Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme používat novější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme stránky bez stylů nebo JavaScriptu.
Červený ženšen se v tradiční asijské medicíně používá již stovky let.V této studii jsme hodnotili schopnost čtyř typů červeného ženšenu (čínský červený ženšen, korejský červený ženšen A, korejský červený ženšen B a korejský červený ženšen C) pěstovaných v různých oblastech inhibovat tvorbu a růst plic vyvolaných karcinogeny. nádory.Test na benzo(a)pyren (B(a)P) byl proveden na myších A/J a bylo zjištěno, že korejský červený ženšen B je nejúčinnější při snižování nádorové zátěže ze čtyř odrůd červeného ženšenu.Kromě toho jsme analyzovali obsah různých ginsenosidů (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 a Rg5) ve čtyřech extraktech z červeného ženšenu a zjistili jsme, že korejský červený ženšen B měl nejvyšší hladiny ginsenosidu Rg3 (G-Rg3), což naznačuje, že G-Rg3 může hrát důležitou roli v jeho terapeutické účinnosti.Tato práce ukazuje, že G-Rg3 má relativně nízkou biologickou dostupnost.Nicméně, když byl G-Rg3 podáván společně s P-gp inhibitorem verapamilem, eflux G-Rg3 do buněk Caco-2 byl snížen, rychlost střevní absorpce G-Rg3 byla zvýšena na potkaním modelu a G-Rg3 byla zvýšena.V buňkách Caco-2 se odtok Rg3 snižuje a hladina koncentrace Rg3 klesá.G-Rg3 je zvýšen ve střevě a plazmě a jeho schopnost předcházet nádorům je také zvýšena v krysím modelu B(a)P-indukované tumorigeneze.Také jsme zjistili, že G-Rg3 snižuje B(a)P-indukovanou cytotoxicitu a tvorbu aduktů DNA v lidských plicních buňkách a obnovuje expresi a aktivitu enzymů fáze II prostřednictvím dráhy Nrf2, což může souviset s potenciálním mechanismem účinku inhibice G -Rg3..O výskytu plicních nádorů.Naše studie demonstruje potenciálně důležitou roli G-Rg3 při cílení na plicní nádory u myších modelů.Perorální biologická dostupnost tohoto ginsenosidu je zvýšena cílením P-glykoproteinu, což umožňuje molekule vykazovat protirakovinné účinky.
Nejběžnějším typem rakoviny plic je nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), který je jednou z hlavních příčin úmrtí na rakovinu v Číně a Severní Americe1,2.Hlavním faktorem, který zvyšuje riziko vzniku nemalobuněčného karcinomu plic, je kouření.Cigaretový kouř obsahuje více než 60 karcinogenů, včetně benzo(a)pyrenu (B(a)P), nitrosaminů a radioaktivních izotopů z rozpadu radonu.3 Polycyklické aromatické uhlovodíky B(a)P jsou hlavní příčinou toxicity cigaret kouř.Po expozici B(a)P jej cytochrom P450 přemění na B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE), který reaguje s DNA za vzniku aduktu BPDE-DNA 4. adukty indukují tumorigenezi plic u myší s nádorovým stádiem a histopatologií podobnou lidským plicním nádorům5.Tato vlastnost dělá z modelu B(a)P-indukovaného karcinomu plic vhodný systém pro hodnocení sloučenin s možnými protirakovinnými vlastnostmi.
Jednou z možných strategií prevence rozvoje karcinomu plic u vysoce rizikových skupin, zejména kuřáků, je použití chemopreventivních látek k potlačení rozvoje intraepiteliálních neoplastických lézí a tím k zabránění jejich následné progrese do malignity.Studie na zvířatech ukazují, že různé chemopreventivní látky jsou účinné6.Naše předchozí zpráva7 zdůraznila dobré preventivní účinky červeného ženšenu na rakovinu plic.Tato bylina byla po staletí používána v tradiční asijské medicíně k prodloužení života a zdraví a byly prokázány její protinádorové účinky8.
Aktivním faktorem ženšenu je ginsenosid, který se používá jako kompozitní marker pro hodnocení kvality extraktů ženšenu.Kvantitativní analýza surových extraktů ženšenu typicky zahrnuje použití několika ginsenosidů, včetně RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 a Rc9,10.Ginsenosidy mají malé klinické využití kvůli jejich velmi špatné perorální biologické dostupnosti11.Ačkoli mechanismus této špatné biologické dostupnosti není jasný, příčinou může být eflux ginsenosidů způsobený P-glykoproteinem (P-gp)12.P-gp je jedním z nejdůležitějších efluxních transportérů v superrodině transportérů ATP-vazebných kazet, který využívá energii hydrolýzy ATP k uvolnění intracelulárních látek do vnějšího prostředí.Transportéry P-gp jsou typicky široce distribuovány ve střevě, ledvinách, játrech a hematoencefalické bariéře13.P-gp hraje kritickou roli ve střevní absorpci a inhibice P-gp zvyšuje perorální absorpci a dostupnost některých protirakovinných léků12,14.Příklady inhibitorů dříve používaných v literatuře jsou verapamil a cyklosporin A15.Tato práce zahrnuje vytvoření myšího systému pro studium B(a)P-indukovaného karcinomu plic pro hodnocení schopnosti různých extraktů červeného ženšenu z Číny a Koreje ovlivnit malignity.Extrakty byly individuálně analyzovány, aby se identifikovaly specifické ginsenosidy, které mohou ovlivnit karcinogenezi.Verapamil byl poté použit k cílení P-gp a zlepšení perorální biologické dostupnosti a terapeutické účinnosti ginsenosidů zaměřených na rakovinu.
