Tak fordi du besøgte Nature.com.Den version af browseren, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For de bedste resultater anbefaler vi at bruge en nyere version af din browser (eller at slå kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre løbende support, viser vi siden uden styling eller JavaScript.
Rød ginseng er blevet brugt i traditionel asiatisk medicin i hundreder af år.I denne undersøgelse evaluerede vi evnen hos fire typer rød ginseng (kinesisk rød ginseng, koreansk rød ginseng A, koreansk rød ginseng B og koreansk rød ginseng C) dyrket i forskellige regioner til at hæmme dannelsen og væksten af kræftfremkaldt lunge tumorer.En benzo(a)pyren (B(a)P)-test blev udført på A/J-mus, og koreansk rød ginseng B viste sig at være den mest effektive til at reducere tumorbyrden blandt de fire røde ginseng-varianter.Derudover analyserede vi indholdet af forskellige ginsenosider (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 og Rg5) i fire røde ginsengekstrakter og fandt ud af, at koreansk rød ginseng B havde de højeste niveauer af ginsenosid Rg3 (G-Rg3), hvilket tyder på, at G-Rg3 kan spille en vigtig rolle i dets terapeutiske effekt.Dette arbejde viser, at G-Rg3 har relativt lav biotilgængelighed.Men når G-Rg3 blev administreret sammen med P-gp-hæmmeren verapamil, blev effluxen af G-Rg3 ind i Caco-2-celler reduceret, hastigheden af tarmabsorption af G-Rg3 blev øget i en rottemodel, og G-Rg3 blev øget.I Caco-2-celler falder udstrømningen af Rg3, og niveauet af Rg3-koncentration falder.G-Rg3 øges i tarmen og plasmaet, og dets evne til at forhindre tumorer er også forbedret i en rottemodel af B(a)P-induceret tumorigenese.Vi fandt også, at G-Rg3 reducerede B(a)P-induceret cytotoksicitet og DNA-adduktdannelse i humane lungeceller og genoprettede ekspressionen og aktiviteten af fase II-enzymer gennem Nrf2-vejen, hvilket kan være relateret til den potentielle virkningsmekanisme. af G-inhibering -Rg3..Om forekomsten af lungetumorer.Vores undersøgelse viser en potentielt vigtig rolle for G-Rg3 i målretning af lungetumorer i musemodeller.Den orale biotilgængelighed af dette ginsenosid forbedres ved at målrette P-glycoprotein, hvilket tillader molekylet at udøve anticancer-effekter.
Den mest almindelige type lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som er en af de førende årsager til kræftdødsfald i Kina og Nordamerika1,2.Den vigtigste faktor, der øger risikoen for at udvikle ikke-småcellet lungekræft, er rygning.Cigaretrøg indeholder mere end 60 kræftfremkaldende stoffer, herunder benzo(a)pyren (B(a)P), nitrosaminer og radioaktive isotoper fra henfaldet af radon.3 Polycykliske aromatiske kulbrinter B(a)P er hovedårsagen til toksicitet i cigaretter røg.Ved eksponering for B(a)P omdanner cytochrom P450 det til B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE), som reagerer med DNA og danner BPDE-DNA-addukt 4. Derudover er disse addukter inducerer lungetumorgenese hos mus med tumorstadie og histopatologi svarende til humane lungetumorer5.Denne funktion gør den B(a)P-inducerede lungecancermodel til et egnet system til evaluering af forbindelser med mulige anticanceregenskaber.
En mulig strategi til at forhindre udviklingen af lungekræft i højrisikogrupper, især rygere, er brugen af kemopræventive midler til at undertrykke udviklingen af intraepiteliale neoplastiske læsioner og derved forhindre deres efterfølgende progression til malignitet.Dyreforsøg viser, at forskellige kemopræventive midler er effektive6.Vores tidligere rapport7 fremhævede de gode forebyggende virkninger af rød ginseng på lungekræft.Denne urt er blevet brugt i århundreder i traditionel asiatisk medicin til at forlænge liv og sundhed, og er blevet dokumenteret at have antitumoreffekter8.
Den aktive faktor i ginseng er ginsenosid, som bruges som en sammensat markør til at evaluere kvaliteten af ginsengekstrakter.Kvantitativ analyse af rå ginsengekstrakter involverer typisk brugen af flere ginsenosider, herunder RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 og Rc9,10.Ginsenosider har kun ringe klinisk brug på grund af deres meget dårlige orale biotilgængelighed11.Selvom mekanismen for denne dårlige biotilgængelighed ikke er klar, kan udstrømningen af ginsenosider forårsaget af P-glycoprotein (P-gp)12 være årsagen.P-gp er en af de vigtigste effluxtransportører i den ATP-bindende kassettetransportør-superfamilie, som bruger energien fra ATP-hydrolyse til at frigive intracellulære stoffer til det ydre miljø.P-gp-transportører er typisk vidt udbredt i tarm-, nyre-, lever- og blod-hjerne-barrieren13.P-gp spiller en kritisk rolle i intestinal absorption, og hæmning af P-gp øger den orale absorption og tilgængelighed af nogle kræftlægemidler12,14.Eksempler på inhibitorer tidligere anvendt i litteraturen er verapamil og cyclosporin A15.Dette arbejde involverer etablering af et musesystem til undersøgelse af B(a)P-induceret lungekræft for at evaluere evnen af forskellige røde ginsengekstrakter fra Kina og Korea til at påvirke maligniteter.Ekstrakterne blev individuelt analyseret for at identificere specifikke ginsenosider, der kan påvirke carcinogenese.Verapamil blev derefter brugt til at målrette P-gp og forbedre den orale biotilgængelighed og terapeutiske effektivitet af cancer-målrettede ginsenosider.
