Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε μια νεότερη έκδοση του προγράμματος περιήγησής σας (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, προβάλλουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ ή JavaScript.
Το κόκκινο ginseng χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή ασιατική ιατρική εδώ και εκατοντάδες χρόνια.Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την ικανότητα τεσσάρων τύπων κόκκινου ginseng (κινέζικο κόκκινο ginseng, κορεατικό κόκκινο ginseng Α, κορεατικό κόκκινο ginseng B και κορεατικό κόκκινο ginseng C) που καλλιεργούνται σε διαφορετικές περιοχές να αναστέλλουν το σχηματισμό και την ανάπτυξη πνεύμονα που προκαλείται από καρκινογόνο όγκους.Μια δοκιμή βενζο(α)πυρενίου (B(a)P) διεξήχθη σε ποντίκια A/J και το κορεατικό κόκκινο ginseng B βρέθηκε ότι είναι το πιο αποτελεσματικό στη μείωση του φορτίου του όγκου μεταξύ των τεσσάρων ποικιλιών κόκκινου ginseng.Επιπλέον, αναλύσαμε το περιεχόμενο διαφόρων ginsenosides (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 και Rg5) σε τέσσερα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng και βρήκαμε ότι το κορεατικό κόκκινο ginseng B είχε τα πιο υψηλά επίπεδα ginsenoside Rg3 (G-Rg3), γεγονός που υποδηλώνει ότι το G-Rg3 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπευτική του αποτελεσματικότητα.Αυτή η εργασία δείχνει ότι το G-Rg3 έχει σχετικά χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα.Ωστόσο, όταν το G-Rg3 συγχορηγήθηκε με τον αναστολέα P-gp βεραπαμίλη, η εκροή του G-Rg3 στα κύτταρα Caco-2 μειώθηκε, ο ρυθμός εντερικής απορρόφησης του G-Rg3 αυξήθηκε σε ένα μοντέλο αρουραίου και το G-Rg3 αυξήθηκε.Στα κύτταρα Caco-2, η εκροή του Rg3 μειώνεται και το επίπεδο της συγκέντρωσης του Rg3 μειώνεται.Το G-Rg3 αυξάνεται στο έντερο και στο πλάσμα και η ικανότητά του να αποτρέπει όγκους ενισχύεται επίσης σε ένα μοντέλο αρουραίου επαγόμενης από Β(α)Ρ ογκογένεση.Βρήκαμε επίσης ότι το G-Rg3 μείωσε την επαγόμενη από B(a)P κυτταροτοξικότητα και τον σχηματισμό προσθήκης DNA σε ανθρώπινα πνευμονικά κύτταρα και αποκατέστησε την έκφραση και τη δραστηριότητα των ενζύμων φάσης II μέσω της οδού Nrf2, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τον πιθανό μηχανισμό δράσης αναστολής G -Rg3..Σχετικά με την εμφάνιση όγκων του πνεύμονα.Η μελέτη μας καταδεικνύει έναν δυνητικά σημαντικό ρόλο για το G-Rg3 στη στόχευση όγκων του πνεύμονα σε μοντέλα ποντικών.Η από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα αυτού του ginsenoside ενισχύεται με τη στόχευση της P-γλυκοπρωτεΐνης, επιτρέποντας στο μόριο να ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις.
Ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του πνεύμονα είναι ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), ο οποίος είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτων από καρκίνο στην Κίνα και τη Βόρεια Αμερική1,2.Ο κύριος παράγοντας που αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα είναι το κάπνισμα.Ο καπνός του τσιγάρου περιέχει περισσότερες από 60 καρκινογόνες ουσίες, συμπεριλαμβανομένου του βενζο(α)πυρενίου (B(a)P), των νιτροζαμινών και των ραδιενεργών ισοτόπων από τη διάσπαση του ραδονίου.3 Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες B(a)P είναι η κύρια αιτία τοξικότητας στο τσιγάρο καπνός.Κατά την έκθεση στο B(a)P, το κυτόχρωμα P450 το μετατρέπει σε B(a)P-7,8-διυδροδιόλη-9,10-εποξείδιο (BPDE), το οποίο αντιδρά με το DNA για να σχηματίσει το προϊόν προσθήκης BPDE-DNA 4. Επιπλέον, αυτά Τα προϊόντα προσθήκης προκαλούν ογκογένεση πνεύμονα σε ποντίκια με στάδιο όγκου και ιστοπαθολογία παρόμοια με τους όγκους του ανθρώπινου πνεύμονα5.Αυτό το χαρακτηριστικό καθιστά το μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από B(a)P ένα κατάλληλο σύστημα για την αξιολόγηση ενώσεων με πιθανές αντικαρκινικές ιδιότητες.
Μια πιθανή στρατηγική για την πρόληψη της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα σε ομάδες υψηλού κινδύνου, ιδιαίτερα στους καπνιστές, είναι η χρήση χημειοπροληπτικών παραγόντων για την καταστολή της ανάπτυξης ενδοεπιθηλιακών νεοπλασματικών βλαβών και ως εκ τούτου την πρόληψη της μετέπειτα εξέλιξης τους σε κακοήθεια.Μελέτες σε ζώα δείχνουν ότι διάφοροι χημειοπροληπτικοί παράγοντες είναι αποτελεσματικοί6.Η προηγούμενη έκθεσή μας7 τόνισε τα καλά προληπτικά αποτελέσματα του κόκκινου τζίνσενγκ στον καρκίνο του πνεύμονα.Αυτό το βότανο έχει χρησιμοποιηθεί για αιώνες στην παραδοσιακή ασιατική ιατρική για να παρατείνει τη ζωή και την υγεία και έχει τεκμηριωθεί ότι έχει αντικαρκινικά αποτελέσματα8.
