Gracias por visitar Nature.com.La versión del navegador que está utilizando tiene soporte CSS limitado.Para obtener mejores resultados, recomendamos utilizar una versión más reciente de su navegador (o desactivar el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilo ni JavaScript.
El ginseng rojo se ha utilizado en la medicina tradicional asiática durante cientos de años.En este estudio, evaluamos la capacidad de cuatro tipos de ginseng rojo (ginseng rojo chino, ginseng rojo coreano A, ginseng rojo coreano B y ginseng rojo coreano C) cultivados en diferentes regiones para inhibir la formación y el crecimiento de cáncer pulmonar inducido por carcinógenos. tumores.Se realizó una prueba de benzo(a)pireno (B(a)P) en ratones A/J y se descubrió que el ginseng rojo coreano B era el más eficaz para reducir la carga tumoral entre las cuatro variedades de ginseng rojo.Además, analizamos el contenido de varios ginsenósidos (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 y Rg5) en cuatro extractos de ginseng rojo y descubrimos que el ginseng B rojo coreano tenía los niveles más altos de ginsenósido Rg3 (G-Rg3), lo que sugiere que G-Rg3 puede desempeñar un papel importante en su eficacia terapéutica.Este trabajo muestra que G-Rg3 tiene una biodisponibilidad relativamente baja.Sin embargo, cuando se coadministró G-Rg3 con el inhibidor de la gp-P verapamilo, la salida de G-Rg3 hacia las células Caco-2 disminuyó, la tasa de absorción intestinal de G-Rg3 aumentó en un modelo de rata y G-Rg3 se incrementó. se incrementó.En las células Caco-2, la salida de Rg3 disminuye y el nivel de concentración de Rg3 disminuye.G-Rg3 aumenta en el intestino y el plasma, y su capacidad para prevenir tumores también aumenta en un modelo de rata de tumorigénesis inducida por B(a)P.También encontramos que G-Rg3 redujo la citotoxicidad inducida por B(a)P y la formación de aductos de ADN en células pulmonares humanas, y restableció la expresión y actividad de las enzimas de fase II a través de la vía Nrf2, lo que puede estar relacionado con el posible mecanismo de acción. de inhibición de G -Rg3..Sobre la aparición de tumores de pulmón.Nuestro estudio demuestra un papel potencialmente importante para G-Rg3 en el tratamiento de tumores de pulmón en modelos de ratón.La biodisponibilidad oral de este ginsenósido aumenta al atacar la glicoproteína P, lo que permite que la molécula ejerza efectos anticancerígenos.
El tipo más común de cáncer de pulmón es el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que es una de las principales causas de muerte por cáncer en China y América del Norte1,2.El principal factor que aumenta el riesgo de desarrollar cáncer de pulmón de células no pequeñas es el tabaquismo.El humo del cigarrillo contiene más de 60 carcinógenos, entre ellos el benzo(a)pireno (B(a)P), las nitrosaminas y los isótopos radiactivos procedentes de la desintegración del radón.3 Los hidrocarburos aromáticos policíclicos B(a)P son la principal causa de toxicidad en los cigarrillos. fumar.Tras la exposición al B(a)P, el citocromo P450 lo convierte en B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido (BPDE), que reacciona con el ADN para formar el aducto 4 BPDE-ADN. Los aductos inducen la tumorigénesis pulmonar en ratones con estadio tumoral e histopatología similar a los tumores de pulmón humanos5.Esta característica hace que el modelo de cáncer de pulmón inducido por B(a)P sea un sistema adecuado para evaluar compuestos con posibles propiedades anticancerígenas.
Una posible estrategia para prevenir el desarrollo de cáncer de pulmón en grupos de alto riesgo, especialmente fumadores, es el uso de agentes quimiopreventivos para suprimir el desarrollo de lesiones neoplásicas intraepiteliales y así prevenir su posterior progresión a malignidad.Los estudios en animales muestran que varios agentes quimiopreventivos son eficaces6.Nuestro informe anterior7 destacó los buenos efectos preventivos del ginseng rojo sobre el cáncer de pulmón.Esta hierba se ha utilizado durante siglos en la medicina tradicional asiática para prolongar la vida y la salud, y se ha documentado que tiene efectos antitumorales8.
El factor activo del ginseng es el ginsenósido, que se utiliza como marcador compuesto para evaluar la calidad de los extractos de ginseng.El análisis cuantitativo de extractos crudos de ginseng normalmente implica el uso de varios ginsenósidos, incluidos RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 y Rc9,10.Los ginsenósidos tienen poco uso clínico debido a su muy pobre biodisponibilidad oral11.Aunque el mecanismo de esta escasa biodisponibilidad no está claro, la causa puede ser la salida de ginsenósidos causada por la glicoproteína P (P-gp)12.La P-gp es uno de los transportadores de eflujo más importantes de la superfamilia de transportadores de casetes de unión a ATP, que utiliza la energía de la hidrólisis del ATP para liberar sustancias intracelulares al entorno externo.Los transportadores de gp-P suelen estar ampliamente distribuidos en el intestino, los riñones, el hígado y la barrera hematoencefálica13.La gp-P desempeña un papel fundamental en la absorción intestinal y la inhibición de la gp-P aumenta la absorción oral y la disponibilidad de algunos fármacos anticancerígenos12,14.Ejemplos de inhibidores utilizados previamente en la literatura son verapamilo y ciclosporina A15.Este trabajo implica establecer un sistema en ratones para estudiar el cáncer de pulmón inducido por B(a)P para evaluar la capacidad de diferentes extractos de ginseng rojo de China y Corea para afectar las neoplasias malignas.Los extractos se analizaron individualmente para identificar ginsenósidos específicos que pueden afectar la carcinogénesis.Luego se utilizó verapamilo para atacar la P-gp y mejorar la biodisponibilidad oral y la eficacia terapéutica de los ginsenósidos contra el cáncer.