Mechanismus, kterým saponiny ženšenu uplatňují terapeutické účinky na karcinogenezi, zůstává nejasný.Výzkum ukázal, že různé ginsenosidy mohou snížit poškození DNA způsobené karcinogeny snížením oxidačního stresu a aktivací detoxikačních enzymů fáze II, čímž zabraňují poškození buněk.Glutathion S-transferáza (GST) je typický enzym fáze II, který je nutný ke snížení poškození DNA způsobeného karcinogeny17.Nukleární erytroidní 2-příbuzný faktor 2 (Nrf2) je důležitý transkripční faktor, který reguluje redoxní homeostázu a aktivuje expresi enzymů fáze II a cytoprotektivní antioxidační odpovědi18.Naše studie také zkoumala účinky identifikovaných ginsenosidů na snížení B(a)P-indukované cytotoxicity a tvorby BPDE-DNA aduktu, stejně jako indukci enzymů fáze II modulací dráhy Nrf2 v normálních plicních buňkách.
Vytvoření myšího modelu B(a)P-indukované rakoviny je v souladu s předchozí prací5.Obrázek 1A ukazuje experimentální návrh 20týdenní léčby myšího modelu rakoviny indukované B(a)P, vodou (kontrola), extraktem čínského červeného ženšenu (CRG), extraktem korejského červeného ženšenu A (KRGA) a korejskou červenou ženšen.Extrakt B (KRGB) a extrakt C z korejského červeného ženšenu (KRGC).Po 20 týdnech léčby červeným ženšenem byly myši usmrceny asfyxií CO2.Obrázek 1B ukazuje makroskopické nádory plic u zvířat léčených různými typy červeného ženšenu a obrázek 1C ukazuje reprezentativní světelnou mikrosnímku vzorku nádoru.Nádorová zátěž zvířat léčených KRGB (1,5 ± 0,35) byla nižší než u kontrolních zvířat (0,82 ± 0,2, P < 0,05), jak je znázorněno na obrázku ID.Průměrný stupeň inhibice nádorové zátěže byl 45 %.Jiné testované extrakty červeného ženšenu nevykazovaly tak významné změny v nádorové zátěži (P > 0,05).Na myším modelu nebyly během 20 týdnů léčby červeným ženšenem pozorovány žádné zjevné vedlejší účinky, včetně žádné změny tělesné hmotnosti (data nejsou uvedena) a žádné toxicity pro játra nebo ledviny (obrázek 1E,F).
Extrakt z červeného ženšenu léčí rozvoj plicního nádoru u A/J myší.(A) Experimentální design.(B) Velké plicní nádory na myším modelu.Nádory jsou označeny šipkami.a: Skupina čínského červeného ženšenu.b: skupina A korejského červeného ženšenu.c: Korejský červený ženšen skupina B. d: Korejský červený ženšen skupina C. d: Kontrolní skupina.(C) Světelný mikrofotografie zobrazující nádor plic.Zvětšení: 100. b: 400. (D) Nádorová zátěž ve skupině s extraktem z červeného ženšenu.(E) Plazmatické hladiny jaterního enzymu ALT.(F) Plazmatické hladiny renálního enzymu Cr.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka.*P <0,05.
Extrakty z červeného ženšenu identifikované v této studii byly analyzovány tandemovou hmotnostní spektrometrií s ultravýkonnou kapalinovou chromatografií (UPLC-MS/MS), aby se kvantifikovaly následující ginsenosidy: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rkl a Rg5.Podmínky UPLC a MS použité k měření analytů byly popsány v předchozí zprávě19.UPLC-MS/MS chromatogramy čtyř extraktů červeného ženšenu jsou uvedeny na obrázku 2A.Byly významné rozdíly v celkovém obsahu ginsenosidu, s nejvyšším celkovým obsahem ginsenosidu v CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (obrázek 2B).Při hodnocení jednotlivých ginsenosidů (obrázek 2C) vykazoval KRGB nejvyšší hladinu G-Rg3 ve srovnání s ostatními ginsenosidy (58,33 ± 3,81 μmol/L pro G-Rg3s a 41,56 ± 2,88 μmol/L pro G -Rg3r).L).typ červený ženšen (P < 0,001).G-Rg3 se vyskytuje jako pár stereoizomerů G-Rg3r a G-Rg3s, které se liší polohou hydroxylové skupiny na uhlíku 20 (obr. 2D).Výsledky naznačují, že G-Rg3r nebo G-Rg3 mohou mít významný protirakovinný potenciál v myším modelu rakoviny indukované B(a)P.