Ο ενεργός παράγοντας του ginseng είναι η ginsenoside, η οποία χρησιμοποιείται ως σύνθετος δείκτης για την αξιολόγηση της ποιότητας των εκχυλισμάτων ginseng.Η ποσοτική ανάλυση των ακατέργαστων εκχυλισμάτων ginseng τυπικά περιλαμβάνει τη χρήση πολλών ginsenosides, συμπεριλαμβανομένων των RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 και Rc9,10.Οι ινσενοσίδες έχουν μικρή κλινική χρήση λόγω της πολύ κακής βιοδιαθεσιμότητάς τους από το στόμα11.Αν και ο μηχανισμός αυτής της κακής βιοδιαθεσιμότητας δεν είναι ξεκάθαρος, η εκροή των ginsenosides που προκαλείται από την P-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp)12 μπορεί να είναι η αιτία.Το P-gp είναι ένας από τους σημαντικότερους μεταφορείς εκροής στην υπεροικογένεια μεταφορέων κασετών σύνδεσης ATP, ο οποίος χρησιμοποιεί την ενέργεια της υδρόλυσης ATP για να απελευθερώσει ενδοκυτταρικές ουσίες στο εξωτερικό περιβάλλον.Οι μεταφορείς P-gp είναι συνήθως ευρέως κατανεμημένοι στο έντερο, στους νεφρούς, στο ήπαρ και στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό13.Η P-gp παίζει κρίσιμο ρόλο στην εντερική απορρόφηση και η αναστολή της P-gp αυξάνει την από του στόματος απορρόφηση και τη διαθεσιμότητα ορισμένων αντικαρκινικών φαρμάκων12,14.Παραδείγματα αναστολέων που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως στη βιβλιογραφία είναι η βεραπαμίλη και η κυκλοσπορίνη Α15.Αυτή η εργασία περιλαμβάνει τη δημιουργία ενός συστήματος ποντικιού για τη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από B(a)P για την αξιολόγηση της ικανότητας διαφορετικών εκχυλισμάτων κόκκινου ginseng από την Κίνα και την Κορέα να επηρεάζουν κακοήθειες.Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν ξεχωριστά για τον εντοπισμό συγκεκριμένων ginsenosides που μπορεί να επηρεάσουν την καρκινογένεση.Στη συνέχεια, η βεραπαμίλη χρησιμοποιήθηκε για τη στόχευση της P-gp και τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας από το στόμα και της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των ginsenosides που στοχεύουν τον καρκίνο.
Ο μηχανισμός με τον οποίο οι σαπωνίνες του ginseng ασκούν θεραπευτικά αποτελέσματα στην καρκινογένεση παραμένει ασαφής.Έρευνες έχουν δείξει ότι διάφορες ginsenosides μπορούν να μειώσουν τη βλάβη του DNA που προκαλείται από καρκινογόνες ουσίες, μειώνοντας το οξειδωτικό στρες και ενεργοποιώντας τα ένζυμα αποτοξίνωσης φάσης II, αποτρέποντας έτσι την κυτταρική βλάβη.Η γλουταθειόνη S-τρανσφεράση (GST) είναι ένα τυπικό ένζυμο φάσης ΙΙ που απαιτείται για τη μείωση της βλάβης του DNA που προκαλείται από καρκινογόνες ουσίες17.Ο παράγοντας 2 που σχετίζεται με το πυρηνικό ερυθροειδές 2 (Nrf2) είναι ένας σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την οξειδοαναγωγική ομοιόσταση και ενεργοποιεί την έκφραση των ενζύμων φάσης ΙΙ και τις κυτταροπροστατευτικές αντιοξειδωτικές αποκρίσεις18.Η μελέτη μας εξέτασε επίσης τις επιδράσεις των ταυτοποιημένων ginsenosides στη μείωση της επαγόμενης από B(a)P κυτταροτοξικότητας και του σχηματισμού προσθήκης BPDE-DNA, καθώς και στην επαγωγή ενζύμων φάσης II ρυθμίζοντας την οδό Nrf2 σε φυσιολογικά πνευμονικά κύτταρα.
Η καθιέρωση ενός μοντέλου ποντικού καρκίνου που προκαλείται από Β(α)Ρ είναι σύμφωνη με την προηγούμενη εργασία5.Το Σχήμα 1Α δείχνει τον πειραματικό σχεδιασμό μιας θεραπείας 20 εβδομάδων ενός μοντέλου καρκίνου ποντικού που προκαλείται από B(a)P, νερό (έλεγχος), εκχύλισμα κινέζικου κόκκινου ginseng (CRG), κορεατικό κόκκινο εκχύλισμα ginseng A (KRGA) και κορεατικό κόκκινο τζίνσενγκ.Εκχύλισμα Β (KRGB) και Εκχύλισμα Κορεατικού Κόκκινου Τζίνσενγκ Γ (KRGC).Μετά από 20 εβδομάδες θεραπείας με κόκκινο ginseng, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με ασφυξία με CO2.Το Σχήμα 1Β δείχνει μακροσκοπικούς όγκους πνεύμονα σε ζώα που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικούς τύπους κόκκινου τζίνσενγκ και το Σχήμα 1Γ δείχνει μια αντιπροσωπευτική μικρογραφία φωτός ενός δείγματος όγκου.Το φορτίο όγκου των ζώων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με KRGB (1,5 ± 0,35) ήταν χαμηλότερο από αυτό των ζώων ελέγχου (0,82 ± 0,2, Ρ < 0,05), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Δ.Ο μέσος βαθμός αναστολής του φορτίου όγκου ήταν 45%.Άλλα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng που δοκιμάστηκαν δεν έδειξαν τόσο σημαντικές αλλαγές στο φορτίο του όγκου (P > 0,05).Δεν παρατηρήθηκαν εμφανείς παρενέργειες στο μοντέλο ποντικού κατά τη διάρκεια 20 εβδομάδων θεραπείας με κόκκινο τζίνσενγκ, συμπεριλαμβανομένης της αλλαγής στο σωματικό βάρος (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και της τοξικότητας στο ήπαρ ή τα νεφρά (Εικόνα 1Ε, ΣΤ).
Το εκχύλισμα κόκκινου ginseng αντιμετωπίζει την ανάπτυξη όγκου του πνεύμονα σε ποντίκια A/J.(Α) Πειραματικό σχέδιο.(Β) Μεγάλοι όγκοι πνεύμονα σε μοντέλο ποντικού.Οι όγκοι υποδεικνύονται με βέλη.α: Ομάδα κινέζικου κόκκινου τζίνσενγκ.β: ομάδα Α κορεατικού κόκκινου ginseng.γ: Ομάδα κόκκινου κορεατικού τζίνσενγκ Β. δ: ομάδα κορεατικού κόκκινου τζίνσενγκ Γ. δ: Ομάδα ελέγχου.(Γ) Ελαφρύ μικρογράφημα που δείχνει όγκο πνεύμονα.Μεγέθυνση: 100. β: 400. (Δ) Φορτίο όγκου στην ομάδα εκχυλίσματος κόκκινου ginseng.(Ε) Επίπεδα πλάσματος του ηπατικού ενζύμου ALT.(ΣΤ) Επίπεδα πλάσματος του νεφρικού ενζύμου Cr.Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση.*P <0,05.