El mecanismo por el cual las saponinas del ginseng ejercen efectos terapéuticos sobre la carcinogénesis aún no está claro.Las investigaciones han demostrado que varios ginsenósidos pueden reducir el daño al ADN causado por carcinógenos al reducir el estrés oxidativo y activar las enzimas de desintoxicación de fase II, previniendo así el daño celular.La glutatión S-transferasa (GST) es una enzima típica de fase II que se requiere para reducir el daño al ADN causado por carcinógenos17.El factor 2 relacionado con el eritroide nuclear 2 (Nrf2) es un importante factor de transcripción que regula la homeostasis redox y activa la expresión de enzimas de fase II y respuestas antioxidantes citoprotectoras18.Nuestro estudio también examinó los efectos de los ginsenósidos identificados en la reducción de la citotoxicidad inducida por B(a)P y la formación de aductos de ADN-BPDE, así como en la inducción de enzimas de fase II mediante la modulación de la vía Nrf2 en células pulmonares normales.
El establecimiento de un modelo murino de cáncer inducido por B(a)P es consistente con trabajos previos5.La Figura 1A muestra el diseño experimental de un tratamiento de 20 semanas de un modelo de cáncer de ratón inducido por B(a)P, agua (control), extracto de ginseng rojo chino (CRG), extracto de ginseng rojo coreano A (KRGA) y extracto de ginseng rojo coreano A (KRGA). ginseng.Extracto B (KRGB) y Extracto C de Ginseng Rojo Coreano (KRGC).Después de 20 semanas de tratamiento con ginseng rojo, los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2.La Figura 1B muestra tumores pulmonares macroscópicos en animales tratados con diferentes tipos de ginseng rojo y la Figura 1C muestra una micrografía óptica representativa de una muestra de tumor.La carga tumoral de los animales tratados con KRGB (1,5 ± 0,35) fue menor que la de los animales de control (0,82 ± 0,2, P <0,05), como se muestra en la Figura 1D.El grado medio de inhibición de la carga tumoral fue del 45%.Otros extractos de ginseng rojo analizados no mostraron cambios tan significativos en la carga tumoral (P > 0,05).No se observaron efectos secundarios obvios en el modelo de ratón durante 20 semanas de tratamiento con ginseng rojo, incluido ningún cambio en el peso corporal (datos no mostrados) y ninguna toxicidad hepática o renal (Figura 1E,F).
El extracto de ginseng rojo trata el desarrollo de tumores de pulmón en ratones A/J.(A) Diseño experimental.(B) Tumores pulmonares grandes en un modelo de ratón.Los tumores están indicados por flechas.a: grupo de ginseng rojo chino.b: grupo A de ginseng rojo coreano.c: ginseng rojo coreano grupo B. d: ginseng rojo coreano grupo C. d: grupo de control.(C) Micrografía de luz que muestra un tumor de pulmón.Ampliación: 100. b: 400. (D) Carga tumoral en el grupo del extracto de ginseng rojo.(E) Niveles plasmáticos de la enzima hepática ALT.(F) Niveles plasmáticos de la enzima renal Cr.Los datos se expresan como media ± desviación estándar.*P<0,05.
Los extractos de ginseng rojo identificados en este estudio se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC-MS/MS) para cuantificar los siguientes ginsenósidos: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3. Rh2, F1, Rk1 y Rg5.Las condiciones de UPLC y MS utilizadas para medir los analitos se describieron en un informe anterior19.En la Figura 2A se muestran los cromatogramas UPLC-MS/MS de cuatro extractos de ginseng rojo.Hubo diferencias significativas en el contenido total de ginsenósidos, con el mayor contenido total de ginsenósidos en CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figura 2B).Al evaluar los ginsenósidos individuales (Figura 2C), KRGB mostró el nivel más alto de G-Rg3 en comparación con otros ginsenósidos (58,33 ± 3,81 μmol/L para G-Rg3 y 41,56 ± 2,88 μmol/L para G -Rg3r).L).tipo ginseng rojo (P < 0,001).G-Rg3 se presenta como un par de estereoisómeros G-Rg3r y G-Rg3s, que difieren en la posición del grupo hidroxilo en el carbono 20 (Fig. 2D).Los resultados indican que G-Rg3r o G-Rg3 pueden tener un importante potencial anticancerígeno en un modelo de ratón con cáncer inducido por B(a)P.