Mekanismen, hvorved ginseng-saponiner udøver terapeutiske virkninger på carcinogenese, er stadig uklar.Forskning har vist, at forskellige ginsenosider kan reducere DNA-skader forårsaget af kræftfremkaldende stoffer ved at reducere oxidativt stress og aktivere fase II-afgiftningsenzymer og derved forhindre celleskader.Glutathion S-transferase (GST) er et typisk fase II-enzym, der er påkrævet for at reducere DNA-skader forårsaget af kræftfremkaldende stoffer17.Nuklear erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2) er en vigtig transkriptionsfaktor, der regulerer redox-homeostase og aktiverer ekspressionen af fase II-enzymer og cytobeskyttende antioxidantrespons18.Vores undersøgelse undersøgte også virkningerne af identificerede ginsenosider på reduktion af B(a)P-induceret cytotoksicitet og BPDE-DNA-adduktdannelse samt induktion af fase II-enzymer ved at modulere Nrf2-vejen i normale lungeceller.
Etableringen af en musemodel for B(a)P-induceret cancer er i overensstemmelse med tidligere arbejde5.Figur 1A viser det eksperimentelle design af en 20-ugers behandling af en musekræftmodel induceret af B(a)P, vand (kontrol), kinesisk rød ginsengekstrakt (CRG), koreansk rød ginsengekstrakt A (KRGA) og koreansk rød ginseng.Ekstrakt B (KRGB) og koreansk rød ginsengekstrakt C (KRGC).Efter 20 ugers behandling med rød ginseng blev mus aflivet ved CO2-kvælning.Figur 1B viser makroskopiske lungetumorer hos dyr behandlet med forskellige typer rød ginseng, og figur 1C viser et repræsentativt lysmikrobillede af en tumorprøve.Tumorbyrden for KRGB-behandlede dyr (1,5 ± 0,35) var lavere end for kontroldyr (0,82 ± 0,2, P < 0,05), som vist i figur 1D.Den gennemsnitlige grad af tumorbelastningsinhibering var 45%.Andre testede røde ginsengekstrakter viste ikke så signifikante ændringer i tumorbyrden (P > 0,05).Ingen åbenlyse bivirkninger blev observeret i musemodellen under 20 ugers behandling med rød ginseng, inklusive ingen ændring i kropsvægt (data ikke vist) og ingen lever- eller nyretoksicitet (figur 1E,F).
Rød ginseng-ekstrakt behandler udvikling af lungetumor hos A/J-mus.(A) Eksperimentelt design.(B) Store lungetumorer i en musemodel.Tumorer er angivet med pile.a: Kinesisk rød ginseng gruppe.b: gruppe A af koreansk rød ginseng.c: Koreansk rød ginseng gruppe B. d: Koreansk rød ginseng gruppe C. d: Kontrolgruppe.(C) Lysmikrofotografi, der viser en lungetumor.Forstørrelse: 100. b: 400. (D) Tumorbelastning i gruppen med rød ginsengekstrakt.(E) Plasmaniveauer af leverenzymet ALT.(F) Plasmaniveauer af nyreenzymet Cr.Data er udtrykt som middel ± standardafvigelse.*P <0,05.
De røde ginsengekstrakter identificeret i denne undersøgelse blev analyseret ved ultra-performance væskekromatografi tandem massespektrometri (UPLC-MS/MS) for at kvantificere følgende ginsenosider: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 og Rg5.UPLC- og MS-betingelserne, der blev brugt til at måle analytterne, blev beskrevet i en tidligere rapport19.UPLC-MS/MS-kromatogrammer af fire røde ginsengekstrakter er vist i figur 2A.Der var signifikante forskelle i det totale ginsenosidindhold, med det højeste totale ginsenosidindhold i CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figur 2B).Ved evaluering af individuelle ginsenosider (Figur 2C) viste KRGB det højeste niveau af G-Rg3 sammenlignet med andre ginsenosider (58,33 ± 3,81 μmol/L for G-Rg3s og 41,56 ± 2,88 μmol/L for G-Rg3r).L).rød ginseng type (P < 0,001).G-Rg3 forekommer som et par stereoisomerer G-Rg3r og G-Rg3s, som adskiller sig i positionen af hydroxylgruppen ved carbon 20 (fig. 2D).Resultaterne indikerer, at G-Rg3r eller G-Rg3 kan have et vigtigt anticancerpotentiale i en B(a)P-induceret cancermusemodel.