Obsah ginsenosidů v různých extraktech z červeného ženšenu.(A) UPLC-MS/MS chromatogramy čtyř extraktů červeného ženšenu.(B) Odhad celkového obsahu ginsenosidu v uvedených extraktech.(C) Detekce jednotlivých ginsenosidů ve značených extraktech.(D) Struktury ginsenosidových stereoizomerů G-Rg3r a G-Rg3s.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka trojitých stanovení.***P <0,001.
Studie UPLC-MS/MS vyžadovala kvantifikaci ginsenosidů ve střevních a krevních vzorcích po 20 týdnech léčby.Léčba KRGB ukázala přítomnost pouze 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 v krvi.Nebyly detekovány žádné zbývající ginsenosidy, což ukazuje na špatnou orální biologickou dostupnost, a tudíž sníženou expozici těmto ginsenosidům.
Buněčná linie adenokarcinomu tlustého střeva Caco-2 je morfologicky a biochemicky podobná lidským střevním epiteliálním buňkám, což prokazuje její užitečnost při hodnocení transportu enterocytů přes střevní epiteliální bariéru.Tato analýza byla založena na dřívější studii 20 .Obrázky 3A,B,C,D,E,F ukazují reprezentativní snímky transcelulárního transportu G-Rg3r a G-Rg3 s použitím modelu monovrstvy Caco-2.Transcelulární transport G-Rg3r nebo G-Rg3 přes monovrstvy Caco-2 z bazolaterální na apikální stranu (Pb-a) byl významně vyšší než z apikální na bazolaterální stranu (Pa-b).Pro G-Rg3r byla průměrná hodnota Pa-b 0,38 ± 0,06, která se zvýšila na 0,73 ± 0,06 po léčbě 50 μmol/l verapamilu a na 1,14 ± 0,09 po léčbě 100 μmol/l verapamilu (p < 0,01 a obr. 2).3A).Pozorování pro G-Rg3 probíhala podobně (obr. 3B) a výsledky ukázaly, že léčba verapamilem zvýšila transport G-Rg3r a G-Rg3.Léčba verapamilem také vedla k významnému snížení středních efluxních poměrů Pb-a a G-Rg3r a G-Rg3s (obrázek 3C,D,E,F), což ukazuje, že léčba verapamilem snižuje obsah ginsenosidu v efluxních buňkách Caco-2..
Transcelulární transport G-Rg3 v monovrstvách Caco-2 a intestinální absorpce v testu perfuze u potkanů.(A) Hodnota Pa-b skupiny G-Rg3r v monovrstvě Caco-2.(B) Hodnota Pa-b skupin G-Rg3s v monovrstvě Caco-2.(C) Hodnota Pb skupiny G-Rg3r v monovrstvě Caco-2.(D) Hodnota Pb skupin G-Rg3s v monovrstvě Caco-2.(E) Poměr výtěžku skupin G-Rg3r v monovrstvě Caco-2.(F) Poměr výtěžku skupin G-Rg3 v monovrstvě Caco-2.(G) Procento střevní absorpce G-Rg3r v perfuzním testu u potkanů.(H) Procento střevní absorpce G-Rg3 v perfuzním testu u potkanů.Permeabilita a absorpce byly porovnány bez přidání verapamilu.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka z pěti nezávislých experimentů.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
V souladu s dřívější prací20 byla provedena ortotopická intestinální perfuze krys, aby se určilo, zda se absorpce G-Rg3 ve střevě po léčbě verapamilem zvyšuje.Obrázky 3G,H ukazují reprezentativní perfuzní testy pro hodnocení procenta intestinální absorpce G-Rg3r a G-Rg3 u krys s rakovinovým modelem během výše uvedených časových období.Počáteční procento slabého vychytávání G-Rg3r přibližně 10 % se zvýšilo na více než 20 % po léčbě 50 μM verapamilem a na více než 25 % po léčbě 100 μM verapamilem.Podobně G-Rg3, který měl počáteční absorpci 10 %, také vykázal vrchol přes 20 % po léčbě 50 μM verapamilem a téměř 30 % po léčbě 100 μM verapamilem, což naznačuje, že inhibice P-gp verapamilem zesiluje střevní G-absorpce Rg3 u myšího modelu rakoviny plic.
