Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parimate tulemuste saavutamiseks soovitame kasutada brauseri uuemat versiooni (või Internet Exploreris ühilduvusrežiimi välja lülitada).Vahepeal kuvame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiili või JavaScriptita.
Punast ženšenni on traditsioonilises Aasia meditsiinis kasutatud sadu aastaid.Selles uuringus hindasime erinevates piirkondades kasvatatud nelja tüüpi punase ženšenni (Hiina punane ženšenn, Korea punane ženšenn A, Korea punane ženšenn B ja Korea punane ženšenn C) võimet pärssida kantserogeenidest põhjustatud kopsude teket ja kasvu. kasvajad.A/J hiirtel viidi läbi benso(a)püreeni (B(a)P) test ja leiti, et Korea punane ženšenn B on nelja punase ženšenni sordi hulgas kasvajakoormuse vähendamisel kõige tõhusam.Lisaks analüüsisime erinevate ginsenosiidide (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 ja Rg5) sisaldust neljas punase ženšenni ekstraktis ja leidsime, et Korea punasel ženšenn B-l oli ginsenoside Rg3 (G-Rg3) kõrgeim tase, mis viitab sellele, et G-Rg3 võib mängida olulist rolli selle terapeutilises efektiivsuses.See töö näitab, et G-Rg3 biosaadavus on suhteliselt madal.Kui aga G-Rg3 manustati koos P-gp inhibiitori verapamiiliga, vähenes G-Rg3 väljavool Caco-2 rakkudesse, G-Rg3 soolest imendumise kiirus rotimudelis suurenes ja G-Rg3 suurendati.Caco-2 rakkudes väheneb Rg3 väljavool ja Rg3 kontsentratsiooni tase väheneb.G-Rg3 suureneb soolestikus ja plasmas ning selle võime ennetada kasvajaid on samuti suurenenud B (a) P-indutseeritud tuumorigeneesi rotimudelis.Samuti leidsime, et G-Rg3 vähendas B(a)P-indutseeritud tsütotoksilisust ja DNA aduktide moodustumist inimese kopsurakkudes ning taastas II faasi ensüümide ekspressiooni ja aktiivsuse läbi Nrf2 raja, mis võib olla seotud potentsiaalse toimemehhanismiga. G inhibeerimisest -Rg3..Kopsukasvajate esinemisest.Meie uuring näitab G-Rg3 potentsiaalselt olulist rolli kopsukasvajate sihtimisel hiiremudelites.Selle ginsenosiidi suukaudset biosaadavust suurendab P-glükoproteiini sihtimine, võimaldades molekulil avaldada vähivastast toimet.
Kõige tavalisem kopsuvähi tüüp on mitteväikerakk-kopsuvähk (NSCLC), mis on Hiinas ja Põhja-Ameerikas üks peamisi vähisurmade põhjuseid1,2.Peamine tegur, mis suurendab riski haigestuda mitteväikerakk-kopsuvähki, on suitsetamine.Sigaretisuits sisaldab rohkem kui 60 kantserogeeni, sealhulgas benso(a)püreeni (B(a)P), nitrosoamiine ja radooni lagunemisel tekkivaid radioaktiivseid isotoope.3 Polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud B(a)P on sigarettide mürgisuse peamine põhjus. suitsu.Kokkupuutel B(a)P-ga muudab tsütokroom P450 selle B(a)P-7,8-dihüdrodiool-9,10-epoksiidiks (BPDE), mis reageerib DNA-ga, moodustades BPDE-DNA adukti 4. aduktid kutsuvad esile kopsutuumorigeneesi hiirtel, kellel on kasvaja staadium ja histopatoloogia sarnane inimese kopsukasvajatega5.See omadus muudab B(a)P-indutseeritud kopsuvähi mudeli sobivaks süsteemiks võimalike vähivastaste omadustega ühendite hindamiseks.