Indhold af ginsenosider i forskellige røde ginsengekstrakter.(A) UPLC-MS/MS kromatogrammer af fire røde ginsengekstrakter.(B) Estimering af det samlede ginsenosidindhold i de angivne ekstrakter.(C) Påvisning af individuelle ginsenosider i mærkede ekstrakter.(D) Strukturer af ginsenosid stereoisomerer G-Rg3r og G-Rg3s.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser.***P <0,001.
UPLC-MS/MS-undersøgelsen krævede kvantificering af ginsenosider i tarm- og blodprøver efter 20 ugers behandling.Behandling med KRGB viste kun tilstedeværelsen af 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 i blodet.Ingen resterende ginsenosider blev påvist, hvilket indikerer dårlig oral biotilgængelighed og derfor reduceret eksponering for disse ginsenosider.
Colon adenocarcinomcellelinjen Caco-2 ligner morfologisk og biokemisk humane tarmepitelceller, hvilket viser dens anvendelighed til at vurdere enterocyttransport over tarmepitelbarrieren.Denne analyse var baseret på en tidligere undersøgelse 20 .Figur 3A, B, C, D, E, F viser repræsentative billeder af transcellulær transport af G-Rg3r og G-Rg3 under anvendelse af en Caco-2 monolagsmodel.Transcellulær transport af G-Rg3r eller G-Rg3 på tværs af Caco-2 monolag fra den basolaterale til den apikale side (Pb-a) var signifikant højere end fra den apikale til den basolaterale side (Pa-b).For G-Rg3r var den gennemsnitlige Pa-b-værdi 0,38 ± 0,06, hvilket steg til 0,73 ± 0,06 efter behandling med 50 μmol/L verapamil og til 1,14 ± 0,09 efter behandling med 100 μmol/L verapamil (p < 0,01 og henholdsvis figur 2).3A).Observationer for G-Rg3 fulgte et lignende mønster (fig. 3B), og resultaterne viste, at verapamilbehandling forbedrede transporten af G-Rg3r og G-Rg3.Verapamil-behandling resulterede også i et signifikant fald i gennemsnitlige Pb-a og G-Rg3r og G-Rg3s effluxforhold (figur 3C,D,E,F), hvilket indikerer, at verapamilbehandling reducerer ginsenosidindholdet i Caco-2 effluxceller..
Transcellulær transport af G-Rg3 i Caco-2 monolag og intestinal absorption i et rotteperfusionsassay.(A) Pa-b værdi af G-Rg3r gruppe i Caco-2 monolag.(B) Pa-b værdi af G-Rg3s grupper i Caco-2 monolag.(C) Pb-værdi af G-Rg3r-gruppen i Caco-2 monolag.(D) Pb-værdi af G-Rg3s-grupper i Caco-2-monolag.(E) Udbytteforhold for G-Rg3r-grupper i et Caco-2-monolag.(F) Udbytteforhold for G-Rg3-grupper i et Caco-2-monolag.(G) Procentdel af intestinal absorption af G-Rg3r i et perfusionsassay hos rotter.(H) Procentdel af tarmabsorption af G-Rg3 i et perfusionsassay hos rotter.Permeabilitet og absorption blev sammenlignet uden tilsætning af verapamil.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af fem uafhængige eksperimenter.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
I overensstemmelse med tidligere arbejde20 blev der udført ortotopisk intestinal perfusion af rotter for at bestemme, om G-Rg3-absorptionen i tarmen øges efter verapamil-behandling.Figur 3G,H viser repræsentative perfusionsassays til evaluering af procentdelen af intestinal absorption af G-Rg3r og G-Rg3 i cancermodelrotter i de ovennævnte tidsperioder.Den initiale procentdel af svag G-Rg3r-optagelse på ca. 10 % steg til mere end 20 % efter behandling med 50 μM verapamil og til mere end 25 % efter behandling med 100 μM verapamil.Ligeledes viste G-Rg3, som havde en initial optagelse på 10 %, også en top på over 20 % efter behandling med 50 μM verapamil og næsten 30 % efter behandling med 100 μM verapamil, hvilket tyder på, at hæmning af P-gp med verapamil øger intestinal G-absorption Rg3 i en musemodel af lungekræft.