Podle výše uvedeného způsobu byly myši s modelem rakoviny vyvolané B(a)P náhodně rozděleny do šesti skupin, jak je znázorněno na obrázku 4A.Nebyla pozorována žádná významná ztráta hmotnosti nebo klinické známky toxicity ve skupině léčené G-Rg3 ve srovnání s kontrolní skupinou (data nejsou uvedena).Po 20 týdnech léčby byly odebrány plíce každé myši.Obrázek 4B ukazuje makroskopické nádory plic u myší ve výše uvedených léčebných skupinách a Obrázek 4C ukazuje reprezentativní světelnou mikrosnímku reprezentativního nádoru.Pokud jde o nádorovou zátěž v každé skupině (obr. 4D), hodnoty pro myši léčené G-Rg3r a G-Rg3s byly 0,75 ± 0,29 mm3, respektive 0,81 ± 0,30 mm3, zatímco hodnoty pro myši léčené G-Rg3r s -Rg3s byly 1,63 respektive ±0,40 mm3.kontrolní myši (p < 0,001), což ukazuje, že léčba G-Rg3 snížila nádorovou zátěž u myší.Podávání verapamilu toto snížení dále zvýšilo: hodnoty u verapamil+ G-Rg3r myší klesly z 0,75 ± 0,29 mm3 na 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) a hodnoty pro verapamil+ z 0,81 ± 0,30 mm3 klesly na 0,2. mm3 u myší léčených G.-Rg3s (p < 0,05), což ukazuje, že verapamil může zvýšit inhibiční účinek G-Rg3 na tumorigenezi.Nádorová zátěž nevykazovala žádné významné rozdíly mezi kontrolní skupinou a verapamilovou skupinou, skupinou G-Rg3r a skupinou G-Rg3s a skupinou verapamil+G-Rg3r a skupinou verapamil+G-Rg3s.Kromě toho nebyly zjištěny žádné významné jaterní nebo ledvinové toxicity spojené s hodnocenou léčbou (obrázek 4E,F).
Nádorová zátěž po léčbě G-Rg3 a plazmatické nebo střevní hladiny G-Rg3r a G-Rg3 v uvedených skupinách.(A) Experimentální design.(B) Makroskopické nádory na myším modelu.Nádory jsou označeny šipkami.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r v kombinaci s verapamilem.d: G-Rg3 v kombinaci s verapamilem.d: Verapamil.e: ovládání.(C) Optická mikrofotografie nádoru při zvětšení.Odpověď: 100x.b: 400X.(D) Účinek léčby G-Rg3 + verapamil na nádorovou zátěž u A/J myší.(E) Plazmatické hladiny jaterního enzymu ALT.(F) Plazmatické hladiny renálního enzymu Cr.(G) Plazmatické hladiny G-Rg3r nebo G-Rg3 uvedených skupin.(H) Hladiny G-Rg3r nebo G-Rg3s ve střevech uvedených skupin.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka trojitých stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Hladiny G-Rg3 u myší s modelem rakoviny indukované B(a)P byly hodnoceny pomocí UPLC-MS/MS po 20týdenním období léčby podle způsobu popsaného v části Metody.Obrázky 4G a H ukazují hladiny G-Rg3 v plazmě a ve střevě.Hladiny G-Rg3r v plazmě byly 0,44 ± 0,32 μmol/l a zvýšily se na 1,17 ± 0,47 μmol/l při současném podávání verapamilu (p < 0,001), zatímco hladiny G-Rg3r ve střevě byly 0,53 ± 0,08 μg/l.Při kombinaci s verapamilem se g zvýšil na 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Pro G-Rg3 výsledky sledovaly podobný vzorec, což ukazuje, že léčba verapamilem zvýšila orální biologickou dostupnost G-Rg3 u A/J myší.
Test buněčné životaschopnosti byl použit pro hodnocení cytotoxicity B(a)P a G-Rg3 na buňkách hEL.Cytotoxicita indukovaná B(a)P v buňkách hEL je ukázána na obrázku 5A, zatímco netoxické vlastnosti G-Rg3r a G-Rg3 jsou ukázány na obrázcích 5A a 5B.5B, C. Pro vyhodnocení cytoprotektivního účinku G-Rg3 byl B(a)P společně podáván s různými koncentracemi G-Rg3r nebo G-Rg3 do buněk hEL.Jak je znázorněno na obrázku 5D, G-Rg3r v koncentracích 5 μM, 10 μM a 20 μM obnovil životaschopnost buněk na 58,3 %, 79,3 % a 77,3 %.Podobné výsledky lze také pozorovat ve skupině G-Rg3s.Když byly koncentrace G-Rg3 5 uM, 10 uM a 20 uM, životaschopnost buněk byla obnovena na 58,3 %, 72,7 % a 76,7 %, v daném pořadí (obrázek 5E).).Přítomnost aduktů BPDE-DNA byla měřena pomocí soupravy ELISA.Naše výsledky ukázaly, že hladiny aduktu BPDE-DNA byly zvýšené ve skupině léčené B(a)P ve srovnání s kontrolní skupinou, ale ve srovnání se souběžnou léčbou G-Rg3 byly hladiny aduktu BPDE-DNA ve skupině B(a)P B v léčené skupině byly hladiny aduktu DNA významně sníženy.Výsledky léčby samotným B(a)P jsou uvedeny na obrázku 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 pro G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 pro G-Rg3s, p < 0,001).
