48 h.L'activitat GST es va mesurar mitjançant un kit d'assaig d'activitat GST comercial segons el protocol del fabricant.L'activació relativa de GST es va mesurar mitjançant l'absorbància a 450 nm mitjançant un lector de microplaques.
Les cèl·lules hEL es van rentar amb PBS gelat i després es van lisar mitjançant un tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació que contenia inhibidors de la proteasa i inhibidors de la fosfatasa.Després de la quantificació de proteïnes mitjançant un kit d'assaig de proteïnes totals, es van separar 30 μg de proteïna de cada mostra amb un 12% de SDS-PAGE i es van transferir a una membrana de PVDF mitjançant electroforesi.Les membranes es van bloquejar amb llet desnatada al 5% i es van incubar amb anticossos primaris durant la nit a 4 ° C.Després de la incubació amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant, es van afegir reactius de quimioluminescència millorats per visualitzar el senyal d'unió.La intensitat de cada banda de proteïnes es va quantificar mitjançant el programari ImageJ.
Es va utilitzar el programari GraphPad Prism 7.0 per analitzar totes les dades, expressades com a mitjana ± desviació estàndard.La variació entre els grups de tractament es va avaluar mitjançant la prova t de Student o l'anàlisi unidireccional de la variància, amb un valor P <0, 05 que indica significació estadística.
Totes les dades obtingudes o analitzades durant aquest estudi s'inclouen en aquest article publicat i fitxers d'informació suplementària.
Torre, LA, Siegel, RL i Jemal, A. Estadístiques del càncer de pulmó.adverbi.Caducat.medicament.biologia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Carcinògens del tabac, els seus biomarcadors i càncer induït pel tabac.Nat.Capellà del càncer.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH i Venitt, S. Adductes d'ADN i proteïnes en teixits humans derivats de l'exposició al fum del tabac.internacionalitat.J. Càncer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA i Yu M. Efecte de Houttuynia cordata i silibinina sobre la tumorigènesi pulmonar induïda per benzo(a)pirè en ratolins A/J.Càncer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Producte natural anticancerígen aïllat de materials medicinals xinesos.mandíbula.medicament.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Eficàcia del polifenó E, ginseng vermell i rapamicina en la tumorigènesi pulmonar induïda per benzo(a)pirè en ratolins A/J.Càncer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS i Yuan, KS Red, implicació en la teràpia del càncer.mandíbula.J. Nutt.medicament.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS i Gao, L. Ginsenosides a les arrels i fulles del ginseng americà.J. Agric.Química dels aliments.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA i Yuan KS Farmacologia del ginseng: molts components i molts efectes.bioquímica.farmacologia.58, 1685–1693 (1999).
Hora de publicació: 17-set-2023