Τα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng που προσδιορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας διαδοχικής χρωματογραφίας υγρής υπεραπόδοσης (UPLC-MS/MS) για να ποσοτικοποιηθούν οι ακόλουθοι τζινσενοσίδες: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 και Rg5.Οι συνθήκες UPLC και MS που χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των αναλυτών περιγράφηκαν σε προηγούμενη αναφορά19.Τα χρωματογραφήματα UPLC-MS/MS τεσσάρων εκχυλισμάτων κόκκινου ginseng φαίνονται στο Σχήμα 2Α.Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη συνολική περιεκτικότητα σε τζινσενοσίδη, με την υψηλότερη συνολική περιεκτικότητα σε τζινσενοσίδη σε CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Εικόνα 2Β).Κατά την αξιολόγηση μεμονωμένων ginsenosides (Εικόνα 2C), το KRGB έδειξε το υψηλότερο επίπεδο G-Rg3 σε σύγκριση με άλλες ginsenosides (58,33 ± 3,81 μmol/L για το G-Rg3s και 41,56 ± 2,88 μmol/L για το G-Rg3r).L).κόκκινου τύπου ginseng (P < 0,001).Το G-Rg3 εμφανίζεται ως ένα ζεύγος στερεοϊσομερών G-Rg3r και G-Rg3s, τα οποία διαφέρουν στη θέση της ομάδας υδροξυλίου στον άνθρακα 20 (Εικ. 2D).Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το G-Rg3r ή το G-Rg3 μπορεί να έχουν σημαντικό αντικαρκινικό δυναμικό σε ένα μοντέλο καρκίνου ποντικού που προκαλείται από B(a)P.
Περιεκτικότητα σε ginsenosides σε διάφορα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng.(Α) Χρωματογραφήματα UPLC-MS/MS τεσσάρων εκχυλισμάτων κόκκινου ginseng.(Β) Εκτίμηση της συνολικής περιεκτικότητας ginsenoside στα αναφερόμενα εκχυλίσματα.(Γ) Ανίχνευση μεμονωμένων ginsenosides σε επισημασμένα εκχυλίσματα.(Δ) Δομές στερεοϊσομερών ginsenoside G-Rg3r και G-Rg3s.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών.***P <0,001.
Η μελέτη UPLC-MS/MS απαιτούσε τον ποσοτικό προσδιορισμό των ginsenosides σε δείγματα εντέρου και αίματος μετά από 20 εβδομάδες θεραπείας.Η θεραπεία με KRGB έδειξε την παρουσία μόνο 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 στο αίμα.Δεν ανιχνεύθηκαν εναπομείνασες τζινσενοσίδες, υποδεικνύοντας κακή βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα και συνεπώς μειωμένη έκθεση σε αυτές τις τζινσενοσίδες.
Η κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου Caco-2 είναι μορφολογικά και βιοχημικά παρόμοια με τα ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, αποδεικνύοντας τη χρησιμότητά της στην αξιολόγηση της μεταφοράς εντεροκυττάρων μέσω του φραγμού του εντερικού επιθηλίου.Αυτή η ανάλυση βασίστηκε σε προηγούμενη μελέτη 20 .Τα Σχήματα 3A,B,C,D,E,F δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες διακυτταρικής μεταφοράς των G-Rg3r και G-Rg3 χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μονοστοιβάδας Caco-2.Η διακυτταρική μεταφορά του G-Rg3r ή του G-Rg3 κατά μήκος των μονοστοιβάδων Caco-2 από τη βασεοπλάγια στην κορυφαία πλευρά (Pb-a) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό,τι από την κορυφή στη βασεοπλάγια πλευρά (Pa-b).Για το G-Rg3r, η μέση τιμή Pa-b ήταν 0,38 ± 0,06, η οποία αυξήθηκε σε 0,73 ± 0,06 μετά από θεραπεία με 50 μmol/L βεραπαμίλη και σε 1,14 ± 0,09 μετά από θεραπεία με 100 μmol/L βεραπαμίλη (p < 0,01 αντίστοιχα, Εικόνα 2).3Α).Οι παρατηρήσεις για το G-Rg3 ακολούθησαν παρόμοιο μοτίβο (Εικ. 3Β) και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με βεραπαμίλη ενίσχυσε τη μεταφορά των G-Rg3r και G-Rg3.Η θεραπεία με βεραπαμίλη οδήγησε επίσης σε σημαντική μείωση στις μέσες αναλογίες εκροής Pb-a και G-Rg3r και G-Rg3s (Εικόνα 3C,D,E,F), υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με βεραπαμίλη μειώνει την περιεκτικότητα σε ginsenoside στα κύτταρα εκροής Caco-2..
Διακυτταρική μεταφορά του G-Rg3 σε μονοστιβάδες Caco-2 και εντερική απορρόφηση σε μια δοκιμασία αιμάτωσης αρουραίου.(Α) Τιμή Pa-b της ομάδας G-Rg3r στη μονοστιβάδα Caco-2.(Β) Τιμή Pa-b των ομάδων G-Rg3s στη μονοστιβάδα Caco-2.(C) Τιμή Pb της ομάδας G-Rg3r στη μονοστιβάδα Caco-2.(D) Τιμή Pb των ομάδων G-Rg3s στη μονοστιβάδα Caco-2.(Ε) Αναλογία απόδοσης ομάδων G-Rg3r σε μονοστιβάδα Caco-2.(F) Αναλογία απόδοσης ομάδων G-Rg3 σε μονοστιβάδα Caco-2.(Ζ) Ποσοστό εντερικής απορρόφησης του G-Rg3r σε μια δοκιμασία αιμάτωσης σε αρουραίους.(Η) Ποσοστό εντερικής απορρόφησης του G-Rg3 σε μια δοκιμασία αιμάτωσης σε αρουραίους.Η διαπερατότητα και η απορρόφηση συγκρίθηκαν χωρίς την προσθήκη βεραπαμίλης.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων.*Ρ <0,05, **Ρ <0,01, ***Ρ <0,001.
Σε συμφωνία με προηγούμενες εργασίες20, πραγματοποιήθηκε ορθοτοπική εντερική αιμάτωση αρουραίων για να προσδιοριστεί εάν η απορρόφηση του G-Rg3 στο έντερο αυξάνεται μετά τη θεραπεία με βεραπαμίλη.Τα Σχήματα 3G, Η δείχνουν αντιπροσωπευτικές αναλύσεις αιμάτωσης για την αξιολόγηση του ποσοστού εντερικής απορρόφησης των G-Rg3r και G-Rg3 σε αρουραίους μοντέλου καρκίνου κατά τη διάρκεια των παραπάνω χρονικών περιόδων.Το αρχικό ποσοστό ασθενούς πρόσληψης G-Rg3r περίπου 10% αυξήθηκε σε περισσότερο από 20% μετά από θεραπεία με 50 μM βεραπαμίλη και σε περισσότερο από 25% μετά από θεραπεία με 100 μΜ βεραπαμίλη.Ομοίως, το G-Rg3, το οποίο είχε αρχική πρόσληψη 10%, έδειξε επίσης μια κορυφή άνω του 20% μετά τη θεραπεία με 50 μM βεραπαμίλη και σχεδόν 30% μετά από θεραπεία με 100 μΜ βεραπαμίλη, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της P-gp από τη βεραπαμίλη ενισχύει εντερική απορρόφηση G Rg3 σε μοντέλο ποντικού καρκίνου του πνεύμονα.