Životaschopnost buněk a tvorba aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL ošetřených G-Rg3 a B(a)P.(A) Životaschopnost buněk hEL ošetřených B(a)P.(B) Životaschopnost buněk hEL ošetřených G-Rg3r.(C) Životaschopnost buněk hEL ošetřených G-Rg3.(D) Životaschopnost buněk hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3r.(E) Životaschopnost buněk hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3.(F) Hladiny aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka trojitých stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Exprese enzymu GST byla detekována po společné léčbě s 10 μM B(a)P a 10 μM G-Rg3r nebo G-Rg3s.Naše výsledky ukázaly, že B(a)P suprimoval expresi GST (59,7 ± 8,2 % ve skupině G-Rg3r a 39 ± 4,5 % ve skupině G-Rg3s) a B(a)P byl spojen buď s G-Rg3r nebo s G-Rg3r, nebo s G-Rg3r.Současná léčba s G-Rg3 obnovila expresi GST.Exprese GST (103,7 ± 15,5 % ve skupině G-Rg3r a 110 ± 11,1 % ve skupině G-Rg3s, p < 0,05 a p < 0,001, v tomto pořadí, obr. 6A, B a C).Aktivita GST byla hodnocena pomocí soupravy pro stanovení aktivity.Naše výsledky ukázaly, že skupina s kombinovanou léčbou měla vyšší aktivitu GST ve srovnání se skupinou pouze B(a)P (96,3 ± 6,6 % vs. 35,7 ± 7,8 % ve skupině G-Rg3r vs. 92,3 ± 6,5 % ve skupině G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8 % ve skupině G-Rg3s, p < 0,001, obrázek 6D).
Exprese GST a Nrf2 v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3.(A) Detekce exprese GST pomocí Western blotu.(B) Kvantitativní exprese GST v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3r.(C) Kvantitativní exprese GST v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3s.(D) Aktivita GST v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3.(E) Detekce exprese Nrf2 pomocí Western blotu.(F) Kvantitativní exprese Nrf2 v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3r.(G) Kvantitativní exprese Nrf2 v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3s.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka trojitých stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Pro objasnění drah zapojených do G-Rg3-zprostředkované suprese B(a)P-indukované tumorigeneze byla exprese Nrf2 hodnocena pomocí Western blottingu.Jak je znázorněno na obrázcích 6E,F,G, ve srovnání s kontrolní skupinou byla snížena pouze hladina Nrf2 ve skupině léčené B(a)P;avšak ve srovnání s léčebnou skupinou B(a)P byly hladiny B(a) Nrf2 ve skupině PG-Rg3 zvýšeny (106 ± 9,5 % pro G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6,2 % pro G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % pro G-Rg3s, p < 0,01).
Preventivní roli Nrf2 jsme potvrdili potlačením exprese Nrf2 pomocí specifické malé interferující RNA (siRNA).Knockdown Nrf2 byl potvrzen Western blotem (obr. 7A,B).Jak je znázorněno na obrázcích 7C,D, společné ošetření buněk hEL s B(a)P a G-Rg3 vedlo ke snížení počtu aduktů BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) ve srovnání s ošetřením B(a)P samotný v kontrolní skupině siRNA.) G-Rg3r byl 4,13 ± 0,49, G-Rg3s byl 1,8 ± 0,32 a 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Nicméně inhibiční účinek G-Rg3 na tvorbu BPDE-DNA byl zrušen knockdownem Nrf2.Ve skupině siNrf2 nebyl žádný významný rozdíl ve tvorbě aduktu BPDE-DNA mezi souběžnou léčbou B(a)P a G-Rg3 a samotnou léčbou B(a)P (3,0 ± 0,21 pro G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).pro G-Rg3r versus 3,6 pro G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Účinek knockdownu Nrf2 na tvorbu aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL.(A) Knockdown Nrf2 byl potvrzen Western blotem.(B) Kvantifikace intenzity pásma Nrf2.(C) Účinek knockdownu Nrf2 na hladiny aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3r.(D) Účinek knockdownu Nrf2 na hladiny aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL ošetřených B(a)P a G-Rg3.Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka trojitých stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Tato studie hodnotila preventivní účinky různých extraktů z červeného ženšenu na myším modelu rakoviny plic vyvolané B(a)P a léčba KRGB významně snížila nádorovou zátěž.Vzhledem k tomu, že G-Rg3 má v tomto extraktu ženšenu nejvyšší obsah, byla studována důležitá úloha tohoto ginsenosidu při inhibici tumorigeneze.Jak G-Rg3r, tak G-Rg3 (dva epimery G-Rg3) významně snížily nádorovou zátěž v myším modelu B(a)P-indukované rakoviny.G-Rg3r a G-Rg3 vykazují protirakovinné účinky tím, že indukují apoptózu nádorových buněk21, inhibují růst nádoru22, zastavují buněčný cyklus23 a ovlivňují angiogenezi24.Bylo také prokázáno, že G-Rg3 inhibuje buněčné metastázy25 a schopnost G-Rg3 zvyšovat účinky chemoterapie a radioterapie byla zdokumentována26,27.Poon et al prokázali, že léčba G-Rg3 by mohla snížit genotoxické účinky B(a)P28.Tato studie demonstruje terapeutický potenciál G-Rg3 při cílení na environmentální karcinogenní molekuly a prevenci rakoviny.
