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Roter Ginseng wird seit Hunderten von Jahren in der traditionellen asiatischen Medizin verwendet.In dieser Studie untersuchten wir die Fähigkeit von vier Arten von rotem Ginseng (chinesischer roter Ginseng, koreanischer roter Ginseng A, koreanischer roter Ginseng B und koreanischer roter Ginseng C), die in verschiedenen Regionen angebaut wurden, die Bildung und das Wachstum von krebserregender Lunge zu hemmen Tumore.An A/J-Mäusen wurde ein Benzo(a)pyren (B(a)P)-Test durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass koreanischer roter Ginseng B unter den vier roten Ginsengsorten die Tumorlast am wirksamsten reduziert.Darüber hinaus analysierten wir den Gehalt verschiedener Ginsenoside (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 und Rg5) in vier Extrakten aus rotem Ginseng und stellten fest, dass koreanischer roter Ginseng B dies getan hat die höchsten Konzentrationen an Ginsenosid Rg3 (G-Rg3), was darauf hindeutet, dass G-Rg3 eine wichtige Rolle bei seiner therapeutischen Wirksamkeit spielen könnte.Diese Arbeit zeigt, dass G-Rg3 eine relativ geringe Bioverfügbarkeit aufweist.Wenn G-Rg3 jedoch gleichzeitig mit dem P-gp-Inhibitor Verapamil verabreicht wurde, verringerte sich der Ausfluss von G-Rg3 in Caco-2-Zellen, die Geschwindigkeit der intestinalen Absorption von G-Rg3 erhöhte sich in einem Rattenmodell und G-Rg3 wurde erhöht.In Caco-2-Zellen nimmt der Ausfluss von Rg3 ab und die Rg3-Konzentration nimmt ab.G-Rg3 ist im Darm und im Plasma erhöht und seine Fähigkeit, Tumoren vorzubeugen, ist auch in einem Rattenmodell der B(a)P-induzierten Tumorentstehung erhöht.Wir fanden außerdem heraus, dass G-Rg3 die B(a)P-induzierte Zytotoxizität und DNA-Adduktbildung in menschlichen Lungenzellen reduzierte und die Expression und Aktivität von Phase-II-Enzymen über den Nrf2-Weg wiederherstellte, was möglicherweise mit dem möglichen Wirkungsmechanismus zusammenhängt der G-Hemmung -Rg3..Über das Auftreten von Lungentumoren.Unsere Studie zeigt eine potenziell wichtige Rolle von G-Rg3 bei der Bekämpfung von Lungentumoren in Mausmodellen.Die orale Bioverfügbarkeit dieses Ginsenosids wird durch die gezielte Wirkung auf das P-Glykoprotein erhöht, wodurch das Molekül eine krebshemmende Wirkung entfalten kann.
Die häufigste Art von Lungenkrebs ist der nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC), der eine der häufigsten Krebstodesursachen in China und Nordamerika ist1,2.Der Hauptfaktor, der das Risiko für die Entwicklung von nichtkleinzelligem Lungenkrebs erhöht, ist das Rauchen.Zigarettenrauch enthält mehr als 60 Karzinogene, darunter Benzo(a)pyren (B(a)P), Nitrosamine und radioaktive Isotope aus dem Zerfall von Radon.3 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe B(a)P sind die Hauptursache für die Toxizität von Zigaretten Rauch.Bei Kontakt mit B(a)P wandelt Cytochrom P450 es in B(a)P-7,8-Dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE) um, das mit DNA unter Bildung des BPDE-DNA-Addukts 4 reagiert. Darüber hinaus sind diese Addukte induzieren die Entstehung von Lungentumoren bei Mäusen, deren Tumorstadium und Histopathologie denen menschlicher Lungentumoren ähneln5.Diese Eigenschaft macht das B(a)P-induzierte Lungenkrebsmodell zu einem geeigneten System zur Bewertung von Verbindungen mit möglichen Antikrebseigenschaften.
Eine mögliche Strategie zur Verhinderung der Entwicklung von Lungenkrebs bei Hochrisikogruppen, insbesondere bei Rauchern, ist der Einsatz chemopräventiver Wirkstoffe, um die Entwicklung intraepithelialer neoplastischer Läsionen zu unterdrücken und so deren späteres Fortschreiten zur Malignität zu verhindern.Tierstudien zeigen, dass verschiedene chemopräventive Mittel wirksam sind6.In unserem vorherigen Bericht7 haben wir die gute präventive Wirkung von rotem Ginseng bei Lungenkrebs hervorgehoben.Dieses Kraut wird seit Jahrhunderten in der traditionellen asiatischen Medizin zur Verlängerung von Leben und Gesundheit verwendet und hat nachweislich eine antitumorale Wirkung8.
Der aktive Faktor von Ginseng ist Ginsenosid, das als zusammengesetzter Marker zur Bewertung der Qualität von Ginsengextrakten verwendet wird.Bei der quantitativen Analyse roher Ginsengextrakte werden typischerweise mehrere Ginsenoside verwendet, darunter RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 und Rc9,10.Ginsenoside haben aufgrund ihrer sehr schlechten oralen Bioverfügbarkeit kaum klinischen Nutzen11.Obwohl der Mechanismus für diese schlechte Bioverfügbarkeit nicht klar ist, könnte der durch P-Glykoprotein (P-gp)12 verursachte Ausfluss von Ginsenosiden die Ursache sein.P-gp ist einer der wichtigsten Effluxtransporter in der Superfamilie der ATP-bindenden Kassettentransporter, der die Energie der ATP-Hydrolyse nutzt, um intrazelluläre Substanzen in die äußere Umgebung freizusetzen.P-gp-Transporter sind typischerweise weit verbreitet im Darm, in der Niere, in der Leber und in der Blut-Hirn-Schranke13.P-gp spielt eine entscheidende Rolle bei der intestinalen Absorption und die Hemmung von P-gp erhöht die orale Absorption und Verfügbarkeit einiger Krebsmedikamente12,14.Beispiele für in der Literatur bisher verwendete Inhibitoren sind Verapamil und Cyclosporin A15.Diese Arbeit beinhaltet die Einrichtung eines Maussystems zur Untersuchung von B(a)P-induziertem Lungenkrebs, um die Fähigkeit verschiedener roter Ginseng-Extrakte aus China und Korea zu bewerten, bösartige Erkrankungen zu beeinflussen.Die Extrakte wurden einzeln analysiert, um spezifische Ginsenoside zu identifizieren, die die Karzinogenese beeinflussen können.Anschließend wurde Verapamil zur Bekämpfung von P-gp und zur Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit und therapeutischen Wirksamkeit krebsbekämpfender Ginsenoside eingesetzt.