Ifølge ovenstående metode blev B(a)P-inducerede cancermodelmus tilfældigt opdelt i seks grupper, som vist i figur 4A.Ingen signifikant vægttab eller kliniske tegn på toksicitet blev observeret i G-Rg3-behandlingsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (data ikke vist).Efter 20 ugers behandling blev lungerne fra hver mus opsamlet.Figur 4B viser makroskopiske lungetumorer i mus i de ovennævnte behandlingsgrupper, og figur 4C viser et repræsentativt lysmikrobillede af en repræsentativ tumor.Med hensyn til tumorbyrden i hver gruppe (fig. 4D) var værdierne for mus behandlet med G-Rg3r og G-Rg3s henholdsvis 0,75 ± 0,29 mm3 og 0,81 ± 0,30 mm3, mens værdierne for G-mus behandlede med -Rg3s var 1,63 henholdsvis ±0,40 mm3.kontrolmus (p < 0,001), hvilket indikerer, at G-Rg3-behandling reducerede tumorbyrden hos mus.Administration af verapamil forstærkede denne reduktion yderligere: værdier i verapamil+ G-Rg3r-mus faldt fra 0,75 ± 0,29 mm3 til 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), og værdier for verapamil+ fra 0,81 ± 0,30,30 mm3 faldt til 0,30 mm3 ± 0,0. mm3 i G.-Rg3s-behandlede mus (p < 0,05), hvilket indikerer, at verapamil kan forstærke den hæmmende virkning af G-Rg3 på tumorgenese.Tumorbelastningen viste ingen signifikante forskelle mellem kontrolgruppen og verapamilgruppen, G-Rg3r-gruppen og G-Rg3s-gruppen og verapamil+G-Rg3r-gruppen og verapamil+G-Rg3s-gruppen.Desuden var der ingen signifikant lever- eller nyretoksicitet forbundet med de evaluerede behandlinger (figur 4E,F).
Tumorbelastning efter G-Rg3-behandling og plasma- eller tarm-G-Rg3r- og G-Rg3-niveauer i de angivne grupper.(A) Eksperimentelt design.(B) Makroskopiske tumorer i en musemodel.Tumorer er angivet med pile.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r i kombination med verapamil.d: G-Rg3 i kombination med verapamil.d: Verapamil.e: kontrol.(C) Optisk mikrofotografi af tumoren ved forstørrelse.Svar: 100x.b: 400X.(D) Effekt af G-Rg3 + verapamil behandling på tumorbyrde i A/J mus.(E) Plasmaniveauer af leverenzymet ALT.(F) Plasmaniveauer af nyreenzymet Cr.(G) Plasmaniveauer af G-Rg3r eller G-Rg3 i de angivne grupper.(H) Niveauer af G-Rg3r eller G-Rg3s i tarmene i de angivne grupper.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3-niveauer i de B(a)P-inducerede cancermodelmus blev vurderet ved UPLC-MS/MS efter en 20-ugers behandlingsperiode i overensstemmelse med metoden beskrevet i metodeafsnittet.Figur 4G og H viser henholdsvis plasma- og tarm-G-Rg3-niveauer.Plasma-G-Rg3r-niveauer var 0,44 ± 0,32 μmol/L og steg til 1,17 ± 0,47 μmol/L ved samtidig administration af verapamil (p < 0,001), mens intestinale G-Rg3r-niveauer var 0,53 ± 0,08 µg/l.Ved kombination med verapamil steg g til 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).For G-Rg3 fulgte resultaterne et lignende mønster, hvilket indikerer, at verapamil-behandling øgede den orale biotilgængelighed af G-Rg3 i A/J-mus.
Cellelevedygtighedsassay blev brugt til at evaluere cytotoksiciteten af B(a)P og G-Rg3 på hEL-celler.Cytotoksiciteten induceret af B(a)P i hEL-celler er vist i figur 5A, mens de ikke-toksiske egenskaber af G-Rg3r og G-Rg3 er vist i figur 5A og 5B.5B, C. For at evaluere den cytobeskyttende virkning af G-Rg3 blev B(a)P administreret sammen med forskellige koncentrationer af G-Rg3r eller G-Rg3 i hEL-celler.Som vist i figur 5D genoprettede G-Rg3r i koncentrationer på 5 μM, 10 μM og 20 μM cellernes levedygtighed til henholdsvis 58,3 %, 79,3 % og 77,3 %.Lignende resultater kan også ses i G-Rg3s-gruppen.Når koncentrationerne af G-Rg3'er var 5 µM, 10 µM og 20 µM, blev cellelevedygtigheden genoprettet til henholdsvis 58,3 %, 72,7 % og 76,7 % (figur 5E).).Tilstedeværelsen af BPDE-DNA-addukter blev målt under anvendelse af et ELISA-kit.Vores resultater viste, at BPDE-DNA-adduktniveauer var øget i den B(a)P-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen, men sammenlignet med G-Rg3-sambehandling var BPDE-DNA-adduktniveauer i B(a)P-gruppen B i den behandlede gruppe var DNA-adduktniveauer signifikant reduceret.Resultaterne af behandling med B(a)P alene er vist i figur 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 for G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 for G-Rg3s, p < 0,001).