Přes jejich dobrý profylaktický potenciál představuje špatná orální biologická dostupnost ginsenosidů výzvu pro klinické použití těchto molekul.Farmakokinetická analýza perorálního podávání ginsenosidů u potkanů ukázala, že jejich biologická dostupnost je stále nižší než 5 %29.Tyto testy ukázaly, že po 20týdenním období léčby se snížily pouze hladiny Rg5 v krvi.Ačkoli základní mechanismus špatné biologické dostupnosti musí být ještě objasněn, předpokládá se, že P-gp se podílí na efluxu ginsenosidů.Tato práce poprvé prokázala, že podávání verapamilu, blokátoru P-gp, zvyšuje orální biologickou dostupnost G-Rg3r a G-Rg3s.Toto zjištění tedy naznačuje, že G-Rg3r a G-Rg3s působí jako substráty P-gp pro regulaci jeho efluxu.
Tato práce ukazuje, že kombinovaná léčba s verapamilem zvyšuje orální biologickou dostupnost G-Rg3 u myšího modelu rakoviny plic.Toto zjištění je podpořeno zvýšeným střevním transcelulárním transportem G-Rg3 po blokádě P-gp, čímž se zvyšuje jeho absorpce.Testy na buňkách Caco2 ukázaly, že léčba verapamilem snížila eflux G-Rg3r a G-Rg3s a zároveň zlepšila permeabilitu membrány.Studie Yang et al.Studie prokázaly, že léčba cyklosporinem A (další blokátor P-gp) zvyšuje biologickou dostupnost ginsenosidu Rh2 z výchozí hodnoty 1 %20 na více než 30 %.Ginsenosidové sloučeniny K a Rg1 rovněž vykazovaly podobné výsledky30,31.Když byly verapamil a cyklosporin A podávány současně, eflux sloučeniny K v buňkách Caco-2 se významně snížil z 26,6 na méně než 3, zatímco její intracelulární hladiny se zvýšily 40krát30.V přítomnosti verapamilu se hladiny Rg1 zvýšily v krysích plicních epiteliálních buňkách, což naznačuje roli P-gp v efluxu ginsenosidu, jak ukazuje Meng et al.31.Verapamil však neměl stejný účinek na eflux některých ginsenosidů (jako jsou Rg1, F1, Rh1 a Re), což naznačuje, že nejsou ovlivněny substráty P-gp, jak ukazuje Liang et al.32.Toto pozorování může souviset se zapojením jiných přenašečů a alternativních struktur ginsenosidu.
Mechanismus preventivního účinku G-Rg3 na rakovinu je nejasný.Předchozí studie ukázaly, že G-Rg3 zabraňuje poškození DNA a apoptóze snížením oxidačního stresu a zánětu16,33, což může být základní mechanismus pro prevenci tumorigeneze indukované B(a)P.Některé zprávy naznačují, že genotoxicitu indukovanou B(a)P lze snížit modulací enzymů fáze II za vzniku BPDE-DNA34.GST je typický enzym fáze II, který inhibuje tvorbu aduktu BPDE-DNA podporou vazby GSH na BPDE, čímž snižuje poškození DNA indukované B(a)P35.Naše výsledky ukazují, že léčba G-Rg3 snižuje B(a)P-indukovanou cytotoxicitu a tvorbu aduktu BPDE-DNA v buňkách hEL a obnovuje expresi a aktivitu GST in vitro.Tyto účinky však chyběly v nepřítomnosti Nrf2, což naznačuje, že G-Rg3 indukuje cytoprotektivní účinky prostřednictvím dráhy Nrf2.Nrf2 je hlavním transkripčním faktorem pro detoxikační enzymy fáze II, který podporuje clearance xenobiotik36.Aktivace dráhy Nrf2 indukuje cytoprotekci a snižuje poškození tkáně37.Kromě toho několik zpráv podpořilo úlohu Nrf2 jako supresoru nádoru v karcinogenezi38.Naše studie ukazuje, že indukce dráhy Nrf2 pomocí G-Rg3 hraje důležitou regulační roli v genotoxicitě indukované B(a)P tím, že způsobuje detoxikaci B(a)P aktivací enzymů fáze II, čímž inhibuje proces tumorigeneze.
Naše práce odhaluje potenciál červeného ženšenu v prevenci rakoviny plic vyvolané B(a)P u myší prostřednictvím důležitého zapojení ginsenosidu G-Rg3.Špatná orální biologická dostupnost této molekuly brání její klinické aplikaci.Tato studie však poprvé ukazuje, že G-Rg3 je substrátem P-gp a podávání inhibitoru P-gp zvyšuje biologickou dostupnost G-Rg3 in vitro a in vivo.G-Rg3 snižuje B(a)P-indukovanou cytotoxicitu regulací dráhy Nrf2, což může být potenciální mechanismus pro jeho preventivní funkci.Naše studie potvrzuje potenciál ginsenosidu G-Rg3 pro prevenci a léčbu rakoviny plic.