Contenido de ginsenósidos en diversos extractos de ginseng rojo.(A) Cromatogramas UPLC-MS/MS de cuatro extractos de ginseng rojo.(B) Estimación del contenido total de ginsenósidos en los extractos indicados.(C) Detección de ginsenósidos individuales en extractos etiquetados.(D) Estructuras de los estereoisómeros de ginsenósidos G-Rg3r y G-Rg3s.Los datos se expresan como media ± desviación estándar de determinaciones por triplicado.***P<0,001.
El estudio UPLC-MS/MS requirió la cuantificación de ginsenósidos en muestras intestinales y de sangre tras 20 semanas de tratamiento.El tratamiento con KRGB mostró la presencia de sólo 0,0063 ± 0,0005 μg/ml de Rg5 en la sangre.No se detectaron ginsenósidos restantes, lo que indica una biodisponibilidad oral deficiente y, por lo tanto, una exposición reducida a estos ginsenósidos.
La línea celular de adenocarcinoma de colon Caco-2 es morfológica y bioquímicamente similar a las células epiteliales intestinales humanas, lo que demuestra su utilidad para evaluar el transporte de enterocitos a través de la barrera epitelial intestinal.Este análisis se basó en un estudio anterior 20 .Las Figuras 3A, B, C, D, E, F muestran imágenes representativas del transporte transcelular de G-Rg3r y G-Rg3 utilizando un modelo de monocapa Caco-2.El transporte transcelular de G-Rg3r o G-Rg3 a través de monocapas de Caco-2 desde el lado basolateral al apical (Pb-a) fue significativamente mayor que desde el lado apical al basolateral (Pa-b).Para G-Rg3r, el valor medio de Pa-b fue de 0,38 ± 0,06, que aumentó a 0,73 ± 0,06 después del tratamiento con 50 μmol/L de verapamilo y a 1,14 ± 0,09 después del tratamiento con 100 μmol/L de verapamilo (p < 0,01 y 0,001, respectivamente; Figura 2).3A).Las observaciones para G-Rg3 siguieron un patrón similar (Fig. 3B), y los resultados mostraron que el tratamiento con verapamilo mejoró el transporte de G-Rg3r y G-Rg3.El tratamiento con verapamilo también resultó en una disminución significativa en las proporciones medias de eflujo de Pb-a y G-Rg3r y G-Rg3s (Figura 3C, D, E, F), lo que indica que el tratamiento con verapamilo reduce el contenido de ginsenósidos en las células de eflujo Caco-2..
Transporte transcelular de G-Rg3 en monocapas de Caco-2 y absorción intestinal en un ensayo de perfusión en ratas.(A) Valor Pa-b del grupo G-Rg3r en monocapa Caco-2.(B) Valor Pa-b de los grupos G-Rg3s en monocapa Caco-2.(C) Valor de Pb del grupo G-Rg3r en monocapa Caco-2.(D) Valor de Pb de los grupos G-Rg3s en monocapa Caco-2.(E) Relación de rendimiento de grupos G-Rg3r en una monocapa de Caco-2.(F) Relación de rendimiento de los grupos G-Rg3 en una monocapa de Caco-2.(G) Porcentaje de absorción intestinal de G-Rg3r en un ensayo de perfusión en ratas.(H) Porcentaje de absorción intestinal de G-Rg3 en un ensayo de perfusión en ratas.Se compararon la permeabilidad y la absorción sin la adición de verapamilo.Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de cinco experimentos independientes.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
De acuerdo con trabajos anteriores20, se realizó una perfusión intestinal ortotópica de ratas para determinar si la absorción de G-Rg3 en el intestino aumenta después del tratamiento con verapamilo.Las Figuras 3G, H muestran ensayos de perfusión representativos para evaluar el porcentaje de absorción intestinal de G-Rg3r y G-Rg3 en ratas modelo de cáncer durante los períodos de tiempo anteriores.El porcentaje inicial de captación débil de G-Rg3r de aproximadamente el 10 % aumentó a más del 20 % después del tratamiento con verapamilo 50 µM y a más del 25 % después del tratamiento con verapamilo 100 µM.Asimismo, G-Rg3, que tuvo una captación inicial del 10 %, también mostró un pico de más del 20 % después del tratamiento con verapamilo 50 µM y casi el 30 % después del tratamiento con verapamilo 100 µM, lo que sugiere que la inhibición de la gp-P por el verapamilo mejora Absorción intestinal de G Rg3 en un modelo de ratón de cáncer de pulmón.