Cellelevedygtighed og BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler behandlet med G-Rg3 og B(a)P.(A) Levedygtighed af hEL-celler behandlet med B(a)P.(B) Levedygtighed af hEL-celler behandlet med G-Rg3r.(C) Levedygtighed af hEL-celler behandlet med G-Rg3.(D) Levedygtighed af hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(E) Levedygtighed af hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(F) Niveauer af BPDE-DNA-addukt i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST-enzymekspression blev påvist efter samtidig behandling med 10 μM B(a)P og 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.Vores resultater viste, at B(a)P undertrykte GST-ekspression (59,7 ± 8,2 % i G-Rg3r-gruppen og 39 ± 4,5 % i G-Rg3s-gruppen), og B(a)P var associeret med begge med G-Rg3r , eller med G-Rg3r, eller med G-Rg3r.Sambehandling med G-Rg3s genoprettede GST-ekspression.GST-ekspression (103,7 ± 15,5 % i G-Rg3r-gruppen og 110 ± 11,1 % i G-Rg3s-gruppen, henholdsvis p < 0,05 og p < 0,001, fig. 6A, B og C).GST-aktivitet blev vurderet under anvendelse af et aktivitetsassay-kit.Vores resultater viste, at kombinationsbehandlingsgruppen havde højere GST-aktivitet sammenlignet med den eneste B(a)P-gruppe (96,3 ± 6,6 % vs. 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3r-gruppen vs. 92,3 ± 6,5 i G-Rg3r-gruppen ).% vs. 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3s-gruppen, p < 0,001, figur 6D).
Ekspression af GST og Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(A) Påvisning af GST-ekspression ved Western blotting.(B) Kvantitativ ekspression af GST i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(C) Kvantitativ ekspression af GST i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3s.(D) GST-aktivitet i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(E) Påvisning af Nrf2-ekspression ved Western blotting.(F) Kvantitativ ekspression af Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(G) Kvantitativ ekspression af Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3s.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
For at belyse de veje, der er involveret i G-Rg3-medieret undertrykkelse af B(a)P-induceret tumorigenese, blev Nrf2-ekspression vurderet ved Western blotting.Som vist i figur 6E,F,G, sammenlignet med kontrolgruppen, var kun niveauet af Nrf2 i B(a)P-behandlingsgruppen reduceret;sammenlignet med B(a)P-behandlingsgruppen var B(a) Nrf2-niveauer i PG-Rg3-gruppen dog øget (106 ± 9,5 % for G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6, 2 % for G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % for G-Rg3s, p < 0,01).
Vi bekræftede den forebyggende rolle af Nrf2 ved at undertrykke Nrf2-ekspression ved hjælp af specifikt lille interfererende RNA (siRNA).Nrf2 knockdown blev bekræftet ved Western blotting (fig. 7A,B).Som vist i figur 7C,D resulterede sambehandling af hEL-celler med B(a)P og G-Rg3 i et fald i antallet af BPDE-DNA-addukter (1,47 ± 0,21) sammenlignet med behandling med B(a)P alene i kontrol siRNA-gruppen.) G-Rg3r var 4,13 ± 0,49, G-Rg3s var 1,8 ± 0,32 og 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Imidlertid blev den hæmmende virkning af G-Rg3 på BPDE-DNA-dannelse afskaffet ved Nrf2 knockdown.I siNrf2-gruppen var der ingen signifikant forskel i BPDE-DNA-adduktdannelse mellem B(a)P- og G-Rg3-sambehandling og B(a)P-behandling alene (3,0 ± 0,21 for G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).for G-Rg3r versus 3,6 for G-Rg3s mod ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Effekt af Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler.(A) Nrf2 knockdown blev bekræftet ved Western blotting.(B) Kvantificering af Nrf2-båndintensitet.(C) Effekt af Nrf2-knockdown på BPDE-DNA-adduktniveauer i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(D) Effekt af Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktniveauer i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af tredobbelte bestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Denne undersøgelse evaluerede de forebyggende virkninger af forskellige røde ginsengekstrakter på en musemodel af B(a)P-induceret lungekræft, og KRGB-behandling reducerede signifikant tumorbyrden.I betragtning af, at G-Rg3 har det højeste indhold i dette ginsengekstrakt, er den vigtige rolle, som dette ginsenosid spiller i at hæmme tumordannelsen, blevet undersøgt.Både G-Rg3r og G-Rg3 (to epimerer af G-Rg3) reducerede signifikant tumorbyrden i en musemodel af B(a)P-induceret cancer.G-Rg3r og G-Rg3 udøver anticancer-effekter ved at inducere apoptose af tumorceller21, hæmme tumorvækst22, standse cellecyklussen23 og påvirke angiogenese24.G-Rg3 har også vist sig at hæmme cellulær metastase25, og G-Rg3's evne til at forstærke virkningerne af kemoterapi og strålebehandling er blevet dokumenteret26,27.Poon et al påviste, at G-Rg3-behandling kunne reducere de genotoksiske virkninger af B(a)P28.Denne undersøgelse demonstrerer det terapeutiske potentiale af G-Rg3 til at målrette miljømæssige kræftfremkaldende molekyler og forebygge kræft.