Der Mechanismus, durch den Ginseng-Saponine therapeutische Wirkungen auf die Karzinogenese ausüben, bleibt unklar.Untersuchungen haben gezeigt, dass verschiedene Ginsenoside durch Karzinogene verursachte DNA-Schäden reduzieren können, indem sie oxidativen Stress reduzieren und Phase-II-Entgiftungsenzyme aktivieren und so Zellschäden verhindern.Glutathion-S-Transferase (GST) ist ein typisches Phase-II-Enzym, das erforderlich ist, um durch Karzinogene verursachte DNA-Schäden zu reduzieren17.Nuclear Erythroid 2-Related Factor 2 (Nrf2) ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der die Redoxhomöostase reguliert und die Expression von Phase-II-Enzymen und zytoprotektiven Antioxidansreaktionen aktiviert18.Unsere Studie untersuchte auch die Auswirkungen der identifizierten Ginsenoside auf die Reduzierung der B(a)P-induzierten Zytotoxizität und der BPDE-DNA-Adduktbildung sowie auf die Induktion von Phase-II-Enzymen durch Modulation des Nrf2-Signalwegs in normalen Lungenzellen.
Die Etablierung eines Mausmodells für B(a)P-induzierten Krebs steht im Einklang mit früheren Arbeiten5.Abbildung 1A zeigt den experimentellen Aufbau einer 20-wöchigen Behandlung eines Mauskrebsmodells, das durch B(a)P, Wasser (Kontrolle), chinesischen roten Ginseng-Extrakt (CRG), koreanischen roten Ginseng-Extrakt A (KRGA) und koreanisches Rot induziert wurde Ginseng.Extrakt B (KRGB) und Koreanischer Roter Ginseng-Extrakt C (KRGC).Nach 20-wöchiger Behandlung mit rotem Ginseng wurden die Mäuse durch CO2-Erstickung getötet.Abbildung 1B zeigt makroskopische Lungentumoren bei Tieren, die mit verschiedenen Arten von rotem Ginseng behandelt wurden, und Abbildung 1C zeigt eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme einer Tumorprobe.Die Tumorlast der mit KRGB behandelten Tiere (1,5 ± 0,35) war geringer als die der Kontrolltiere (0,82 ± 0,2, P < 0,05), wie in Abbildung 1D dargestellt.Der durchschnittliche Grad der Tumorlasthemmung betrug 45 %.Andere getestete Extrakte aus rotem Ginseng zeigten keine derart signifikanten Veränderungen der Tumorlast (P > 0,05).Im Mausmodell wurden während der 20-wöchigen Behandlung mit rotem Ginseng keine offensichtlichen Nebenwirkungen beobachtet, darunter keine Veränderung des Körpergewichts (Daten nicht gezeigt) und keine Leber- oder Nierentoxizität (Abbildung 1E,F).
Roter Ginseng-Extrakt behandelt die Entwicklung von Lungentumoren bei A/J-Mäusen.(A) Experimentelles Design.(B) Große Lungentumoren in einem Mausmodell.Tumore sind durch Pfeile gekennzeichnet.a: Chinesische rote Ginseng-Gruppe.b: Gruppe A des koreanischen roten Ginsengs.c: Koreanischer roter Ginseng, Gruppe B. d: Koreanischer roter Ginseng, Gruppe C. d: Kontrollgruppe.(C) Lichtmikroskopische Aufnahme, die einen Lungentumor zeigt.Vergrößerung: 100. b: 400. (D) Tumorlast in der Gruppe der roten Ginseng-Extrakte.(E) Plasmaspiegel des Leberenzyms ALT.(F) Plasmaspiegel des Nierenenzyms Cr.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.*P <0,05.
Die in dieser Studie identifizierten Extrakte aus rotem Ginseng wurden mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) analysiert, um die folgenden Ginsenoside zu quantifizieren: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Th2, F1, Tk1 und Tg5.Die zur Messung der Analyten verwendeten UPLC- und MS-Bedingungen wurden in einem früheren Bericht19 beschrieben.UPLC-MS/MS-Chromatogramme von vier Extrakten aus rotem Ginseng sind in Abbildung 2A dargestellt.Es gab signifikante Unterschiede im Gesamtgehalt an Ginsenosiden, wobei der höchste Gesamtgehalt an Ginsenosiden in CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) lag (Abbildung 2B).Bei der Bewertung einzelner Ginsenoside (Abbildung 2C) zeigte KRGB im Vergleich zu anderen Ginsenosiden den höchsten G-Rg3-Wert (58,33 ± 3,81 μmol/L für G-Rg3s und 41,56 ± 2,88 μmol/L für G-Rg3r).L).Typ roter Ginseng (P < 0,001).G-Rg3 kommt als Paar der Stereoisomere G-Rg3r und G-Rg3s vor, die sich in der Position der Hydroxylgruppe am Kohlenstoff 20 unterscheiden (Abb. 2D).Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass G-Rg3r oder G-Rg3 in einem B(a)P-induzierten Krebs-Mausmodell ein wichtiges Antikrebspotenzial haben könnten.