Σύμφωνα με την παραπάνω μέθοδο, ποντίκια μοντέλου καρκίνου που προκλήθηκαν από Β(α)Ρ χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α.Δεν παρατηρήθηκε σημαντική απώλεια βάρους ή κλινικά σημάδια τοξικότητας στην ομάδα θεραπείας με G-Rg3 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).Μετά από 20 εβδομάδες θεραπείας, συλλέχθηκαν οι πνεύμονες κάθε ποντικού.Το Σχήμα 4Β δείχνει μακροσκοπικούς όγκους πνεύμονα σε ποντικούς στις παραπάνω ομάδες θεραπείας και το Σχήμα 4Γ δείχνει μια αντιπροσωπευτική μικρογραφία φωτός ενός αντιπροσωπευτικού όγκου.Όσον αφορά το φορτίο όγκου σε κάθε ομάδα (Εικ. 4D), οι τιμές για τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με G-Rg3r και G-Rg3s ήταν 0,75 ± 0,29 mm3 και 0,81 ± 0,30 mm3, αντίστοιχα, ενώ οι τιμές για τα ποντίκια G που έλαβαν θεραπεία με -Rg3s ήταν 1,63 αντίστοιχα ±0,40 mm3.ποντίκια ελέγχου (p < 0,001), υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με G-Rg3 μείωσε το φορτίο όγκου σε ποντίκια.Η χορήγηση βεραπαμίλης ενίσχυσε περαιτέρω αυτή τη μείωση: οι τιμές σε ποντίκια verapamil+ G-Rg3r μειώθηκαν από 0,75 ± 0,29 mm3 σε 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) και οι τιμές για βεραπαμίλη+ από 0,81 ± 0,30 mm3 μειώθηκαν σε 0,81 ± 0,30 mm3, mm3 σε ποντίκια που έλαβαν G. -Rg3s (ρ < 0,05), υποδεικνύοντας ότι η βεραπαμίλη μπορεί να ενισχύσει την ανασταλτική δράση του G-Rg3 στην ογκογένεση.Το φορτίο του όγκου δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας βεραπαμίλης, της ομάδας G-Rg3r και της ομάδας G-Rg3s και της ομάδας βεραπαμίλη+G-Rg3r και της ομάδας βεραπαμίλη+G-Rg3s.Επιπλέον, δεν υπήρχαν σημαντικές ηπατικές ή νεφρικές τοξικότητες που να σχετίζονται με τις αξιολογηθείσες θεραπείες (Εικόνα 4Ε, ΣΤ).
Επιβάρυνση όγκου μετά από θεραπεία με G-Rg3 και επίπεδα πλάσματος ή εντερικού G-Rg3r και G-Rg3 στις ενδεικνυόμενες ομάδες.(Α) Πειραματικό σχέδιο.(Β) Μακροσκοπικοί όγκοι σε μοντέλο ποντικού.Οι όγκοι υποδεικνύονται με βέλη.α: G-Rg3r.β: G-Rg3s.γ: G-Rg3r σε συνδυασμό με βεραπαμίλη.d: G-Rg3 σε συνδυασμό με βεραπαμίλη.δ: Βεραπαμίλη.ε: έλεγχος.(Γ) Οπτική μικρογραφία του όγκου σε μεγέθυνση.Απάντηση: 100x.β: 400Χ.(Δ) Επίδραση της θεραπείας με G-Rg3 + βεραπαμίλη στο φορτίο όγκου σε ποντικούς A/J.(Ε) Επίπεδα πλάσματος του ηπατικού ενζύμου ALT.(ΣΤ) Επίπεδα πλάσματος του νεφρικού ενζύμου Cr.(Ζ) Επίπεδα πλάσματος G-Rg3r ή G-Rg3 των υποδεικνυόμενων ομάδων.(Η) Επίπεδα G-Rg3r ή G-Rg3s στα έντερα των υποδεικνυόμενων ομάδων.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών.*Ρ <0,05, **Ρ <0,01, ***Ρ <0,001.
Τα επίπεδα G-Rg3 στα ποντίκια μοντέλου καρκίνου που προκλήθηκαν από Β(α)Ρ αξιολογήθηκαν με UPLC-MS/MS μετά από περίοδο θεραπείας 20 εβδομάδων σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι.Τα Σχήματα 4G και Η δείχνουν τα επίπεδα G-Rg3 στο πλάσμα και στο έντερο, αντίστοιχα.Τα επίπεδα G-Rg3r στο πλάσμα ήταν 0,44 ± 0,32 μmol/L και αυξήθηκαν σε 1,17 ± 0,47 μmol/L με ταυτόχρονη χορήγηση βεραπαμίλης (p < 0,001), ενώ τα επίπεδα του εντερικού G-Rg3r ήταν 0,53 ± 0,08 μg/l.Όταν συνδυάστηκε με βεραπαμίλη, το g αυξήθηκε σε 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Για το G-Rg3, τα αποτελέσματα ακολούθησαν παρόμοιο μοτίβο, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με βεραπαμίλη αύξησε τη βιοδιαθεσιμότητα του G-Rg3 από το στόμα σε ποντικούς A/J.
Η δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας των Β(α)Ρ και G-Rg3 σε κύτταρα hEL.Η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από το B(a)P σε κύτταρα hEL φαίνεται στο Σχήμα 5Α, ενώ οι μη τοξικές ιδιότητες των G-Rg3r και G-Rg3 φαίνονται στα Σχήματα 5Α και 5Β.5Β, Γ. Για να αξιολογηθεί το κυτταροπροστατευτικό αποτέλεσμα του G-Rg3, το B(a)P συγχορηγήθηκε με διάφορες συγκεντρώσεις G-Rg3r ή G-Rg3 σε κύτταρα hEL.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, το G-Rg3r σε συγκεντρώσεις 5 μΜ, 10 μΜ και 20 μΜ αποκατέστησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων στο 58,3%, 79,3% και 77,3%, αντίστοιχα.Παρόμοια αποτελέσματα μπορούν επίσης να φανούν στην ομάδα G-Rg3s.Όταν οι συγκεντρώσεις των G-Rg3 ήταν 5 μΜ, 10 μΜ και 20 μΜ, η βιωσιμότητα των κυττάρων αποκαταστάθηκε στο 58,3%, 72,7% και 76,7%, αντίστοιχα (Εικόνα 5Ε).).Η παρουσία προϊόντων προσθήκης BPDE-DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ELISA.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα προσθήκης BPDE-DNA ήταν αυξημένα στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με B(a)P σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, αλλά σε σύγκριση με τη συν-θεραπεία με G-Rg3, τα επίπεδα προσθήκης BPDE-DNA στην ομάδα B(a)P Β στην ομάδα που έλαβε θεραπεία, τα επίπεδα προσθήκης DNA μειώθηκαν σημαντικά.Τα αποτελέσματα της θεραπείας μόνο με B(a)P φαίνονται στο Σχήμα 5F (1,87 ± 0,33 έναντι 3,77 ± 0,42 για G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 έναντι 3,77 ± 0,42 για G-Rg3s, p < 0,0).