Šesttýdenní samice myší A/J (20 ± 1 g) a 7 týdnů staří samci krys Wistar (250 ± 20 g) byli získáni z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) a Wuhan Institute of Zoology.Univerzita (Wuhan, Čína).Čínské centrum sběru typových kultur (Wuhan, Čína) nám poskytlo buňky Caco-2 a hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) je zdrojem B(a)P a trikaprinu.Purifikované ginsenosidy G-Rg3r a G-Rg3s, dimethylsulfoxid (DMSO), souprava pro stanovení proliferace CellTiter-96 (MTS), verapamil, minimální esenciální médium (MEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly zakoupeny od Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Čcheng-tu, Čína).QIAamp DNA mini kit a BPDE-DNA adukt ELISA kit byly zakoupeny od Qiagen (Stanford, CA, USA) a Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).Souprava pro stanovení aktivity GST a souprava pro stanovení celkového proteinu (standardní metoda BCA) byly zakoupeny od společnosti Solarbio (Peking, Čína).Všechny extrakty z červeného ženšenu jsou uloženy v laboratoři Mingyu 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Čína) a Korea Cancer Center (Soul, Korea) jsou komerčními zdroji extraktu CRG a různých extraktů červeného ženšenu různého korejského původu (včetně KRGA, KRGB a KRGC).Červený ženšen se vyrábí z kořenů 6letého čerstvého ženšenu.Extrakt z červeného ženšenu se získává promytím ženšenu třikrát vodou, poté zahuštěním vodného extraktu a nakonec sušením při nízké teplotě, aby se získal prášek z extraktu ženšenu.Protilátky (anti-Nrf2, anti-GST a β-aktin), anti-králičí imunoglobulin G (IgG) konjugovaný s křenovou peroxidázou, transfekční činidlo, kontrolní siRNA a Nrf2 siRNA byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Buňky Caco2 a hEL byly kultivovány na 100 mm2 buněčných kultivačních miskách s MEM obsahujícím 10 % FBS při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 % C02.Pro stanovení účinku podmínek ošetření byly buňky hEL inkubovány s různými koncentracemi B(a)P a G-Rg3 v MEM po dobu 48 hodin.Buňky mohou být dále analyzovány nebo shromážděny pro přípravu bezbuněčných extraktů.
Všechny experimenty byly schváleny Etickým výborem pro experimentální zvířata Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (č. schválení 2019; registrační číslo 4587TH).Všechny experimenty byly provedeny v souladu s příslušnými směrnicemi a předpisy a studie byla provedena v souladu se směrnicemi Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE).Osmitýdenní myši A/J byly nejprve intraperitoneálně injikovány B(a)P v roztoku trikaprinu (100 mg/kg, 0,2 ml).Po týdnu byly myši náhodně rozděleny do kontrolních skupin a různých léčebných skupin, 15 myší v každé skupině, a jednou denně jim byla podávána žaludeční sonda.Po 20 týdnech léčby byla zvířata usmrcena asfyxií CO2.Plíce byly odebrány a fixovány po dobu 24 hodin.Počet povrchových nádorů a jednotlivé velikosti nádorů byly kvantifikovány pro každou plíci pod disekčním mikroskopem.Odhady objemu nádoru (V) byly vypočteny pomocí následujícího výrazu: V (mm3) = 4/3πr3, kde r je průměr nádoru.Čistý součet všech objemů nádoru v plicích myší představoval celkový objem nádoru a průměrný celkový objem nádoru v každé skupině představoval zatížení nádorem.Vzorky plné krve a střev byly odebrány a skladovány při -80 °C pro stanovení UPLC-MS/MS.Sérum bylo odebráno a automatický chemický analyzátor byl použit k analýze hladin alaninaminotransferázy (ALT) a sérového kreatininu (Cr) k posouzení funkce jater a ledvin.
Odebrané vzorky byly vyjmuty z chladírenského skladu, rozmraženy, zváženy a umístěny do zkumavek, jak je popsáno výše.K tomu byl přidán 0,5 uM florizin (vnitřní standard) v 0,8 ml roztoku methanolu.Tkáň byla poté homogenizována pomocí Tissue-Tearor a homogenát byl následně přenesen do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky.Směs byla centrifugována při 15500 ot./min. po dobu 15 minut.Po odstranění 1,0 ml supernatantu se suší dusíkem.K regeneraci bylo použito dvě stě mikrolitrů methanolu.Krev se odebírá a zpracovává na jedné lince a používá se jako referenční pro všechna měření.
24jamkové destičky Transwell byly naočkovány 1,0 x 105 Caco-2 buněk na jamku, aby se vyhodnotilo potenciální zvýšení transportu G-Rg3 přidáním verapamilu.Po 3 týdnech kultivace byly buňky promyty HBSS a preinkubovány při 37 °C.400 μl 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s nebo směs s 50 nebo 100 μM verapamilu) bylo injikováno na bazolaterální nebo apikální stranu monovrstvy a 600 μl roztoku HBSS bylo přidáno do druhé boční.Odeberte 100 µl kultivačního média v určených časech (0, 15, 30, 45, 60, 90 a 120 minut) a přidejte 100 µl HBSS pro doplnění tohoto objemu.Vzorky byly skladovány při -4 °C až do detekce pomocí UPLC-MS/MS.Výraz Papp = dQ/(dT × A × C0) se používá ke kvantifikaci zjevné jednosměrné apikální a bazolaterální permeability a naopak (Pa-b a Pb-a);dQ/dT je změna koncentrace, A (0,6 cm2) je povrchová plocha monovrstvy a C0 je počáteční koncentrace donoru.Poměr efluxu se vypočítá jako Pb-a/Pa-b, což představuje rychlost efluxu studovaného léčiva.