Según el método anterior, los ratones modelo de cáncer inducido por B(a)P se dividieron aleatoriamente en seis grupos, como se muestra en la Figura 4A.No se observó una pérdida de peso significativa ni signos clínicos de toxicidad en el grupo de tratamiento con G-Rg3 en comparación con el grupo de control (datos no mostrados).Después de 20 semanas de tratamiento, se recogieron los pulmones de cada ratón.La Figura 4B muestra tumores de pulmón macroscópicos en ratones en los grupos de tratamiento anteriores, y la Figura 4C muestra una micrografía óptica representativa de un tumor representativo.En cuanto a la carga tumoral en cada grupo (Fig. 4D), los valores para los ratones tratados con G-Rg3r y G-Rg3s fueron 0,75 ± 0,29 mm3 y 0,81 ± 0,30 mm3, respectivamente, mientras que los valores para los ratones G tratados con -Rg3s fueron 1,63 respectivamente ±0,40 mm3.ratones de control (p <0,001), lo que indica que el tratamiento con G-Rg3 redujo la carga tumoral en ratones.La administración de verapamilo potenció aún más esta reducción: los valores en ratones verapamilo+ G-Rg3r disminuyeron de 0,75 ± 0,29 mm3 a 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), y los valores de verapamilo+ de 0,81 ± 0,30 mm3 disminuyeron a 0,29 ± 0,21. mm3 en ratones tratados con G. -Rg3s (p <0,05), lo que indica que el verapamilo puede potenciar el efecto inhibidor de G-Rg3 sobre la tumorigénesis.La carga tumoral no mostró diferencias significativas entre el grupo control y el grupo verapamilo, el grupo G-Rg3r y el grupo G-Rg3s, y el grupo verapamilo+G-Rg3r y el grupo verapamilo+G-Rg3s.Además, no hubo toxicidades hepáticas o renales significativas asociadas con los tratamientos evaluados (Figura 4E,F).
Carga tumoral después del tratamiento con G-Rg3 y niveles plasmáticos o intestinales de G-Rg3r y G-Rg3 en los grupos indicados.(A) Diseño experimental.(B) Tumores macroscópicos en un modelo de ratón.Los tumores están indicados por flechas.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r en combinación con verapamilo.d: G-Rg3 en combinación con verapamilo.d: verapamilo.e: controlar.(C) Micrografía óptica del tumor con aumento.Respuesta: 100x.segundo: 400X.(D) Efecto del tratamiento con G-Rg3 + verapamilo sobre la carga tumoral en ratones A/J.(E) Niveles plasmáticos de la enzima hepática ALT.(F) Niveles plasmáticos de la enzima renal Cr.(G) Niveles plasmáticos de G-Rg3r o G-Rg3 de los grupos indicados.(H) Niveles de G-Rg3r o G-Rg3s en los intestinos de los grupos indicados.Los datos se expresan como media ± desviación estándar de determinaciones por triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Los niveles de G-Rg3 en ratones modelo de cáncer inducido por B(a)P se evaluaron mediante UPLC-MS/MS después de un período de tratamiento de 20 semanas de acuerdo con el método descrito en la sección Métodos.Las Figuras 4G y H muestran los niveles de G-Rg3 en plasma e intestino, respectivamente.Los niveles plasmáticos de G-Rg3r fueron 0,44 ± 0,32 μmol/L y aumentaron a 1,17 ± 0,47 μmol/L con la administración concomitante de verapamilo (p < 0,001), mientras que los niveles intestinales de G-Rg3r fueron 0,53 ± 0,08 μg/l.Cuando se combinó con verapamilo, g aumentó a 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Para G-Rg3, los resultados siguieron un patrón similar, lo que indica que el tratamiento con verapamilo aumentó la biodisponibilidad oral de G-Rg3 en ratones A/J.
Se utilizó el ensayo de viabilidad celular para evaluar la citotoxicidad de B(a)P y G-Rg3 en células hEL.La citotoxicidad inducida por B(a)P en células hEL se muestra en la Figura 5A, mientras que las propiedades no tóxicas de G-Rg3r y G-Rg3 se muestran en las Figuras 5A y 5B.5B, C. Para evaluar el efecto citoprotector de G-Rg3, se coadministró B(a)P con diversas concentraciones de G-Rg3r o G-Rg3 en células hEL.Como se muestra en la Figura 5D, G-Rg3r en concentraciones de 5 μM, 10 μM y 20 μM restableció la viabilidad celular al 58,3%, 79,3% y 77,3%, respectivamente.También se pueden observar resultados similares en el grupo G-Rg3s.Cuando las concentraciones de G-Rg3 fueron 5 µM, 10 µM y 20 µM, la viabilidad celular se restableció al 58,3%, 72,7% y 76,7%, respectivamente (Figura 5E).).La presencia de aductos BPDE-ADN se midió usando un kit ELISA.Nuestros resultados mostraron que los niveles de aductos de ADN-BPDE aumentaron en el grupo tratado con B(a)P en comparación con el grupo de control, pero en comparación con el tratamiento conjunto con G-Rg3, los niveles de aductos de ADN-BPDE en el grupo de B(a)P B en el grupo tratado, los niveles de aductos de ADN se redujeron significativamente.Los resultados del tratamiento con B(a)P solo se muestran en la Figura 5F (1,87 ± 0,33 frente a 3,77 ± 0,42 para G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 frente a 3,77 ± 0,42 para G -Rg3s, p < 0,001).