Κυτταρική βιωσιμότητα και σχηματισμός προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με G-Rg3 και B(a)P.(Α) Βιωσιμότητα κυττάρων hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Β(α)Ρ.(Β) Βιωσιμότητα κυττάρων hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με G-Rg3r.(Γ) Βιωσιμότητα κυττάρων hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με G-Rg3.(Δ) Βιωσιμότητα κυττάρων hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3r.(Ε) Βιωσιμότητα κυττάρων hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3.(ΣΤ) Επίπεδα προϊόντος προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών.*Ρ <0,05, **Ρ <0,01, ***Ρ <0,001.
Η έκφραση του ενζύμου GST ανιχνεύθηκε μετά από συν-θεραπεία με 10 μΜ B(a)P και 10 μΜ G-Rg3r ή G-Rg3s.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το B(a)P κατέστειλε την έκφραση GST (59,7 ± 8,2% στην ομάδα G-Rg3r και 39 ± 4,5% στην ομάδα G-Rg3s) και η B(a)P συσχετίστηκε είτε με G-Rg3r , ή με G-Rg3r, ή με G-Rg3r.Η ταυτόχρονη θεραπεία με G-Rg3s αποκατέστησε την έκφραση GST.Έκφραση GST (103,7 ± 15,5% στην ομάδα G-Rg3r και 110 ± 11,1% στην ομάδα G-Rg3s, ρ < 0,05 και ρ < 0,001, αντίστοιχα, Σχ. 6Α, Β και Γ).Η δραστηριότητα GST αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας δραστικότητας.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ομάδα θεραπείας συνδυασμού είχε υψηλότερη δραστηριότητα GST σε σύγκριση με την ομάδα μόνο B(a)P (96,3 ± 6,6% έναντι 35,7 ± 7,8% στην ομάδα G-Rg3r έναντι 92,3 ± 6,5 στην ομάδα G-Rg3r ).% έναντι 35,7 ± 7,8% στην ομάδα G-Rg3s, p < 0,001, Εικόνα 6D).
Έκφραση GST και Nrf2 σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3.(Α) Ανίχνευση έκφρασης GST με στύπωμα Western.(Β) Ποσοτική έκφραση της GST σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3r.(Γ) Ποσοτική έκφραση της GST σε κύτταρα hEL που έχουν υποστεί αγωγή με B(a)P και G-Rg3s.(Δ) Δραστικότητα GST σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Β(α)Ρ και G-Rg3.(Ε) Ανίχνευση έκφρασης Nrf2 με στύπωμα Western.(ΣΤ) Ποσοτική έκφραση του Nrf2 σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3r.(Ζ) Ποσοτική έκφραση του Nrf2 σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P και G-Rg3s.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών.*Ρ <0,05, **Ρ <0,01, ***Ρ <0,001.
Για να αποσαφηνιστούν οι οδοί που εμπλέκονται στην καταστολή της επαγόμενης από B(a)P ογκογένεσης με τη μεσολάβηση G-Rg3, η έκφραση Nrf2 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western.Όπως φαίνεται στα Σχήματα 6Ε, ΣΤ, Ζ, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, μόνο το επίπεδο του Nrf2 στην ομάδα θεραπείας Β(α)Ρ μειώθηκε.ωστόσο, σε σύγκριση με την ομάδα θεραπείας B(a)P, τα επίπεδα B(a) Nrf2 στην ομάδα PG-Rg3 ήταν αυξημένα (106 ± 9,5% για το G-Rg3r έναντι 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2% για G-Rg3r έναντι 41 ± 9,8% για G-Rg3s, p < 0,01).
Επιβεβαιώσαμε τον προληπτικό ρόλο του Nrf2 καταστέλλοντας την έκφραση Nrf2 χρησιμοποιώντας συγκεκριμένο μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA).Το knockdown Nrf2 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Εικ. 7Α, Β).Όπως φαίνεται στα Σχήματα 7C,D, η συν-επεξεργασία των κυττάρων hEL με B(a)P και G-Rg3 είχε ως αποτέλεσμα μείωση στον αριθμό των προϊόντων προσθήκης BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) σε σύγκριση με τη θεραπεία με B(a)P μόνο στην ομάδα του siRNA ελέγχου.) Το G-Rg3r ήταν 4,13 ± 0,49, το G-Rg3s ήταν 1,8 ± 0,32 και 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Ωστόσο, η ανασταλτική επίδραση του G-Rg3 στον σχηματισμό BPDE-DNA καταργήθηκε με την αναστολή του Nrf2.Στην ομάδα siNrf2, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο σχηματισμό προσθήκης BPDE-DNA μεταξύ της συν-θεραπείας B(a)P και G-Rg3 και της θεραπείας με B(a)P μόνο (3,0 ± 0,21 για G-Rg3r έναντι 3,56 ± 0,32 ).για G-Rg3r έναντι 3,6 για G-Rg3s έναντι ±0,45 έναντι 4,0±0,37, p > 0,05).
Επίδραση του knockdown Nrf2 στον σχηματισμό προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL.(Α) Το knockdown Nrf2 επιβεβαιώθηκε με Western blotting.(Β) Ποσοτικοποίηση της έντασης της ζώνης Nrf2.(Γ) Επίδραση της αναστολής Nrf2 στα επίπεδα προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε αγωγή με B(a)P και G-Rg3r.(Δ) Επίδραση της αναστολής Nrf2 στα επίπεδα προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL που υποβλήθηκαν σε αγωγή με B(a)P και G-Rg3.Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών.*Ρ <0,05, **Ρ <0,01, ***Ρ <0,001.
Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τα προληπτικά αποτελέσματα διαφόρων εκχυλισμάτων κόκκινου ginseng σε μοντέλο ποντικού καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από B(a)P και η θεραπεία KRGB μείωσε σημαντικά το φορτίο του όγκου.Λαμβάνοντας υπόψη ότι το G-Rg3 έχει την υψηλότερη περιεκτικότητα σε αυτό το εκχύλισμα ginseng, έχει μελετηθεί ο σημαντικός ρόλος αυτού του ginsenoside στην αναστολή της ογκογένεσης.Τόσο το G-Rg3r όσο και το G-Rg3 (δύο επιμερή του G-Rg3) μείωσαν σημαντικά το φορτίο του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου που προκαλείται από B(a)P.Τα G-Rg3r και G-Rg3 ασκούν αντικαρκινικά αποτελέσματα επάγοντας απόπτωση των καρκινικών κυττάρων21, αναστέλλοντας την ανάπτυξη του όγκου22, διακόπτοντας τον κυτταρικό κύκλο23 και επηρεάζοντας την αγγειογένεση24.Το G-Rg3 έχει επίσης αποδειχθεί ότι αναστέλλει την κυτταρική μετάσταση25 και η ικανότητα του G-Rg3 να ενισχύει τα αποτελέσματα της χημειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας έχει τεκμηριωθεί26,27.Οι Poon et al έδειξαν ότι η θεραπεία με G-Rg3 θα μπορούσε να μειώσει τις γονιδιοτοξικές επιδράσεις του B(a)P28.Αυτή η μελέτη καταδεικνύει τις θεραπευτικές δυνατότητες του G-Rg3 στη στόχευση περιβαλλοντικών καρκινογόνων μορίων και στην πρόληψη του καρκίνου.