Gehalt an Ginsenosiden in verschiedenen Extrakten aus rotem Ginseng.(A) UPLC-MS/MS-Chromatogramme von vier Extrakten aus rotem Ginseng.(B) Schätzung des gesamten Ginsenosidgehalts in den angegebenen Extrakten.(C) Nachweis einzelner Ginsenoside in markierten Extrakten.(D) Strukturen der Ginsenosid-Stereoisomere G-Rg3r und G-Rg3s.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen ausgedrückt.***P <0,001.
Die UPLC-MS/MS-Studie erforderte die Quantifizierung von Ginsenosiden in Darm- und Blutproben nach 20-wöchiger Behandlung.Die Behandlung mit KRGB zeigte das Vorhandensein von nur 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 im Blut.Es wurden keine verbleibenden Ginsenoside nachgewiesen, was auf eine schlechte orale Bioverfügbarkeit und damit auf eine verringerte Exposition gegenüber diesen Ginsenosiden hinweist.
Die Kolonadenokarzinom-Zelllinie Caco-2 ist morphologisch und biochemisch den menschlichen Darmepithelzellen ähnlich, was ihren Nutzen bei der Beurteilung des Enterozytentransports über die Darmepithelbarriere zeigt.Diese Analyse basierte auf einer früheren Studie 20 .Die Abbildungen 3A,B,C,D,E,F zeigen repräsentative Bilder des transzellulären Transports von G-Rg3r und G-Rg3 unter Verwendung eines Caco-2-Monoschichtmodells.Der transzelluläre Transport von G-Rg3r oder G-Rg3 durch Caco-2-Monoschichten von der basolateralen zur apikalen Seite (Pb-a) war signifikant höher als von der apikalen zur basolateralen Seite (Pa-b).Für G-Rg3r betrug der mittlere Pa-b-Wert 0,38 ± 0,06, der nach Behandlung mit 50 μmol/L Verapamil auf 0,73 ± 0,06 und nach Behandlung mit 100 μmol/L Verapamil auf 1,14 ± 0,09 anstieg (p < 0,01 und 0,001, bzw. Abbildung 2).3A).Beobachtungen für G-Rg3 folgten einem ähnlichen Muster (Abb. 3B), und die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit Verapamil den Transport von G-Rg3r und G-Rg3 steigerte.Die Behandlung mit Verapamil führte auch zu einer signifikanten Verringerung der mittleren Pb-a- und G-Rg3r- und G-Rg3s-Effluxverhältnisse (Abbildung 3C,D,E,F), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit Verapamil den Ginsenosidgehalt in Caco-2-Effluxzellen reduziert..
Transzellulärer Transport von G-Rg3 in Caco-2-Monoschichten und intestinale Absorption in einem Perfusionstest bei Ratten.(A) Pa-b-Wert der G-Rg3r-Gruppe in der Caco-2-Monoschicht.(B) Pa-b-Wert der G-Rg3s-Gruppen in der Caco-2-Monoschicht.(C) Pb-Wert der G-Rg3r-Gruppe in der Caco-2-Monoschicht.(D) Pb-Wert der G-Rg3s-Gruppen in der Caco-2-Monoschicht.(E) Ausbeuteverhältnis der G-Rg3r-Gruppen in einer Caco-2-Monoschicht.(F) Ausbeuteverhältnis der G-Rg3-Gruppen in einer Caco-2-Monoschicht.(G) Prozentsatz der intestinalen Absorption von G-Rg3r in einem Perfusionstest bei Ratten.(H) Prozentsatz der intestinalen Absorption von G-Rg3 in einem Perfusionstest bei Ratten.Permeabilität und Absorption wurden ohne Zusatz von Verapamil verglichen.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von fünf unabhängigen Experimenten ausgedrückt.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten20 wurde eine orthotope Darmperfusion von Ratten durchgeführt, um festzustellen, ob die G-Rg3-Absorption im Darm nach der Behandlung mit Verapamil zunimmt.Die Abbildungen 3G und H zeigen repräsentative Perfusionstests zur Bewertung des Prozentsatzes der intestinalen Absorption von G-Rg3r und G-Rg3 bei Krebsmodellratten während der oben genannten Zeiträume.Der anfängliche Prozentsatz der schwachen G-Rg3r-Aufnahme von etwa 10 % stieg nach Behandlung mit 50 μM Verapamil auf über 20 % und nach Behandlung mit 100 μM Verapamil auf über 25 %.Ebenso zeigte G-Rg3, das eine anfängliche Aufnahme von 10 % aufwies, nach der Behandlung mit 50 μM Verapamil einen Spitzenwert von über 20 % und nach der Behandlung mit 100 μM Verapamil einen Spitzenwert von fast 30 %, was darauf hindeutet, dass die Hemmung von P-gp durch Verapamil zunimmt intestinale G-Absorption Rg3 in einem Mausmodell für Lungenkrebs.