Viabilidad celular y formación de aductos de ADN-BPDE en células hEL tratadas con G-Rg3 y B(a)P.(A) Viabilidad de las células hEL tratadas con B(a)P.(B) Viabilidad de las células hEL tratadas con G-Rg3r.(C) Viabilidad de las células hEL tratadas con G-Rg3.(D) Viabilidad de las células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3r.(E) Viabilidad de las células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3.(F) Niveles de aducto BPDE-ADN en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3.Los datos se expresan como media ± desviación estándar de determinaciones por triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
La expresión de la enzima GST se detectó después del cotratamiento con B (a) P 10 μM y G-Rg3r o G-Rg3s 10 μM.Nuestros resultados mostraron que B(a)P suprimió la expresión de GST (59,7 ± 8,2% en el grupo G-Rg3r y 39 ± 4,5% en el grupo G-Rg3s), y B(a)P se asoció con G-Rg3r , o con G-Rg3r, o con G-Rg3r.El tratamiento conjunto con G-Rg3 restableció la expresión de GST.Expresión de GST (103,7 ± 15,5% en el grupo G-Rg3r y 110 ± 11,1% en el grupo G-Rg3s, p <0,05 y p <0,001, respectivamente, Fig. 6A, B y C).La actividad de GST se evaluó utilizando un kit de ensayo de actividad.Nuestros resultados mostraron que el grupo de tratamiento combinado tuvo una mayor actividad de GST en comparación con el grupo de B(a)P solo (96,3 ± 6,6 % frente a 35,7 ± 7,8 % en el grupo de G-Rg3r frente a 92,3 ± 6,5 en el grupo de G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% en el grupo G-Rg3s, p < 0,001, Figura 6D).
Expresión de GST y Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3.(A) Detección de la expresión de GST mediante transferencia Western.(B) Expresión cuantitativa de GST en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3r.(C) Expresión cuantitativa de GST en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3s.(D) Actividad de GST en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3.(E) Detección de la expresión de Nrf2 mediante transferencia Western.(F) Expresión cuantitativa de Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3r.(G) Expresión cuantitativa de Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3s.Los datos se expresan como media ± desviación estándar de determinaciones por triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Para dilucidar las vías implicadas en la supresión mediada por G-Rg3 de la tumorigénesis inducida por B (a) P, se evaluó la expresión de Nrf2 mediante transferencia Western.Como se muestra en las Figuras 6E, F, G, en comparación con el grupo de control, solo disminuyó el nivel de Nrf2 en el grupo de tratamiento con B(a)P;sin embargo, en comparación con el grupo de tratamiento B(a)P, los niveles de B(a) Nrf2 en el grupo PG-Rg3 aumentaron (106 ± 9,5% para G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% para G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% para G-Rg3s, p < 0,01).
Confirmamos el papel preventivo de Nrf2 al suprimir la expresión de Nrf2 utilizando un pequeño ARN de interferencia específico (ARNip).La caída de Nrf2 se confirmó mediante transferencia Western (Fig. 7A, B).Como se muestra en las Figuras 7C, D, el tratamiento conjunto de células hEL con B(a)P y G-Rg3 dio como resultado una disminución en el número de aductos de BPDE-ADN (1,47 ± 0,21) en comparación con el tratamiento con B(a)P. solo en el grupo de ARNip de control). G-Rg3r fue 4,13 ± 0,49, G-Rg3s fue 1,8 ± 0,32 y 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Sin embargo, el efecto inhibidor de G-Rg3 sobre la formación de ADN-BPDE fue abolido por la eliminación de Nrf2.En el grupo siNrf2, no hubo diferencias significativas en la formación de aductos de ADN-BPDE entre el cotratamiento con B(a)P y G-Rg3 y el tratamiento con B(a)P solo (3,0 ± 0,21 para G-Rg3r frente a 3,56 ± 0,32 ).para G-Rg3r versus 3,6 para G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Efecto de la eliminación de Nrf2 sobre la formación de aductos de ADN-BPDE en células hEL.(A) La caída de Nrf2 se confirmó mediante transferencia Western.(B) Cuantificación de la intensidad de la banda Nrf2.(C) Efecto de la eliminación de Nrf2 sobre los niveles de aducto de ADN-BPDE en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3r.(D) Efecto de la eliminación de Nrf2 sobre los niveles de aducto de ADN-BPDE en células hEL tratadas con B(a)P y G-Rg3.Los datos se expresan como media ± desviación estándar de determinaciones por triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Este estudio evaluó los efectos preventivos de varios extractos de ginseng rojo en un modelo de ratón de cáncer de pulmón inducido por B(a)P, y el tratamiento con KRGB redujo significativamente la carga tumoral.Teniendo en cuenta que G-Rg3 tiene el mayor contenido en este extracto de ginseng, se ha estudiado el importante papel de este ginsenósido en la inhibición de la tumorigénesis.Tanto G-Rg3r como G-Rg3 (dos epímeros de G-Rg3) redujeron significativamente la carga tumoral en un modelo de ratón de cáncer inducido por B(a)P.G-Rg3r y G-Rg3 ejercen efectos anticancerígenos al inducir la apoptosis de las células tumorales21, inhibir el crecimiento tumoral22, detener el ciclo celular23 y afectar la angiogénesis24.También se ha demostrado que G-Rg3 inhibe la metástasis celular25, y se ha documentado la capacidad de G-Rg3 para mejorar los efectos de la quimioterapia y la radioterapia26,27.Poon et al demostraron que el tratamiento con G-Rg3 podría reducir los efectos genotóxicos de B(a)P28.Este estudio demuestra el potencial terapéutico de G-Rg3 para atacar moléculas cancerígenas ambientales y prevenir el cáncer.