Παρά το καλό προφυλακτικό τους δυναμικό, η κακή από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα των ginsenosides αποτελεί πρόκληση για την κλινική χρήση αυτών των μορίων.Η φαρμακοκινητική ανάλυση της από του στόματος χορήγησης ginsenosides σε αρουραίους έδειξε ότι η βιοδιαθεσιμότητά τους εξακολουθεί να είναι μικρότερη από 5%29.Αυτές οι δοκιμές έδειξαν ότι μετά την περίοδο θεραπείας των 20 εβδομάδων, μόνο τα επίπεδα του Rg5 στο αίμα μειώθηκαν.Αν και ο υποκείμενος μηχανισμός της κακής βιοδιαθεσιμότητας παραμένει να διευκρινιστεί, η P-gp πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην εκροή των ginsenosides.Αυτή η εργασία έδειξε για πρώτη φορά ότι η χορήγηση βεραπαμίλης, ενός αναστολέα της P-gp, αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα των G-Rg3r και G-Rg3s από το στόμα.Έτσι, αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι τα G-Rg3r και G-Rg3s δρουν ως υποστρώματα του P-gp για τη ρύθμιση της εκροής του.
Αυτή η εργασία καταδεικνύει ότι η συνδυαστική θεραπεία με βεραπαμίλη αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα του G-Rg3 από το στόμα σε ένα μοντέλο ποντικού με καρκίνο του πνεύμονα.Αυτό το εύρημα υποστηρίζεται από την αυξημένη εντερική διακυτταρική μεταφορά του G-Rg3 κατά τον αποκλεισμό της P-gp, αυξάνοντας έτσι την απορρόφησή του.Οι αναλύσεις σε κύτταρα Caco2 έδειξαν ότι η θεραπεία με βεραπαμίλη μείωσε την εκροή των G-Rg3r και G-Rg3s ενώ βελτίωσε τη διαπερατότητα της μεμβράνης.Μια μελέτη από τους Yang et al.Μελέτες έχουν δείξει ότι η θεραπεία με κυκλοσπορίνη Α (άλλος αναστολέας P-gp) αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα της ginsenoside Rh2 από μια βασική τιμή 1%20 σε περισσότερο από 30%.Παρόμοια αποτελέσματα έδειξαν και οι ενώσεις ginsenosides K και Rg130,31.Όταν η βεραπαμίλη και η κυκλοσπορίνη Α συγχορηγήθηκαν, η εκροή της ένωσης Κ στα κύτταρα Caco-2 μειώθηκε σημαντικά από 26,6 σε λιγότερο από 3, ενώ τα ενδοκυτταρικά της επίπεδα αυξήθηκαν 40 φορές30.Παρουσία βεραπαμίλης, τα επίπεδα Rg1 αυξήθηκαν στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα αρουραίου, υποδηλώνοντας έναν ρόλο για την P-gp στην εκροή ginsenoside, όπως φαίνεται από τους Meng et al.31.Ωστόσο, η βεραπαμίλη δεν είχε την ίδια επίδραση στην εκροή ορισμένων ginsenosides (όπως οι Rg1, F1, Rh1 και Re), υποδεικνύοντας ότι δεν επηρεάζονται από τα υποστρώματα P-gp, όπως φαίνεται από τους Liang et al.32 .Αυτή η παρατήρηση μπορεί να σχετίζεται με τη συμμετοχή άλλων μεταφορέων και εναλλακτικών δομών ginsenoside.
Ο μηχανισμός της προληπτικής δράσης του G-Rg3 στον καρκίνο είναι ασαφής.Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το G-Rg3 προλαμβάνει τη βλάβη του DNA και την απόπτωση μειώνοντας το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή16,33, που μπορεί να είναι ο υποκείμενος μηχανισμός για την πρόληψη της ογκογένεσης που προκαλείται από το B(a)P.Ορισμένες αναφορές υποδεικνύουν ότι η γονοτοξικότητα που προκαλείται από το B(a)P μπορεί να μειωθεί με τη ρύθμιση των ενζύμων φάσης II για να σχηματιστεί BPDE-DNA34.Το GST είναι ένα τυπικό ένζυμο φάσης ΙΙ που αναστέλλει τον σχηματισμό προσθήκης BPDE-DNA προάγοντας τη σύνδεση της GSH στο BPDE, μειώνοντας έτσι τη βλάβη του DNA που προκαλείται από το B(a)P35.Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία με G-Rg3 μειώνει την επαγόμενη από B(a)P κυτταροτοξικότητα και τον σχηματισμό προσθήκης BPDE-DNA σε κύτταρα hEL και αποκαθιστά την έκφραση και τη δραστηριότητα GST in vitro.Ωστόσο, αυτές οι επιδράσεις απουσίαζαν Nrf2, υποδηλώνοντας ότι το G-Rg3 επάγει κυτταροπροστατευτικά αποτελέσματα μέσω της οδού Nrf2.Το Nrf2 είναι ένας κύριος μεταγραφικός παράγοντας για τα ένζυμα αποτοξίνωσης φάσης ΙΙ που προάγει την κάθαρση των ξενοβιοτικών36.Η ενεργοποίηση της οδού Nrf2 επάγει την κυτταροπροστασία και μειώνει τη βλάβη των ιστών37.Επιπλέον, αρκετές αναφορές έχουν υποστηρίξει το ρόλο του Nrf2 ως ογκοκατασταλτικό στην καρκινογένεση38.Η μελέτη μας δείχνει ότι η επαγωγή της οδού Nrf2 από το G-Rg3 παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στη γονοτοξικότητα που προκαλείται από B(a)P προκαλώντας αποτοξίνωση B(a)P ενεργοποιώντας τα ένζυμα φάσης II, αναστέλλοντας έτσι τη διαδικασία ογκογένεσης.
Η εργασία μας αποκαλύπτει τη δυνατότητα του κόκκινου ginseng στην πρόληψη του καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από B(a)P σε ποντίκια μέσω της σημαντικής συμμετοχής του ginsenoside G-Rg3.Η κακή βιοδιαθεσιμότητα αυτού του μορίου από το στόμα εμποδίζει την κλινική του εφαρμογή.Ωστόσο, αυτή η μελέτη δείχνει για πρώτη φορά ότι το G-Rg3 είναι ένα υπόστρωμα του P-gp και η χορήγηση ενός αναστολέα P-gp αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα του G-Rg3 in vitro και in vivo.Το G-Rg3 μειώνει την επαγόμενη από το B(a)P κυτταροτοξικότητα ρυθμίζοντας την οδό Nrf2, η οποία μπορεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός για την προληπτική του λειτουργία.Η μελέτη μας επιβεβαιώνει τη δυνατότητα της ginsenoside G-Rg3 για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.