Gemäß der oben genannten Methode wurden B(a)P-induzierte Krebsmodellmäuse zufällig in sechs Gruppen eingeteilt, wie in Abbildung 4A dargestellt.In der G-Rg3-Behandlungsgruppe wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe kein signifikanter Gewichtsverlust oder klinische Anzeichen einer Toxizität beobachtet (Daten nicht gezeigt).Nach 20-wöchiger Behandlung wurden die Lungen jeder Maus entnommen.Abbildung 4B zeigt makroskopische Lungentumoren bei Mäusen in den oben genannten Behandlungsgruppen und Abbildung 4C zeigt eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme eines repräsentativen Tumors.Bezüglich der Tumorlast in jeder Gruppe (Abb. 4D) betrugen die Werte für mit G-Rg3r und G-Rg3s behandelte Mäuse 0,75 ± 0,29 mm3 bzw. 0,81 ± 0,30 mm3, während die Werte für mit G-Rg3r behandelte Mäuse 0,81 ± 0,30 mm3 betrugen mit -Rg3s betrugen 1,63 bzw. ±0,40 mm3.Kontrollmäuse (p < 0,001), was darauf hinweist, dass die Behandlung mit G-Rg3 die Tumorlast bei Mäusen verringerte.Die Verabreichung von Verapamil verstärkte diese Reduzierung noch weiter: Die Werte bei Verapamil+ G-Rg3r-Mäusen sanken von 0,75 ± 0,29 mm3 auf 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) und die Werte für Verapamil+ sanken von 0,81 ± 0,30 mm3 auf 0,29 ± 0,21 mm3 in mit G. -Rg3s behandelten Mäusen (p < 0,05), was darauf hindeutet, dass Verapamil die hemmende Wirkung von G-Rg3 auf die Tumorentstehung verstärken kann.Die Tumorlast zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der Verapamil-Gruppe, der G-Rg3r-Gruppe und der G-Rg3s-Gruppe sowie der Verapamil+G-Rg3r-Gruppe und der Verapamil+G-Rg3s-Gruppe.Darüber hinaus gab es keine signifikanten Leber- oder Nierentoxizitäten im Zusammenhang mit den bewerteten Behandlungen (Abbildung 4E,F).
Tumorlast nach G-Rg3-Behandlung und Plasma- oder Darm-G-Rg3r- und G-Rg3-Spiegel in den angegebenen Gruppen.(A) Experimentelles Design.(B) Makroskopische Tumoren in einem Mausmodell.Tumore sind durch Pfeile gekennzeichnet.a: G-Tg3r.b: G-Tg3s.c: G-Rg3r in Kombination mit Verapamil.d: G-Rg3 in Kombination mit Verapamil.d: Verapamil.e: Kontrolle.(C) Optische Mikroaufnahme des Tumors bei Vergrößerung.Antwort: 100x.b: 400X.(D) Wirkung der Behandlung mit G-Rg3 + Verapamil auf die Tumorlast bei A/J-Mäusen.(E) Plasmaspiegel des Leberenzyms ALT.(F) Plasmaspiegel des Nierenenzyms Cr.(G) Plasmaspiegel von G-Rg3r oder G-Rg3 der angegebenen Gruppen.(H) G-Rg3r- oder G-Rg3s-Spiegel im Darm der angegebenen Gruppen.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen ausgedrückt.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Die G-Rg3-Spiegel in den B(a)P-induzierten Krebsmodellmäusen wurden durch UPLC-MS/MS nach einem 20-wöchigen Behandlungszeitraum gemäß der im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Methode bewertet.Die Abbildungen 4G und H zeigen die G-Rg3-Spiegel im Plasma bzw. im Darm.Die Plasma-G-Rg3r-Spiegel betrugen 0,44 ± 0,32 μmol/l und stiegen bei gleichzeitiger Verabreichung von Verapamil auf 1,17 ± 0,47 μmol/l (p < 0,001), während die intestinalen G-Rg3r-Spiegel 0,53 ± 0,08 μg/l betrugen.In Kombination mit Verapamil stieg g auf 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Für G-Rg3 folgten die Ergebnisse einem ähnlichen Muster, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit Verapamil die orale Bioverfügbarkeit von G-Rg3 bei A/J-Mäusen erhöhte.
Der Zelllebensfähigkeitstest wurde verwendet, um die Zytotoxizität von B(a)P und G-Rg3 auf hEL-Zellen zu bewerten.Die durch B(a)P in hEL-Zellen induzierte Zytotoxizität ist in Abbildung 5A dargestellt, während die nichttoxischen Eigenschaften von G-Rg3r und G-Rg3 in den Abbildungen 5A und 5B dargestellt sind.5B, C. Um die zytoprotektive Wirkung von G-Rg3 zu bewerten, wurde B(a)P zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von G-Rg3r oder G-Rg3 in hEL-Zellen verabreicht.Wie in Abbildung 5D gezeigt, stellte G-Rg3r in Konzentrationen von 5 μM, 10 μM und 20 μM die Lebensfähigkeit der Zellen auf 58,3 %, 79,3 % bzw. 77,3 % wieder her.Ähnliche Ergebnisse sind auch in der G-Rg3s-Gruppe zu sehen.Wenn die Konzentrationen von G-Rg3s 5 µM, 10 µM und 20 µM betrugen, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen auf 58,3 %, 72,7 % bzw. 76,7 % wiederhergestellt (Abbildung 5E).).Das Vorhandensein von BPDE-DNA-Addukten wurde mit einem ELISA-Kit gemessen.Unsere Ergebnisse zeigten, dass die BPDE-DNA-Adduktspiegel in der mit B(a)P behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht waren, im Vergleich zur gleichzeitigen G-Rg3-Behandlung jedoch die BPDE-DNA-Adduktspiegel in der B(a)P-Gruppe B In der behandelten Gruppe waren die DNA-Adduktspiegel deutlich reduziert.Die Ergebnisse der Behandlung mit B(a)P allein sind in Abbildung 5F dargestellt (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 für G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 für G -Rg3s, p < 0,001).