På trods af deres gode profylaktiske potentiale udgør den dårlige orale biotilgængelighed af ginsenosider en udfordring for den kliniske brug af disse molekyler.Farmakokinetisk analyse af oral administration af ginsenosider hos rotter viste, at dens biotilgængelighed stadig er mindre end 5 %29.Disse test viste, at efter den 20-ugers behandlingsperiode var det kun blodniveauerne af Rg5, der faldt.Selvom den underliggende mekanisme for dårlig biotilgængelighed stadig mangler at blive belyst, menes P-gp at være involveret i udstrømningen af ginsenosider.Dette arbejde viste for første gang, at administration af verapamil, en P-gp-blokker, øger den orale biotilgængelighed af G-Rg3r og G-Rg3s.Dette fund tyder således på, at G-Rg3r og G-Rg3s fungerer som substrater for P-gp for at regulere dets efflux.
Dette arbejde viser, at kombinationsbehandling med verapamil øger den orale biotilgængelighed af G-Rg3 i en musemodel for lungekræft.Dette fund understøttes af øget intestinal transcellulær transport af G-Rg3 efter P-gp blokade, hvorved dets absorption øges.Assays i Caco2-celler viste, at verapamil-behandling reducerede udstrømningen af G-Rg3r og G-Rg3s, mens den forbedrede membranpermeabiliteten.En undersøgelse af Yang et al.Undersøgelser har vist, at behandling med cyclosporin A (en anden P-gp-blokker) øger biotilgængeligheden af ginsenosid Rh2 fra en basisværdi på 1%20 til mere end 30%.Ginsenosideforbindelserne K og Rg1 viste også lignende resultater30,31.Når verapamil og cyclosporin A blev administreret samtidigt, blev effluxen af forbindelse K i Caco-2-celler signifikant reduceret fra 26,6 til mindre end 3, mens dets intracellulære niveauer steg 40 gange 30.I nærvær af verapamil steg Rg1-niveauer i rotte lungeepitelceller, hvilket tyder på en rolle for P-gp i ginsenosid efflux, som vist af Meng et al.31.Verapamil havde dog ikke den samme effekt på effluxen af nogle ginsenosider (såsom Rg1, F1, Rh1 og Re), hvilket indikerer, at de ikke er påvirket af P-gp-substrater, som vist af Liang et al.32 .Denne observation kan være relateret til involvering af andre transportører og alternative ginsenosidstrukturer.
Mekanismen for den forebyggende effekt af G-Rg3 på cancer er uklar.Tidligere undersøgelser har vist, at G-Rg3 forhindrer DNA-skade og apoptose ved at reducere oxidativt stress og inflammation16,33, som kan være den underliggende mekanisme til at forhindre B(a)P-induceret tumorigenese.Nogle rapporter indikerer, at genotoksicitet induceret af B(a)P kan reduceres ved at modulere fase II-enzymer til dannelse af BPDE-DNA34.GST er et typisk fase II-enzym, der hæmmer dannelsen af BPDE-DNA-addukt ved at fremme bindingen af GSH til BPDE, og derved reducere DNA-skader induceret af B(a)P35.Vores resultater viser, at G-Rg3-behandling reducerer B(a)P-induceret cytotoksicitet og BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler og genopretter GST-ekspression og aktivitet in vitro.Imidlertid var disse virkninger fraværende i fravær af Nrf2, hvilket tyder på, at G-Rg3 inducerer cytobeskyttende virkninger gennem Nrf2-vejen.Nrf2 er en vigtig transkriptionsfaktor for fase II afgiftningsenzymer, der fremmer clearance af xenobiotika36.Aktivering af Nrf2-vejen inducerer cytobeskyttelse og reducerer vævsskade37.Desuden har flere rapporter understøttet rollen som Nrf2 som en tumorundertrykker i carcinogenese38.Vores undersøgelse viser, at induktion af Nrf2-vej af G-Rg3 spiller en vigtig regulatorisk rolle i B(a)P-induceret genotoksicitet ved at forårsage B(a)P-afgiftning ved at aktivere fase II-enzymer og derved hæmme tumorgeneseprocessen.
Vores arbejde afslører potentialet af rød ginseng til at forhindre B(a)P-induceret lungekræft hos mus gennem den vigtige involvering af ginsenosid G-Rg3.Den dårlige orale biotilgængelighed af dette molekyle hæmmer dets kliniske anvendelse.Imidlertid viser denne undersøgelse for første gang, at G-Rg3 er et substrat for P-gp, og administration af en P-gp-hæmmer øger biotilgængeligheden af G-Rg3 in vitro og in vivo.G-Rg3 reducerer B(a)P-induceret cytotoksicitet ved at regulere Nrf2-vejen, som kan være en potentiel mekanisme for dens forebyggende funktion.Vores undersøgelse bekræfter potentialet af ginsenosid G-Rg3 til forebyggelse og behandling af lungekræft.