Samci krys Wistar byli 24 hodin nalačno, pili pouze vodu a anestetizovali intravenózní injekcí 3,5% roztoku pentobarbitalu.Intubovaná silikonová hadička má konec duodena jako vstup a konec ilea jako výstup.Použijte peristaltické čerpadlo k čerpání vstupu s 10 µM G-Rg3r nebo G-Rg3s v izotonickém HBSS při průtoku 0,1 ml/min.Účinek verapamilu byl hodnocen přidáním 50 μM nebo 100 μM sloučeniny k 10 μM G-Rg3r nebo G-Rg3s.UPLC-MS/MS byla provedena na perfuzních extraktech odebraných v časových bodech 60, 90, 120 a 150 minut po začátku perfuze.Procento absorpce je kvantifikováno vzorcem % absorpce = (1 – Cout/Cin) × 100 %;koncentrace G-Rg3 na výstupu a vstupu je vyjádřena pomocí Cout a Cin.
hEL buňky byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 1 x 104 buněk na jamku a ošetřeny B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 uM) nebo G-Rg3 rozpuštěným v DMSO .Léčiva byla poté naředěna kultivačním médiem na různé koncentrace (0, 1, 2, 5, 10, 20 uM) během 48 hodin.Pomocí komerčně dostupné testovací soupravy MTS byly buňky podrobeny standardnímu protokolu a poté měřeny pomocí čtečky mikrodestiček při 490 nm.Úroveň životaschopnosti buněk u skupin současně léčených B(a)P (10 μM) a G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) byla hodnocena podle výše uvedené metody a porovnána s neošetřenou skupinou.
hEL buňky byly nasazeny do 6-jamkových destiček v hustotě 1 x 105 buněk/jamka a ošetřeny 10 μMB(a)P v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 μM G-Rg3.Po 48 hodinách působení byla DNA extrahována z buněk hEL pomocí sady QIAamp DNA Mini Kit podle protokolu výrobce.Tvorba BPDE-DNA aduktů byla detekována pomocí BPDE-DNA aduktu ELISA kitu.Relativní hladiny aduktu BPDE-DNA byly měřeny pomocí čtečky mikrodestiček měřením absorbance při 450 nm.
hEL buňky byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 1 x 104 buněk na jamku a ošetřeny 10 μMB (a) P v nepřítomnosti nebo přítomnosti 10 μM G-Rg3 po dobu 48 hodin.Aktivita GST byla měřena za použití komerční soupravy pro stanovení aktivity GST podle protokolu výrobce.Relativní aktivace GST byla měřena absorbancí při 450 nm za použití čtečky mikrodestiček.
hEL buňky byly promyty ledově chladným PBS a poté lyžovány za použití radioimunoprecipitačního testovacího pufru obsahujícího inhibitory proteázy a inhibitory fosfatázy.Po kvantifikaci proteinu pomocí soupravy pro stanovení celkového proteinu bylo 30 ug proteinu v každém vzorku separováno pomocí 12% SDS-PAGE a přeneseno na PVDF membránu elektroforézou.Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem a inkubovány s primárními protilátkami přes noc při 4 °C.Po inkubaci se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou byla přidána zesílená chemiluminiscenční činidla pro vizualizaci vazebného signálu.Intenzita každého proteinového pásu byla kvantifikována pomocí softwaru ImageJ.
K analýze všech dat, vyjádřených jako průměr ± standardní odchylka, byl použit software GraphPad Prism 7.0.Variace mezi léčebnými skupinami byla hodnocena pomocí Studentova t testu nebo jednosměrné analýzy rozptylu, s hodnotou P <0,05 indikující statistickou významnost.
Všechna data získaná nebo analyzovaná během této studie jsou zahrnuta v tomto publikovaném článku a doplňkových informačních souborech.
Torre, LA, Siegel, RL a Jemal, A. Statistika rakoviny plic.příslovce.Platnost vypršela.lék.biologie.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tabákové karcinogeny, jejich biomarkery a rakovina vyvolaná tabákem.Nat.Kaplan pro rakovinu.3, 733-744 (2003).
Phillips, DH a Venitt, S. DNA a proteinové adukty v lidských tkáních vyplývající z expozice tabákovému kouři.mezinárodnost.J. Cancer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA a Yu M. Účinek Houttuynia cordata a silibininu na benzo(a)pyrenem indukovanou tumorigenezi plic u A/J myší.Rak 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. a kol.Protirakovinný přírodní produkt izolovaný z čínských léčivých materiálů.čelist.lék.6, 27 (2011).
Yang, Y. a kol.Účinnost polyfenonu E, červeného ženšenu a rapamycinu na benzo(a)pyrenem indukovanou tumorigenezi plic u A/J myší.Rakovina 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS a Yuan, KS Red, zapojení do terapie rakoviny.čelist.J. Nutt.lék.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS a Gao, L. Ginsenosidy v kořenech a listech amerického ženšenu.J. Agric.Chemie potravin.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA a Yuan KS Farmakologie ženšenu: mnoho složek a mnoho účinků.biochemie.farmakologie.58, 1685-1693 (1999).
Čas odeslání: 17. září 2023