Zelllebensfähigkeit und BPDE-DNA-Adduktbildung in mit G-Rg3 und B(a)P behandelten hEL-Zellen.(A) Lebensfähigkeit von mit B(a)P behandelten hEL-Zellen.(B) Lebensfähigkeit von mit G-Rg3r behandelten hEL-Zellen.(C) Lebensfähigkeit von mit G-Rg3 behandelten hEL-Zellen.(D) Lebensfähigkeit von mit B(a)P und G-Rg3r behandelten hEL-Zellen.(E) Lebensfähigkeit von hEL-Zellen, die mit B(a)P und G-Rg3 behandelt wurden.(F) Spiegel des BPDE-DNA-Addukts in mit B(a)P und G-Rg3 behandelten hEL-Zellen.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen ausgedrückt.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Die GST-Enzymexpression wurde nach gleichzeitiger Behandlung mit 10 μM B(a)P und 10 μM G-Rg3r oder G-Rg3s nachgewiesen.Unsere Ergebnisse zeigten, dass B(a)P die GST-Expression unterdrückte (59,7 ± 8,2 % in der G-Rg3r-Gruppe und 39 ± 4,5 % in der G-Rg3s-Gruppe) und B(a)P mit G-Rg3r assoziiert war , oder mit G-Tg3r, oder mit G-Tg3r.Die gleichzeitige Behandlung mit G-Rg3s stellte die GST-Expression wieder her.GST-Expression (103,7 ± 15,5 % in der G-Rg3r-Gruppe und 110 ± 11,1 % in der G-Rg3s-Gruppe, p < 0,05 bzw. p < 0,001, Abb. 6A, B und C).Die GST-Aktivität wurde mit einem Aktivitätstestkit bewertet.Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Kombinationsbehandlungsgruppe im Vergleich zur B(a)P-Gruppe nur eine höhere GST-Aktivität aufwies (96,3 ± 6,6 % vs. 35,7 ± 7,8 % in der G-Rg3r-Gruppe vs. 92,3 ± 6,5 % in der G-Rg3r-Gruppe). ).% vs. 35,7 ± 7,8 % in der G-Rg3s-Gruppe, p < 0,001, Abbildung 6D).
Expression von GST und Nrf2 in mit B(a)P und G-Rg3 behandelten hEL-Zellen.(A) Nachweis der GST-Expression durch Western Blot.(B) Quantitative Expression von GST in mit B(a)P und G-Rg3r behandelten hEL-Zellen.(C) Quantitative Expression von GST in mit B(a)P und G-Rg3s behandelten hEL-Zellen.(D) GST-Aktivität in mit B(a)P und G-Rg3 behandelten hEL-Zellen.(E) Nachweis der Nrf2-Expression durch Western Blot.(F) Quantitative Expression von Nrf2 in mit B(a)P und G-Rg3r behandelten hEL-Zellen.(G) Quantitative Expression von Nrf2 in mit B(a)P und G-Rg3s behandelten hEL-Zellen.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen ausgedrückt.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Um die Wege aufzuklären, die an der G-Rg3-vermittelten Unterdrückung der B(a)P-induzierten Tumorentstehung beteiligt sind, wurde die Nrf2-Expression durch Western Blot bewertet.Wie in den Abbildungen 6E,F,G dargestellt, war im Vergleich zur Kontrollgruppe nur der Nrf2-Spiegel in der B(a)P-Behandlungsgruppe verringert;Im Vergleich zur B(a)P-Behandlungsgruppe waren die B(a) Nrf2-Spiegel in der PG-Rg3-Gruppe jedoch erhöht (106 ± 9,5 % für G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6,2 % für G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % für G-Rg3s, p < 0,01).
Wir haben die präventive Rolle von Nrf2 durch die Unterdrückung der Nrf2-Expression mithilfe spezifischer Small Interfering RNA (siRNA) bestätigt.Der Abbau von Nrf2 wurde durch Western Blot bestätigt (Abb. 7A, B).Wie in den Abbildungen 7C und D gezeigt, führte die gleichzeitige Behandlung von hEL-Zellen mit B(a)P und G-Rg3 zu einer Verringerung der Anzahl der BPDE-DNA-Addukte (1,47 ± 0,21) im Vergleich zur Behandlung mit B(a)P allein in der Kontroll-siRNA-Gruppe.) G-Rg3r betrug 4,13 ± 0,49, G-Rg3s betrug 1,8 ± 0,32 und 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Allerdings wurde die hemmende Wirkung von G-Rg3 auf die BPDE-DNA-Bildung durch Nrf2-Knockdown aufgehoben.In der siNrf2-Gruppe gab es keinen signifikanten Unterschied in der BPDE-DNA-Adduktbildung zwischen der gleichzeitigen Behandlung mit B(a)P und G-Rg3 und der alleinigen Behandlung mit B(a)P (3,0 ± 0,21 für G-Rg3r gegenüber 3,56 ± 0,32). ).für G-Rg3r versus 3,6 für G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Auswirkung des Nrf2-Knockdowns auf die BPDE-DNA-Adduktbildung in hEL-Zellen.(A) Nrf2-Knockdown wurde durch Western Blot bestätigt.(B) Quantifizierung der Intensität der Nrf2-Bande.(C) Wirkung des Nrf2-Knockdowns auf die BPDE-DNA-Adduktspiegel in mit B(a)P und G-Rg3r behandelten hEL-Zellen.(D) Auswirkung des Nrf2-Knockdowns auf die BPDE-DNA-Adduktspiegel in mit B(a)P und G-Rg3 behandelten hEL-Zellen.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen ausgedrückt.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
In dieser Studie wurden die präventiven Wirkungen verschiedener Extrakte aus rotem Ginseng an einem Mausmodell für B(a)P-induzierten Lungenkrebs untersucht. Die Behandlung mit KRGB reduzierte die Tumorlast erheblich.Da G-Rg3 den höchsten Gehalt in diesem Ginsengextrakt aufweist, wurde die wichtige Rolle dieses Ginsenosids bei der Hemmung der Tumorentstehung untersucht.Sowohl G-Rg3r als auch G-Rg3 (zwei Epimere von G-Rg3) reduzierten die Tumorlast in einem Mausmodell für B(a)P-induzierten Krebs signifikant.G-Rg3r und G-Rg3 üben eine krebshemmende Wirkung aus, indem sie die Apoptose von Tumorzellen induzieren21, das Tumorwachstum hemmen22, den Zellzyklus anhalten23 und die Angiogenese beeinflussen24.Es wurde auch gezeigt, dass G-Rg3 die zelluläre Metastasierung hemmt25, und die Fähigkeit von G-Rg3, die Wirkung von Chemotherapie und Strahlentherapie zu verstärken, wurde dokumentiert26,27.Poon et al. zeigten, dass die Behandlung mit G-Rg3 die genotoxischen Wirkungen von B(a)P28 reduzieren könnte.Diese Studie zeigt das therapeutische Potenzial von G-Rg3 bei der Bekämpfung krebserregender Umweltmoleküle und der Krebsprävention.