Seks uger gamle A/J hunmus (20 ± 1 g) og 7 uger gamle Wistar hanrotter (250 ± 20 g) blev opnået fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) og Wuhan Institute of Zoology.Universitet (Wuhan, Kina).Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, Kina) forsynede os med Caco-2- og hEL-celler.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) er en kilde til B(a)P og tricaprin.Oprensede ginsenosider G-Rg3r og G-Rg3s, dimethylsulfoxid (DMSO), CellTiter-96 proliferation assay kit (MTS), verapamil, minimal essential medium (MEM) og føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Kina).QIAamp DNA mini kit og BPDE-DNA addukt ELISA kit blev købt fra Qiagen (Stanford, CA, USA) og Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).GST aktivitet assay kit og total protein assay kit (standard BCA metode) blev købt fra Solarbio (Beijing, Kina).Alle røde ginsengekstrakter opbevares i Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Kina) og Korea Cancer Center (Seoul, Korea) er kommercielle kilder til CRG-ekstrakt og forskellige røde ginsengekstrakter af forskellig koreansk oprindelse (inklusive KRGA, KRGB og KRGC).Rød ginseng er lavet af rødderne af 6 år gammel frisk ginseng.Rød ginsengekstrakt opnås ved at vaske ginseng med vand tre gange, derefter koncentrere det vandige ekstrakt og til sidst tørre ved lav temperatur for at opnå ginsengekstraktpulver.Antistoffer (anti-Nrf2, anti-GST og β-actin), peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin immunoglobulin G (IgG), transfektionsreagens, kontrol siRNA og Nrf2 siRNA blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Caco2- og hEL-celler blev dyrket i 100 mm2 cellekulturskåle med MEM indeholdende 10% FBS ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2.For at bestemme effekten af behandlingsbetingelser blev hEL-celler inkuberet med forskellige koncentrationer af B(a)P og G-Rg3 i MEM i 48 timer.Celler kan yderligere analyseres eller opsamles for at fremstille cellefrie ekstrakter.
Alle forsøg blev godkendt af den eksperimentelle dyreetiske komité ved Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (godkendelse nr. 2019; registreringsnr. 4587TH).Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler, og undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) retningslinjerne.Otte uger gamle A/J-mus blev først intraperitonealt injiceret med B(a)P i tricaprinopløsning (100 mg/kg, 0,2 ml).Efter en uge blev musene tilfældigt opdelt i kontrolgrupper og forskellige behandlingsgrupper, 15 mus i hver gruppe, og gavaget én gang dagligt.Efter 20 ugers behandling blev dyrene aflivet ved C02-kvælning.Lungerne blev opsamlet og fikseret i 24 timer.Antallet af overfladiske tumorer og individuelle tumorstørrelser blev kvantificeret for hver lunge under et dissektionsmikroskop.Tumorvolumen-estimater (V) blev beregnet ved hjælp af følgende udtryk: V (mm3) = 4/3πr3, hvor r er tumordiameteren.Nettosummen af alle tumorvolumener i lungerne hos mus repræsenterede det totale tumorvolumen, og det gennemsnitlige totale tumorvolumen i hver gruppe repræsenterede tumorbelastningen.Fuldblods- og tarmprøver blev opsamlet og opbevaret ved -80 °C til UPLC-MS/MS-bestemmelse.Serum blev opsamlet, og en automatiseret kemianalysator blev brugt til at analysere alaninaminotransferase (ALT) og serumkreatinin (Cr) niveauer for at vurdere lever- og nyrefunktion.
Opsamlede prøver blev fjernet fra kølelager, optøet, vejet og anbragt i rør som beskrevet ovenfor.Hertil blev tilsat 0,5 μM phlorizin (intern standard) i 0,8 ml methanolopløsning.Vævet blev derefter homogeniseret under anvendelse af Tissue-Tearor, og homogenatet blev efterfølgende overført til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.Blandingen blev centrifugeret ved 15500 rpm i 15 minutter.Efter fjernelse af 1,0 ml supernatant, tør med nitrogen.To hundrede mikroliter methanol blev anvendt til udvinding.Blodet opsamles og behandles på én linje og bruges som reference for alle målinger.
24-brønds Transwell-plader blev podet med 1,0 x 105 Caco-2-celler pr. brønd for at evaluere den potentielle forøgelse af G-Rg3-transport ved tilsætning af verapamil.Efter 3 ugers dyrkning blev cellerne vasket med HBSS og præinkuberet ved 37°C.400 μL af 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s eller en blanding med 50 eller 100 μM verapamil) blev injiceret på den basolaterale eller apikale side af monolaget, og 600 μL HBSS opløsning blev tilsat til den anden side.Saml 100 µl dyrkningsmedium på de angivne tidspunkter (0, 15, 30, 45, 60, 90 og 120 minutter) og tilsæt 100 µl HBSS for at fylde dette volumen.Prøver blev opbevaret ved -4 °C indtil detektion ved UPLC-MS/MS.Udtrykket Papp = dQ/(dT × A × C0) bruges til at kvantificere den tilsyneladende ensrettede apikale og basolaterale permeabilitet og vice versa (henholdsvis Pa-b og Pb-a);dQ/dT er ændringen i koncentration, A (0,6 cm2) er overfladearealet af monolaget, og C0 er den initiale donorkoncentration.Udstrømningsforholdet beregnes som Pb-a/Pa-b, som repræsenterer udstrømningshastigheden af undersøgelseslægemidlet.