Θηλυκά ποντίκια A/J έξι εβδομάδων (20 ± 1 g) και αρσενικοί αρουραίοι Wistar 7 εβδομάδων (250 ± 20 g) ελήφθησαν από το The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΗΠΑ) και το Wuhan Institute of Zoology.Πανεπιστήμιο (Wuhan, Κίνα).Το Κινέζικο Κέντρο Συλλογής Καλλιεργειών Τύπου (Wuhan, Κίνα) μας παρείχε κύτταρα Caco-2 και hEL.Η Sigma-Aldrich (Σεντ Λούις, ΗΠΑ) είναι πηγή Β(α)Ρ και τρικαπρίνης.Οι καθαρισμένες ginsenosides G-Rg3r και G-Rg3s, το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), το κιτ προσδιορισμού πολλαπλασιασμού CellTiter-96 (MTS), η βεραπαμίλη, το ελάχιστο απαραίτητο μέσο (MEM) και ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκαν από την Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Κίνα).Το κιτ QIAamp DNA mini και το κιτ ELISA προσθήκης BPDE-DNA αγοράστηκαν από την Qiagen (Stanford, CA, USA) και την Cell Biolabs (Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ).Το κιτ δοκιμασίας δραστικότητας GST και το κιτ ανάλυσης ολικής πρωτεΐνης (τυπική μέθοδος BCA) αγοράστηκαν από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα).Όλα τα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng αποθηκεύονται στο Mingyu Laboratory 7. Το Hong Kong Baptist University (Hong Kong, China) και το Korea Cancer Center (Σεούλ, Κορέα) είναι εμπορικές πηγές εκχυλίσματος CRG και διάφορα εκχυλίσματα κόκκινου ginseng διαφόρων κορεατικής προέλευσης (συμπεριλαμβανομένων των KRGA, KRGB και KRGC).Το κόκκινο τζίνσενγκ είναι φτιαγμένο από τις ρίζες ενός φρέσκου τζίνσενγκ ηλικίας 6 ετών.Το εκχύλισμα κόκκινου ginseng λαμβάνεται με πλύσιμο του ginseng με νερό τρεις φορές, στη συνέχεια συμπύκνωση του υδατικού εκχυλίσματος και, τέλος, ξήρανση σε χαμηλή θερμοκρασία για να ληφθεί σκόνη εκχυλίσματος ginseng.Αντισώματα (αντι-Nrf2, αντι-GST και β-ακτίνη), ανοσοσφαιρίνη G (IgG), συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένου, αντιδραστήριο επιμόλυνσης, siRNA ελέγχου και Nrf2 siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), ΗΠΑ).
Τα κύτταρα Caco2 και hEL καλλιεργήθηκαν σε δίσκους κυτταροκαλλιέργειας 100 mm2 με ΜΕΜ που περιείχε 10% FBS στους 37°C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2.Για να προσδιοριστεί η επίδραση των συνθηκών θεραπείας, τα κύτταρα hEL επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις B(a)P και G-Rg3 σε ΜΕΜ για 48 ώρες.Τα κύτταρα μπορούν να αναλυθούν περαιτέρω ή να συλλεχθούν για να παρασκευαστούν εκχυλίσματα χωρίς κύτταρα.
Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Πειραματικών Ζώων του Ιατρικού Κολλεγίου Tongji, του Πανεπιστημίου Επιστήμης και Τεχνολογίας Huazhong (Αρ. έγκρισης 2019; Αριθμός εγγραφής 4587TH).Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες και κανονισμούς και η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Ποντίκια A/J ηλικίας οκτώ εβδομάδων ενέθηκαν αρχικά ενδοπεριτοναϊκά με Β(α)Ρ σε διάλυμα τρικαπρίνης (100 mg/kg, 0,2 ml).Μετά από μια εβδομάδα, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και διαφορετικές ομάδες θεραπείας, 15 ποντίκια σε κάθε ομάδα, και τέθηκαν σε καθετήρα μία φορά την ημέρα.Μετά από 20 εβδομάδες θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν από ασφυξία CO2.Οι πνεύμονες συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν για 24 ώρες.Ο αριθμός των επιφανειακών όγκων και τα μεμονωμένα μεγέθη όγκων ποσοτικοποιήθηκαν για κάθε πνεύμονα κάτω από ένα μικροσκόπιο ανατομής.Οι εκτιμήσεις όγκου όγκου (V) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη έκφραση: V (mm3) = 4/3πr3, όπου r είναι η διάμετρος του όγκου.Το καθαρό άθροισμα όλων των όγκων όγκου στους πνεύμονες των ποντικών αντιπροσώπευε τον συνολικό όγκο όγκου και ο μέσος συνολικός όγκος όγκου σε κάθε ομάδα αντιπροσώπευε το φορτίο του όγκου.Δείγματα ολικού αίματος και εντέρου συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80°C για προσδιορισμό UPLC-MS/MS.Συλλέχτηκε ορός και χρησιμοποιήθηκε ένας αυτοματοποιημένος χημικός αναλυτής για την ανάλυση των επιπέδων της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) και της κρεατινίνης ορού (Cr) για την αξιολόγηση της ηπατικής και νεφρικής λειτουργίας.
Τα συλλεχθέντα δείγματα απομακρύνθηκαν από την ψυχρή αποθήκευση, αποψύχθηκαν, ζυγίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε σωλήνες όπως περιγράφεται παραπάνω.Σε αυτό προστέθηκαν 0,5 μΜ φλοριζίνη (εσωτερικό πρότυπο) σε 0,8 ml διαλύματος μεθανόλης.Ο ιστός στη συνέχεια ομογενοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Tissue-Tearor και το ομογενοποίημα στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml.Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 15500 rpm για 15 λεπτά.Αφού αφαιρέσετε 1,0 ml υπερκειμένου, στεγνώστε με άζωτο.Για ανάκτηση χρησιμοποιήθηκαν διακόσια μικρολίτρα μεθανόλης.Το αίμα συλλέγεται και επεξεργάζεται σε μία γραμμή και χρησιμοποιείται ως αναφορά για όλες τις μετρήσεις.