Trotz ihres guten prophylaktischen Potenzials stellt die schlechte orale Bioverfügbarkeit von Ginsenosiden eine Herausforderung für den klinischen Einsatz dieser Moleküle dar.Die pharmakokinetische Analyse der oralen Verabreichung von Ginsenosiden an Ratten zeigte, dass ihre Bioverfügbarkeit immer noch weniger als 5 % beträgt29.Diese Tests zeigten, dass nach der 20-wöchigen Behandlungsdauer nur der Blutspiegel von Rg5 abnahm.Obwohl der zugrunde liegende Mechanismus der schlechten Bioverfügbarkeit noch geklärt werden muss, wird angenommen, dass P-gp am Ausfluss von Ginsenosiden beteiligt ist.Diese Arbeit zeigte zum ersten Mal, dass die Verabreichung von Verapamil, einem P-gp-Blocker, die orale Bioverfügbarkeit von G-Rg3r und G-Rg3s erhöht.Dieser Befund legt daher nahe, dass G-Rg3r und G-Rg3s als Substrate von P-gp fungieren, um dessen Ausfluss zu regulieren.
Diese Arbeit zeigt, dass eine Kombinationsbehandlung mit Verapamil die orale Bioverfügbarkeit von G-Rg3 in einem Mausmodell für Lungenkrebs erhöht.Dieser Befund wird durch einen erhöhten intestinalen transzellulären Transport von G-Rg3 bei P-gp-Blockade gestützt, wodurch dessen Absorption erhöht wird.Tests in Caco2-Zellen zeigten, dass die Behandlung mit Verapamil den Ausfluss von G-Rg3r und G-Rg3s reduzierte und gleichzeitig die Membranpermeabilität verbesserte.Eine Studie von Yang et al.Studien haben gezeigt, dass die Behandlung mit Cyclosporin A (einem anderen P-gp-Blocker) die Bioverfügbarkeit von Ginsenosid Rh2 von einem Ausgangswert von 1 %20 auf über 30 % erhöht.Die Ginsenoside-Verbindungen K und Rg1 zeigten ebenfalls ähnliche Ergebnisse30,31.Bei gleichzeitiger Verabreichung von Verapamil und Cyclosporin A wurde der Ausfluss von Verbindung K in Caco-2-Zellen deutlich von 26,6 auf weniger als 3 reduziert, während die intrazellulären Spiegel um das 40-fache anstiegen30.In Gegenwart von Verapamil stiegen die Rg1-Spiegel in den Lungenepithelzellen von Ratten an, was auf eine Rolle von P-gp beim Ginsenosid-Ausfluss schließen lässt, wie Meng et al.31 zeigten.Allerdings hatte Verapamil nicht die gleiche Wirkung auf den Efflux einiger Ginsenoside (wie Rg1, F1, Rh1 und Re), was darauf hindeutet, dass sie nicht durch P-gp-Substrate beeinflusst werden, wie von Liang et al. gezeigt wurde.32 .Diese Beobachtung könnte mit der Beteiligung anderer Transporter und alternativer Ginsenosidstrukturen zusammenhängen.
Der Mechanismus der präventiven Wirkung von G-Rg3 auf Krebs ist unklar.Frühere Studien haben gezeigt, dass G-Rg3 DNA-Schäden und Apoptose verhindert, indem es oxidativen Stress und Entzündungen reduziert16,33, was der zugrunde liegende Mechanismus zur Verhinderung der B(a)P-induzierten Tumorentstehung sein könnte.Einige Berichte deuten darauf hin, dass die durch B(a)P induzierte Genotoxizität durch Modulation von Phase-II-Enzymen zur Bildung von BPDE-DNA34 verringert werden kann.GST ist ein typisches Phase-II-Enzym, das die Bildung von BPDE-DNA-Addukten hemmt, indem es die Bindung von GSH an BPDE fördert und dadurch durch B(a)P35 verursachte DNA-Schäden reduziert.Unsere Ergebnisse zeigen, dass die G-Rg3-Behandlung die B(a)P-induzierte Zytotoxizität und die BPDE-DNA-Adduktbildung in hEL-Zellen reduziert und die GST-Expression und -Aktivität in vitro wiederherstellt.Diese Effekte waren jedoch in Abwesenheit von Nrf2 nicht vorhanden, was darauf hindeutet, dass G-Rg3 über den Nrf2-Weg zytoprotektive Wirkungen induziert.Nrf2 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor für Phase-II-Entgiftungsenzyme, der die Clearance von Xenobiotika fördert36.Die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs induziert Zytoprotektion und reduziert Gewebeschäden37.Darüber hinaus haben mehrere Berichte die Rolle von Nrf2 als Tumorsuppressor bei der Karzinogenese unterstützt38.Unsere Studie zeigt, dass die Induktion des Nrf2-Signalwegs durch G-Rg3 eine wichtige regulatorische Rolle bei der B(a)P-induzierten Genotoxizität spielt, indem sie eine B(a)P-Entgiftung durch Aktivierung von Phase-II-Enzymen bewirkt und dadurch den Tumorentstehungsprozess hemmt.