A pesar de su buen potencial profiláctico, la escasa biodisponibilidad oral de los ginsenósidos plantea un desafío para el uso clínico de estas moléculas.El análisis farmacocinético de la administración oral de ginsenósidos en ratas mostró que su biodisponibilidad es aún inferior al 5%29.Estas pruebas mostraron que después del período de tratamiento de 20 semanas, solo disminuyeron los niveles sanguíneos de Rg5.Aunque aún no se ha dilucidado el mecanismo subyacente de la escasa biodisponibilidad, se cree que la gp-P está implicada en la salida de ginsenósidos.Este trabajo demostró por primera vez que la administración de verapamilo, un bloqueador de la gp-P, aumenta la biodisponibilidad oral de G-Rg3r y G-Rg3s.Por lo tanto, este hallazgo sugiere que G-Rg3r y G-Rg3 actúan como sustratos de P-gp para regular su salida.
Este trabajo demuestra que el tratamiento combinado con verapamilo aumenta la biodisponibilidad oral de G-Rg3 en un modelo de cáncer de pulmón en ratones.Este hallazgo está respaldado por un mayor transporte transcelular intestinal de G-Rg3 tras el bloqueo de P-gp, aumentando así su absorción.Los ensayos en células Caco2 mostraron que el tratamiento con verapamilo redujo la salida de G-Rg3r y G-Rg3 al tiempo que mejoraba la permeabilidad de la membrana.Un estudio de Yang et al.Los estudios han demostrado que el tratamiento con ciclosporina A (otro bloqueador de la gp-P) aumenta la biodisponibilidad del ginsenósido Rh2 desde un valor inicial del 1%20 a más del 30%.Los compuestos ginsenósidos K y Rg1 también mostraron resultados similares30,31.Cuando se coadministraron verapamilo y ciclosporina A, la salida del compuesto K en las células Caco-2 se redujo significativamente de 26,6 a menos de 3, mientras que sus niveles intracelulares aumentaron 40 veces30.En presencia de verapamilo, los niveles de Rg1 aumentaron en las células epiteliales del pulmón de rata, lo que sugiere un papel de la P-gp en la salida de ginsenósidos, como lo demostraron Meng et al.31.Sin embargo, el verapamilo no tuvo el mismo efecto sobre la salida de algunos ginsenósidos (como Rg1, F1, Rh1 y Re), lo que indica que no se ven afectados por los sustratos de P-gp, como lo demuestran Liang et al.32 .Esta observación puede estar relacionada con la participación de otros transportadores y estructuras alternativas de ginsenósidos.
El mecanismo del efecto preventivo de G-Rg3 sobre el cáncer no está claro.Estudios anteriores han demostrado que G-Rg3 previene el daño del ADN y la apoptosis al reducir el estrés oxidativo y la inflamación16,33, que puede ser el mecanismo subyacente para prevenir la tumorigénesis inducida por B(a)P.Algunos informes indican que la genotoxicidad inducida por B(a)P puede reducirse modulando las enzimas de fase II para formar BPDE-DNA34.GST es una enzima típica de fase II que inhibe la formación de aductos BPDE-ADN al promover la unión de GSH a BPDE, reduciendo así el daño al ADN inducido por B(a)P35.Nuestros resultados muestran que el tratamiento con G-Rg3 reduce la citotoxicidad inducida por B (a) P y la formación de aductos de ADN-BPDE en células hEL y restaura la expresión y actividad de GST in vitro.Sin embargo, estos efectos estuvieron ausentes en ausencia de Nrf2, lo que sugiere que G-Rg3 induce efectos citoprotectores a través de la vía Nrf2.Nrf2 es un factor de transcripción importante para las enzimas de desintoxicación de fase II que promueve la eliminación de xenobióticos36.La activación de la vía Nrf2 induce citoprotección y reduce el daño tisular37.Además, varios informes han respaldado el papel de Nrf2 como supresor de tumores en la carcinogénesis38.Nuestro estudio muestra que la inducción de la vía Nrf2 por G-Rg3 juega un papel regulador importante en la genotoxicidad inducida por B (a) P al causar la desintoxicación de B (a) P mediante la activación de enzimas de fase II, inhibiendo así el proceso de tumorigénesis.
Nuestro trabajo revela el potencial del ginseng rojo para prevenir el cáncer de pulmón inducido por B(a)P en ratones a través de la importante participación del ginsenósido G-Rg3.La escasa biodisponibilidad oral de esta molécula dificulta su aplicación clínica.Sin embargo, este estudio muestra por primera vez que G-Rg3 es un sustrato de P-gp y que la administración de un inhibidor de P-gp aumenta la biodisponibilidad de G-Rg3 in vitro e in vivo.G-Rg3 reduce la citotoxicidad inducida por B(a)P mediante la regulación de la vía Nrf2, que puede ser un mecanismo potencial para su función preventiva.Nuestro estudio confirma el potencial del ginsenósido G-Rg3 para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón.