Τρυβλία Transwell 24 φρεατίων σπάρθηκαν με 1,0 x 105 κύτταρα Caco-2 ανά φρεάτιο για να αξιολογηθεί η πιθανή ενίσχυση της μεταφοράς G-Rg3 με την προσθήκη βεραπαμίλης.Μετά από 3 εβδομάδες καλλιέργειας, τα κύτταρα πλύθηκαν με HBSS και προεπωάστηκαν στους 37°C.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, ή μείγμα με 50 ή 100 μΜ βεραπαμίλη) εγχύθηκαν στη βασεοπλευρική ή κορυφαία πλευρά της μονοστοιβάδας και 600 μL διαλύματος HBSS προστέθηκαν στην άλλη πλευρά.Συλλέξτε 100 µl μέσου καλλιέργειας στους καθορισμένους χρόνους (0, 15, 30, 45, 60, 90 και 120 λεπτά) και προσθέστε 100 μl HBSS για να συμπληρώσετε αυτόν τον όγκο.Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -4 °C μέχρι την ανίχνευση με UPLC-MS/MS.Η έκφραση Papp = dQ/(dT × A × C0) χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση της φαινομενικής μονοκατευθυντικής κορυφαίας και βασοπλευρικής διαπερατότητας και αντίστροφα (Pa-b και Pb-a, αντίστοιχα).dQ/dT είναι η αλλαγή στη συγκέντρωση, A (0,6 cm2) είναι η επιφάνεια της μονοστιβάδας και C0 είναι η αρχική συγκέντρωση δότη.Ο λόγος εκροής υπολογίζεται ως Pb-a/Pa-b, ο οποίος αντιπροσωπεύει τον ρυθμό εκροής του φαρμάκου της μελέτης.
Οι αρσενικοί αρουραίοι Wistar έμειναν νηστικοί για 24 ώρες, ήπιαν μόνο νερό και αναισθητοποιήθηκαν με ενδοφλέβια ένεση διαλύματος πεντοβαρβιτάλης 3,5%.Ο διασωληνωμένος σωλήνας σιλικόνης έχει το άκρο του δωδεκαδακτύλου ως είσοδο και το άκρο του ειλεού ως έξοδο.Χρησιμοποιήστε μια περισταλτική αντλία για να αντλήσετε την είσοδο με 10 μM G-Rg3r ή G-Rg3s σε ισοτονικό HBSS με ταχύτητα ροής 0,1 ml/min.Η επίδραση της βεραπαμίλης αξιολογήθηκε με την προσθήκη 50 μΜ ή 100 μΜ της ένωσης σε 10 μΜ G-Rg3r ή G-Rg3s.Το UPLC-MS/MS πραγματοποιήθηκε σε εκχυλίσματα έγχυσης που συλλέχθηκαν στα χρονικά σημεία 60, 90, 120 και 150 λεπτά μετά την έναρξη της έγχυσης.Το ποσοστό απορρόφησης ποσοτικοποιείται με τον τύπο % απορρόφησης = (1 – Cout/Cin) × 100%;η συγκέντρωση του G-Rg3 στην έξοδο και στην είσοδο εκφράζεται με Cout και Cin, αντίστοιχα.
Τα κύτταρα hEL σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 104 κύτταρα ανά φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μΜ) ή G-Rg3 διαλυμένο σε DMSO .Τα φάρμακα στη συνέχεια αραιώθηκαν με μέσο καλλιέργειας σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 1, 2, 5, 10, 20 μΜ) σε διάστημα 48 ωρών.Χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ δοκιμασίας MTS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ένα τυπικό πρωτόκολλο και στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 490 nm.Το επίπεδο βιωσιμότητας των κυττάρων των ομάδων που έλαβαν συν-θεραπεία με B(a)P (10 μM) και G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μΜ) αξιολογήθηκε σύμφωνα με την παραπάνω μέθοδο και συγκρίθηκε με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία.
Τα κύτταρα hEL σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μMB(a)P παρουσία ή απουσία 10 μΜ G-Rg3.Μετά από 48 ώρες θεραπείας, το DNA εκχυλίστηκε από κύτταρα hEL χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Ο σχηματισμός προϊόντων προσθήκης BPDE-DNA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ELISA προσθήκης BPDE-DNA.Τα σχετικά επίπεδα του προϊόντος προσθήκης BPDE-DNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.
Τα κύτταρα hEL σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 104 κύτταρα ανά φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μMB(a)P απουσία ή παρουσία 10 μΜ G-Rg3 για 48 ώρες.Η δραστηριότητα GST μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ προσδιορισμού δραστηριότητας GST σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Η σχετική ενεργοποίηση GST μετρήθηκε με απορρόφηση στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.
Τα κύτταρα hEL πλύθηκαν με παγωμένο PBS και στη συνέχεια λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιοανοσοκαθίζησης που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης.Μετά την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κιτ ανάλυσης ολικής πρωτεΐνης, 30 μg πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF με ηλεκτροφόρηση.Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4°C.Μετά από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου, προστέθηκαν αντιδραστήρια ενισχυμένης χημειοφωταύγειας για να οπτικοποιηθεί το σήμα δέσμευσης.Η ένταση κάθε ζώνης πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.
Το λογισμικό GraphPad Prism 7.0 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση όλων των δεδομένων, που εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.Η διακύμανση μεταξύ των ομάδων θεραπείας αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή t Student ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, με τιμή Ρ <0,05 που υποδεικνύει στατιστική σημασία.
Όλα τα δεδομένα που ελήφθησαν ή αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται σε αυτό το δημοσιευμένο άρθρο και σε συμπληρωματικά αρχεία πληροφοριών.
Torre, LA, Siegel, RL and Jemal, A. Στατιστικά στοιχεία για τον καρκίνο του πνεύμονα.επίρρημα.Εχει λήξει.φάρμακο.βιολογία.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Οι καρκινογόνες ουσίες του καπνού, οι βιοδείκτες τους και ο επαγόμενος από τον καπνό καρκίνο.Nat.Καρκίνος ιερέας.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH and Venitt, S. DNA και πρωτεϊνικά προϊόντα προσθήκης σε ανθρώπινους ιστούς που προκύπτουν από την έκθεση στον καπνό του τσιγάρου.διεθνής.J. Cancer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA και Yu M. Επίδραση Houttuynia cordata και silibinin στην επαγόμενη από βενζο(α)πυρένιο ογκογένεση πνεύμονα σε ποντικούς A/J.Cancer 7, 1053-1057 (2005).
Tang, W. et αϊ.Αντικαρκινικό φυσικό προϊόν απομονωμένο από κινέζικα φαρμακευτικά υλικά.σαγόνι.φάρμακο.6, 27 (2011).
Yang, Υ. et αϊ.Αποτελεσματικότητα του πολυφαινονίου Ε, του κόκκινου ginseng και της ραπαμυκίνης στην ογκογένεση του πνεύμονα που προκαλείται από βενζο(α)πυρένιο σε ποντικούς A/J.Cancer 8, 52-58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS και Yuan, KS Red, συμμετοχή στη θεραπεία του καρκίνου.σαγόνι.J. Nutt.φάρμακο.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS και Gao, L. Ginsenosides στις ρίζες και τα φύλλα του αμερικανικού ginseng.J. Agric.Χημεία τροφίμων.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA και Yuan KS Φαρμακολογία του ginseng: πολλά συστατικά και πολλά αποτελέσματα.βιοχημεία.φαρμακολογία.58, 1685–1693 (1999).
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-17-2023