Unsere Arbeit zeigt das Potenzial von rotem Ginseng bei der Vorbeugung von B(a)P-induziertem Lungenkrebs bei Mäusen durch die wichtige Beteiligung von Ginsenosid G-Rg3.Die schlechte orale Bioverfügbarkeit dieses Moleküls erschwert seine klinische Anwendung.Diese Studie zeigt jedoch zum ersten Mal, dass G-Rg3 ein Substrat von P-gp ist und die Verabreichung eines P-gp-Inhibitors die Bioverfügbarkeit von G-Rg3 in vitro und in vivo erhöht.G-Rg3 reduziert die B(a)P-induzierte Zytotoxizität durch Regulierung des Nrf2-Signalwegs, was ein potenzieller Mechanismus für seine präventive Funktion sein könnte.Unsere Studie bestätigt das Potenzial von Ginsenosid G-Rg3 zur Vorbeugung und Behandlung von Lungenkrebs.
Sechs Wochen alte weibliche A/J-Mäuse (20 ± 1 g) und 7 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (250 ± 20 g) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) und dem Wuhan Institute of Zoology erhalten.Universität (Wuhan, China).Das Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, China) stellte uns Caco-2- und hEL-Zellen zur Verfügung.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) ist eine Quelle für B(a)P und Tricaprin.Gereinigte Ginsenoside G-Rg3r und G-Rg3s, Dimethylsulfoxid (DMSO), CellTiter-96 Proliferation Assay Kit (MTS), Verapamil, Minimal Essential Medium (MEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Chengdu Must Bio-Technology bezogen .Co., Ltd.(Chengdu, China).Das QIAamp-DNA-Mini-Kit und das BPDE-DNA-Addukt-ELISA-Kit wurden von Qiagen (Stanford, CA, USA) und Cell Biolabs (San Diego, CA, USA) erworben.Das GST-Aktivitäts-Assay-Kit und das Gesamtprotein-Assay-Kit (Standard-BCA-Methode) wurden von Solarbio (Peking, China) gekauft.Alle Extrakte aus rotem Ginseng werden im Mingyu-Labor 7 gelagert. Die Hong Kong Baptist University (Hongkong, China) und das Korea Cancer Center (Seoul, Korea) sind kommerzielle Quellen für CRG-Extrakt und verschiedene Extrakte aus rotem Ginseng verschiedener koreanischer Herkunft (einschließlich KRGA, KRGB). und KRGC).Roter Ginseng wird aus den Wurzeln von 6 Jahre altem frischem Ginseng hergestellt.Roter Ginseng-Extrakt wird durch dreimaliges Waschen von Ginseng mit Wasser, anschließendes Konzentrieren des wässrigen Extrakts und schließlich Trocknen bei niedriger Temperatur gewonnen, um Ginseng-Extrakt-Pulver zu erhalten.Antikörper (Anti-Nrf2, Anti-GST und β-Actin), Meerrettichperoxidase-konjugiertes Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (IgG), Transfektionsreagenz, Kontroll-siRNA und Nrf2-siRNA wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) erworben. .), USA).
Caco2- und hEL-Zellen wurden in 100-mm2-Zellkulturschalen mit MEM, das 10 % FBS enthielt, bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert.Um die Wirkung der Behandlungsbedingungen zu bestimmen, wurden hEL-Zellen 48 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von B(a)P und G-Rg3 in MEM inkubiert.Zellen können weiter analysiert oder gesammelt werden, um zellfreie Extrakte herzustellen.
Alle Experimente wurden von der Ethikkommission für Versuchstiere des Tongji Medical College der Huazhong University of Science and Technology genehmigt (Genehmigungsnummer 2019; Registrierungsnummer 4587TH).Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, und die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien „Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments“ (ARRIVE) durchgeführt.Acht Wochen alten A/J-Mäusen wurde zunächst B(a)P in Tricaprinlösung (100 mg/kg, 0,2 ml) intraperitoneal injiziert.Nach einer Woche wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Kontrollgruppen und verschiedene Behandlungsgruppen aufgeteilt, jeweils 15 Mäuse, und einmal täglich mit einer Sonde gefüttert.Nach 20-wöchiger Behandlung wurden die Tiere durch CO2-Erstickung getötet.Die Lungen wurden gesammelt und 24 Stunden lang fixiert.Die Anzahl der oberflächlichen Tumoren und die einzelnen Tumorgrößen wurden für jede Lunge unter einem Präpariermikroskop quantifiziert.Schätzungen des Tumorvolumens (V) wurden unter Verwendung des folgenden Ausdrucks berechnet: V (mm3) = 4/3πr3, wobei r der Tumordurchmesser ist.Die Nettosumme aller Tumorvolumina in der Lunge von Mäusen stellte das Gesamttumorvolumen dar, und das durchschnittliche Gesamttumorvolumen in jeder Gruppe stellte die Tumorlast dar.Vollblut- und Darmproben wurden gesammelt und zur UPLC-MS/MS-Bestimmung bei –80 °C gelagert.Serum wurde gesammelt und ein automatisiertes Chemieanalysegerät zur Analyse der Alaninaminotransferase (ALT)- und Serumkreatinin (Cr)-Spiegel verwendet, um die Leber- und Nierenfunktion zu beurteilen.