Se obtuvieron ratones A/J hembra de seis semanas (20 ± 1 g) y ratas Wistar macho de 7 semanas (250 ± 20 g) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, EE. UU.) y del Instituto de Zoología de Wuhan.Universidad (Wuhan, China).El Centro de Colección de Cultivos Tipo Chino (Wuhan, China) nos proporcionó células Caco-2 y hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, EE. UU.) es una fuente de B(a)P y tricaprina.Los ginsenósidos purificados G-Rg3r y G-Rg3s, dimetilsulfóxido (DMSO), kit de ensayo de proliferación CellTiter-96 (MTS), verapamilo, medio esencial mínimo (MEM) y suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Chengdu Must Bio-Technology. .Co., Ltd.(Chengdú, China).El mini kit QIAamp DNA y el kit ELISA de aducto BPDE-DNA se adquirieron de Qiagen (Stanford, CA, EE. UU.) y Cell Biolabs (San Diego, CA, EE. UU.).El kit de ensayo de actividad de GST y el kit de ensayo de proteína total (método BCA estándar) se adquirieron de Solarbio (Beijing, China).Todos los extractos de ginseng rojo se almacenan en el Laboratorio Mingyu 7. La Universidad Bautista de Hong Kong (Hong Kong, China) y el Centro de Cáncer de Corea (Seúl, Corea) son fuentes comerciales de extracto de CRG y varios extractos de ginseng rojo de diversos orígenes coreanos (incluidos KRGA, KRGB y KRGC).El ginseng rojo se elabora a partir de las raíces de ginseng fresco de 6 años.El extracto de ginseng rojo se obtiene lavando el ginseng con agua tres veces, luego concentrando el extracto acuoso y finalmente secando a baja temperatura para obtener extracto de ginseng en polvo.Los anticuerpos (anti-Nrf2, anti-GST y β-actina), inmunoglobulina G anti-conejo (IgG) conjugada con peroxidasa de rábano picante, reactivo de transfección, ARNip de control y ARNip de Nrf2 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). .), EE.UU).
Las células Caco2 y hEL se cultivaron en placas de cultivo celular de 100 mm2 con MEM que contenía 10% de FBS a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.Para determinar el efecto de las condiciones de tratamiento, se incubaron células hEL con diferentes concentraciones de B (a) P y G-Rg3 en MEM durante 48 h.Las células se pueden analizar o recolectar más a fondo para preparar extractos libres de células.
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Experimental de la Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (Aprobación No. 2019; Registro No. 4587TH).Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, y el estudio se realizó de acuerdo con las pautas de Investigación con animales: Informes de experimentos in vivo (ARRIVE).A ratones A/J de ocho semanas de edad se les inyectó por primera vez por vía intraperitoneal B(a)P en solución de tricaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Después de una semana, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de control y diferentes grupos de tratamiento, 15 ratones en cada grupo, y se les administró sonda una vez al día.Después de 20 semanas de tratamiento, los animales fueron sacrificados mediante asfixia con CO2.Se recogieron los pulmones y se fijaron durante 24 horas.Se cuantificó el número de tumores superficiales y el tamaño de los tumores individuales para cada pulmón bajo un microscopio de disección.Las estimaciones del volumen del tumor (V) se calcularon utilizando la siguiente expresión: V (mm3) = 4/3πr3, donde r es el diámetro del tumor.La suma neta de todos los volúmenes tumorales en los pulmones de los ratones representó el volumen total del tumor, y el volumen total promedio del tumor en cada grupo representó la carga tumoral.Se recogieron muestras de sangre entera e intestinales y se almacenaron a -80 °C para su determinación por UPLC-MS/MS.Se recogió suero y se utilizó un analizador químico automatizado para analizar los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y creatinina sérica (Cr) para evaluar la función hepática y renal.
Las muestras recolectadas se sacaron del almacenamiento en frío, se descongelaron, se pesaron y se colocaron en tubos como se describe anteriormente.A esto se le añadió florizina 0,5 µM (estándar interno) en 0,8 ml de solución de metanol.Luego se homogeneizó el tejido usando Tissue-Tearor y posteriormente se transfirió el homogeneizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.La mezcla se centrifugó a 15.500 rpm durante 15 minutos.Después de retirar 1,0 ml de sobrenadante, secar con nitrógeno.Para la recuperación se utilizaron doscientos microlitros de metanol.La sangre se recoge y procesa en una línea y se utiliza como referencia para todas las mediciones.
Se sembraron placas Transwell de 24 pocillos con 1,0 x 105 células Caco-2 por pocillo para evaluar la posible mejora del transporte de G-Rg3 mediante la adición de verapamilo.Después de 3 semanas de cultivo, las células se lavaron con HBSS y se preincubaron a 37°C.Se inyectaron 400 μL de G-Rg3 10 μM (G-Rg3r, G-Rg3s o una mezcla con verapamilo 50 o 100 μM) en el lado basolateral o apical de la monocapa, y se agregaron 600 μL de solución HBSS al otro. lado.Recoger 100 l de medio de cultivo en los tiempos designados (0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos) y agregar 100 l de HBSS para completar este volumen.Las muestras se almacenaron a -4 °C hasta su detección mediante UPLC-MS/MS.La expresión Papp = dQ/(dT × A × C0) se utiliza para cuantificar la permeabilidad aparente unidireccional apical y basolateral y viceversa (Pa-b y Pb-a, respectivamente);dQ/dT es el cambio de concentración, A (0,6 cm2) es el área de superficie de la monocapa y C0 es la concentración inicial del donante.La relación de eflujo se calcula como Pb-a/Pa-b, que representa la tasa de eflujo del fármaco del estudio.