Wistar-hanrotter blev fastet i 24 timer, drak kun vand og bedøvet med en intravenøs injektion af 3,5 % pentobarbitalopløsning.Det intuberede silikonerør har enden af duodenum som indgang og enden af ileum som udgang.Brug en peristaltisk pumpe til at pumpe indløbet med 10 µM G-Rg3r eller G-Rg3s i isotonisk HBSS ved en flowhastighed på 0,1 ml/min.Virkningen af verapamil blev vurderet ved at tilsætte 50 μM eller 100 μM af forbindelsen til 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.UPLC-MS/MS blev udført på perfusionsekstrakter indsamlet på tidspunkter 60, 90, 120 og 150 minutter efter starten af perfusion.Procentdelen af absorption er kvantificeret med formlen % absorption = (1 – Cout/Cin) × 100 %;koncentrationen af G-Rg3 ved udløb og indløb er udtrykt ved henholdsvis Cout og Cin.
hEL-celler blev podet i plader med 96 brønde ved en tæthed på 1 × 104 celler pr. brønd og behandlet med B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) eller G-Rg3 opløst i DMSO .Lægemidlerne blev derefter fortyndet med dyrkningsmedium til forskellige koncentrationer (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) i løbet af 48 timer.Ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt MTS-assay-kit blev celler udsat for en standardprotokol og derefter målt ved hjælp af en mikropladelæser ved 490 nm.Cellelevedygtighedsniveauet for grupperne co-behandlet med B(a)P (10 μM) og G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) blev vurderet i henhold til ovenstående metode og sammenlignet med den ubehandlede gruppe.
hEL-celler blev podet i 6-brøndsplader ved en tæthed på 1 × 105 celler/brønd og behandlet med 10 μMB(a)P i nærvær eller fravær af 10 μM G-Rg3.Efter 48 timers behandling blev DNA ekstraheret fra hEL-celler ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit i henhold til producentens protokol.Dannelsen af BPDE-DNA-addukter blev påvist under anvendelse af et BPDE-DNA-addukt-ELISA-kit.Relative niveauer af BPDE-DNA-addukt blev målt under anvendelse af en mikropladelæser ved at måle absorbans ved 450 nm.
hEL-celler blev podet i plader med 96 brønde ved en tæthed på 1 × 104 celler pr. brønd og behandlet med 10 μMB(a)P i fravær eller tilstedeværelse af 10 μM G-Rg3 i 48 timer.GST-aktivitet blev målt under anvendelse af et kommercielt GST-aktivitetsassay-kit ifølge producentens protokol.Relativ GST-aktivering blev målt ved absorbans ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
hEL-celler blev vasket med iskold PBS og derefter lyseret under anvendelse af radioimmunpræcipitationsassaybuffer indeholdende proteaseinhibitorer og phosphatasehæmmere.Efter proteinkvantificering ved hjælp af et totalt proteinassay-kit blev 30 μg protein i hver prøve adskilt med 12% SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran ved elektroforese.Membraner blev blokeret med 5 % skummetmælk og inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4°C.Efter inkubation med peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer blev forstærkede kemiluminescensreagenser tilsat for at visualisere bindingssignalet.Intensiteten af hvert proteinbånd blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software.
GraphPad Prism 7.0-software blev brugt til at analysere alle data, udtrykt som middel ± standardafvigelse.Variation mellem behandlingsgrupper blev vurderet ved hjælp af Students t-test eller envejs-variansanalyse, med en P-værdi <0,05, hvilket indikerer statistisk signifikans.
Alle data opnået eller analyseret under denne undersøgelse er inkluderet i denne publicerede artikel og supplerende informationsfiler.
Torre, LA, Siegel, RL og Jemal, A. Lungekræftstatistikker.biord.Udløbet.medicin.biologi.893, 1-19 (2016).
Hecht, S. Tobakskræftfremkaldende stoffer, deres biomarkører og tobaksinduceret cancer.Nat.Kræftpræst.3, 733-744 (2003).
Phillips, DH og Venitt, S. DNA og proteinaddukter i humant væv som følge af eksponering for tobaksrøg.internationalitet.J. Cancer.131, 2733-2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA og Yu M. Effekt af Houttuynia cordata og silibinin på benzo(a)pyren-induceret lungetumorogenese i A/J-mus.Cancer 7, 1053-1057 (2005).
Tang, W. et al.Anticancer naturligt produkt isoleret fra kinesiske medicinske materialer.kæbe.medicin.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Effekten af polyphenon E, rød ginseng og rapamycin på benzo(a)pyren-induceret lungetumorogenese hos A/J-mus.Cancer 8, 52-58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS og Yuan, KS Red, involvering i kræftbehandling.kæbe.J. Nutt.medicin.14, 7-16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS og Gao, L. Ginsenosider i rødderne og bladene af amerikansk ginseng.J. Agric.Fødevarekemi.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA og Yuan KS Farmakologi af ginseng: mange komponenter og mange effekter.biokemi.farmakologi.58, 1685-1693 (1999).
Indlægstid: 17. september 2023