Die gesammelten Proben wurden aus der Kühllagerung genommen, aufgetaut, gewogen und wie oben beschrieben in Röhrchen gegeben.Dazu wurden 0,5 μM Phlorizin (interner Standard) in 0,8 ml Methanollösung gegeben.Anschließend wurde das Gewebe mit Tissue-Tearor homogenisiert und das Homogenat anschließend in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 15500 U/min zentrifugiert.Nach Entfernen von 1,0 ml Überstand mit Stickstoff trocknen.Zur Rückgewinnung wurden 200 Mikroliter Methanol verwendet.Das Blut wird auf einer Linie gesammelt und verarbeitet und dient als Referenz für alle Messungen.
Transwell-Platten mit 24 Vertiefungen wurden mit 1,0 × 105 Caco-2-Zellen pro Vertiefung besät, um die mögliche Verbesserung des G-Rg3-Transports durch die Zugabe von Verapamil zu bewerten.Nach dreiwöchiger Kultur wurden die Zellen mit HBSS gewaschen und bei 37 °C vorinkubiert.400 μl 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s oder eine Mischung mit 50 oder 100 μM Verapamil) wurden auf die basolaterale oder apikale Seite der Monoschicht injiziert und 600 μl HBSS-Lösung auf die andere Seite gegeben Seite.Sammeln Sie 100 µl Kulturmedium zu den angegebenen Zeiten (0, 15, 30, 45, 60, 90 und 120 Minuten) und fügen Sie 100 µl HBSS hinzu, um dieses Volumen aufzufüllen.Die Proben wurden bis zum Nachweis durch UPLC-MS/MS bei –4 °C gelagert.Der Ausdruck Papp = dQ/(dT × A × C0) wird verwendet, um die scheinbare unidirektionale apikale und basolaterale Permeabilität und umgekehrt (Pa-b bzw. Pb-a) zu quantifizieren;dQ/dT ist die Konzentrationsänderung, A (0,6 cm2) ist die Oberfläche der Monoschicht und C0 ist die anfängliche Donorkonzentration.Das Efflux-Verhältnis wird als Pb-a/Pa-b berechnet, was die Efflux-Rate des Studienmedikaments darstellt.
Männliche Wistar-Ratten ließen 24 Stunden lang fasten, tranken nur Wasser und wurden mit einer intravenösen Injektion einer 3,5 %igen Pentobarbitallösung betäubt.Der intubierte Silikonschlauch hat das Ende des Zwölffingerdarms als Eingang und das Ende des Ileums als Ausgang.Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um den Einlass mit 10 µM G-Rg3r oder G-Rg3s in isotonischem HBSS mit einer Durchflussrate von 0,1 ml/min zu pumpen.Die Wirkung von Verapamil wurde durch Zugabe von 50 μM oder 100 μM der Verbindung zu 10 μM G-Rg3r oder G-Rg3s bewertet.UPLC-MS/MS wurde an Perfusionsextrakten durchgeführt, die zu den Zeitpunkten 60, 90, 120 und 150 Minuten nach Beginn der Perfusion gesammelt wurden.Der Prozentsatz der Absorption wird durch die Formel % Absorption = (1 – Cout/Cin) × 100 % quantifiziert;Die Konzentration von G-Rg3 am Auslass und am Einlass wird durch Cout bzw. Cin ausgedrückt.
hEL-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät und mit B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) oder G-Rg3, gelöst in DMSO, behandelt .Anschließend wurden die Arzneimittel über 48 Stunden mit Kulturmedium auf verschiedene Konzentrationen (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) verdünnt.Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen MTS-Assay-Kits wurden die Zellen einem Standardprotokoll unterzogen und dann mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei 490 nm gemessen.Das Niveau der Zelllebensfähigkeit der mit B(a)P (10 μM) und G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) gleichzeitig behandelten Gruppen wurde gemäß der oben genannten Methode bewertet und mit der unbehandelten Gruppe verglichen.
hEL-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Well ausgesät und mit 10 μMB(a)P in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μM G-Rg3 behandelt.Nach 48 Stunden Behandlung wurde DNA aus hEL-Zellen mit dem QIAamp DNA Mini Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert.Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten wurde mit einem BPDE-DNA-Addukt-ELISA-Kit nachgewiesen.Die relativen Konzentrationen des BPDE-DNA-Addukts wurden mit einem Mikroplatten-Lesegerät durch Messung der Absorption bei 450 nm gemessen.
hEL-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät und 48 Stunden lang mit 10 μMB(a)P in Abwesenheit oder Gegenwart von 10 μM G-Rg3 behandelt.Die GST-Aktivität wurde mit einem kommerziellen GST-Aktivitätstestkit gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.Die relative GST-Aktivierung wurde durch Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.
hEL-Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und dann unter Verwendung von Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer, der Proteaseinhibitoren und Phosphataseinhibitoren enthielt, lysiert.Nach der Proteinquantifizierung mit einem Gesamtprotein-Assay-Kit wurden 30 μg Protein in jeder Probe durch 12 % SDS-PAGE aufgetrennt und durch Elektrophorese auf eine PVDF-Membran übertragen.Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert.Nach der Inkubation mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern wurden verstärkte Chemilumineszenzreagenzien hinzugefügt, um das Bindungssignal sichtbar zu machen.Die Intensität jeder Proteinbande wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert.
Zur Analyse aller Daten wurde die Software GraphPad Prism 7.0 verwendet, ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung.Die Variation zwischen den Behandlungsgruppen wurde mithilfe des Student-t-Tests oder einer einseitigen Varianzanalyse bewertet, wobei ein P-Wert <0,05 auf statistische Signifikanz hinweist.
Alle während dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und den ergänzenden Informationsdateien enthalten.
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Zeitpunkt der Veröffentlichung: 17.09.2023