Se dejaron en ayunas ratas Wistar macho durante 24 horas, solo bebieron agua y se anestesiaron con una inyección intravenosa de una solución de pentobarbital al 3,5%.El tubo de silicona intubado tiene el extremo del duodeno como entrada y el extremo del íleon como salida.Utilice una bomba peristáltica para bombear la entrada con 10 μM G-Rg3r o G-Rg3s en HBSS isotónico a un caudal de 0,1 ml/min.El efecto del verapamilo se evaluó añadiendo 50 µM o 100 µM del compuesto a G-Rg3r o G-Rg3s 10 µM.UPLC-MS/MS se realizó en extractos de perfusión recolectados en los momentos 60, 90, 120 y 150 minutos después del inicio de la perfusión.El porcentaje de absorción se cuantifica mediante la fórmula % absorción = (1 – Cout/Cin) × 100%;la concentración de G-Rg3 en la salida y la entrada se expresa mediante Cout y Cin, respectivamente.
Las células hEL se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se trataron con B (a) P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) o G-Rg3 disuelto en DMSO. .Luego, los fármacos se diluyeron con medio de cultivo a diversas concentraciones (0, 1, 2, 5, 10, 20 µM) durante 48 horas.Utilizando un kit de ensayo MTS disponible comercialmente, las células se sometieron a un protocolo estándar y luego se midieron utilizando un lector de microplacas a 490 nm.El nivel de viabilidad celular de los grupos cotratados con B(a)P (10 µM) y G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 µM) se evaluó según el método anterior y se comparó con el grupo no tratado.
Se sembraron células hEL en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo y se trataron con 10 μMB (a) P en presencia o ausencia de G-Rg3 10 μM.Después de 48 horas de tratamiento, se extrajo el ADN de las células hEL utilizando el QIAamp DNA Mini Kit según el protocolo del fabricante.La formación de aductos de BPDE-ADN se detectó utilizando un kit ELISA de aductos de BPDE-ADN.Los niveles relativos de aducto BPDE-ADN se midieron usando un lector de microplacas midiendo la absorbancia a 450 nm.
Se sembraron células hEL en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se trataron con 10 μMB (a) P en ausencia o presencia de G-Rg3 10 μM durante 48 h.La actividad de GST se midió utilizando un kit de ensayo de actividad de GST comercial según el protocolo del fabricante.La activación relativa de GST se midió mediante absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.
Las células hEL se lavaron con PBS enfriado con hielo y luego se lisaron utilizando un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contenía inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa.Después de la cuantificación de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas totales, se separaron 30 μg de proteína en cada muestra mediante SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una membrana de PVDF mediante electroforesis.Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C.Después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante, se agregaron reactivos de quimioluminiscencia mejorados para visualizar la señal de unión.La intensidad de cada banda de proteína se cuantificó utilizando el software ImageJ.
Se utilizó el software GraphPad Prism 7.0 para analizar todos los datos, expresados como media ± desviación estándar.La variación entre los grupos de tratamiento se evaluó mediante la prueba t de Student o el análisis de varianza unidireccional, con un valor de P <0,05 que indica significación estadística.
Todos los datos obtenidos o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en archivos de información complementaria.
Torre, LA, Siegel, RL y Jemal, A. Estadísticas del cáncer de pulmón.adverbio.Venció.medicamento.biología.893, 1-19 (2016).
Hecht, S. Carcinógenos del tabaco, sus biomarcadores y el cáncer inducido por el tabaco.Nat.Capellán contra el cáncer.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH y Venitt, S. ADN y aductos de proteínas en tejidos humanos resultantes de la exposición al humo del tabaco.internacionalidad.J. Cáncer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA y Yu M. Efecto de Houttuynia cordata y silibinina sobre la tumorigénesis pulmonar inducida por benzo(a)pireno en ratones A/J.Cáncer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. y col.Producto natural anticancerígeno aislado de materiales medicinales chinos.mandíbula.medicamento.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Eficacia del polifenón E, ginseng rojo y rapamicina sobre la tumorigénesis pulmonar inducida por benzo(a)pireno en ratones A/J.Cáncer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS y Yuan, KS Red, participación en la terapia del cáncer.mandíbula.J. Nutt.medicamento.14, 7-16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS y Gao, L. Ginsenósidos en las raíces y hojas del ginseng americano.J. Agrícola.Química de Alimentos.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA y Yuan KS Farmacología del ginseng: muchos componentes y muchos efectos.bioquímica.farmacología.58, 1685-1693 (1999).
Hora de publicación: 17 de septiembre de 2023