Üks võimalik strateegia kopsuvähi tekke ärahoidmiseks kõrge riskiga rühmades, eriti suitsetajates, on kemopreventiivsete ainete kasutamine, et pärssida intraepiteliaalsete neoplastiliste kahjustuste teket ja vältida seeläbi nende edasist progresseerumist pahaloomuliseks kasvajaks.Loomkatsed näitavad, et mitmesugused kemopreventiivsed ained on tõhusad6.Meie eelmises aruandes7 rõhutati punase ženšenni head ennetavat mõju kopsuvähile.Seda ürti on traditsioonilises Aasia meditsiinis kasutatud sajandeid eluea ja tervise pikendamiseks ning sellel on dokumenteeritud kasvajavastane toime8.
Ženšenni aktiivne tegur on žensenosiid, mida kasutatakse ženšenni ekstraktide kvaliteedi hindamiseks komposiitmarkerina.Ženšenni toorekstraktide kvantitatiivne analüüs hõlmab tavaliselt mitme ginsenosiidi, sealhulgas RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 ja Rc9,10 kasutamist.Ginsenosiidid on nende väga halva suukaudse biosaadavuse tõttu kliiniliselt vähe kasutatavad11.Kuigi selle halva biosaadavuse mehhanism ei ole selge, võib põhjuseks olla P-glükoproteiini (P-gp)12 põhjustatud ginsenosiidide väljavool.P-gp on ATP-d siduva kassetttransporterite superperekonna üks olulisemaid väljavoolu transportereid, mis kasutab ATP hüdrolüüsi energiat rakusiseste ainete vabastamiseks väliskeskkonda.P-gp transporterid on tavaliselt laialt levinud soolestikus, neerudes, maksas ja hematoentsefaalbarjääris13.P-gp mängib kriitilist rolli soolestikus imendumisel ning P-gp pärssimine suurendab mõnede vähivastaste ravimite suukaudset imendumist ja kättesaadavust12,14.Varem kirjanduses kasutatud inhibiitorite näideteks on verapamiil ja tsüklosporiin A15.See töö hõlmab hiiresüsteemi loomist B(a)P-indutseeritud kopsuvähi uurimiseks, et hinnata erinevate Hiinast ja Koreast pärit punase ženšenni ekstraktide võimet mõjutada pahaloomulisi kasvajaid.Ekstrakte analüüsiti individuaalselt, et tuvastada spetsiifilised ginsenosiidid, mis võivad mõjutada kantserogeneesi.Seejärel kasutati verapamiili P-gp sihtmärgiks ning vähile suunatud ginsenosiidide suukaudse biosaadavuse ja terapeutilise efektiivsuse parandamiseks.
Mehhanism, mille abil ženšennisaponiinid avaldavad kantserogeneesile terapeutilist toimet, jääb ebaselgeks.Uuringud on näidanud, et erinevad ginsenosiidid võivad vähendada kantserogeenide põhjustatud DNA kahjustusi, vähendades oksüdatiivset stressi ja aktiveerides II faasi detoksifitseerimise ensüüme, vältides seeläbi rakukahjustusi.Glutatioon-S-transferaas (GST) on tüüpiline II faasi ensüüm, mis on vajalik kantserogeenide põhjustatud DNA kahjustuste vähendamiseks17.Tuuma erütroid 2-ga seotud faktor 2 (Nrf2) on oluline transkriptsioonifaktor, mis reguleerib redoks-homöostaasi ja aktiveerib II faasi ensüümide ekspressiooni ja tsütoprotektiivseid antioksüdantseid vastuseid18.Meie uuringus uuriti ka tuvastatud ginsenosiidide mõju B (a) P-indutseeritud tsütotoksilisuse ja BPDE-DNA adukti moodustumise vähendamisele, samuti II faasi ensüümide indutseerimist, moduleerides normaalsetes kopsurakkudes Nrf2 rada.
B (a) P-indutseeritud vähi hiiremudeli loomine on kooskõlas varasema tööga .Joonisel 1A on näidatud B(a)P, vee (kontroll), Hiina punase ženšenni ekstrakti (CRG), Korea punase ženšenni ekstrakti A (KRGA) ja Korea punasega indutseeritud hiire vähimudeli 20-nädalase ravi eksperimentaalne ülesehitus. ženšenn.Ekstrakt B (KRGB) ja Korea punase ženšenni ekstrakt C (KRGC).Pärast 20-nädalast punase ženšenni töötlemist surmati hiired CO2 lämbumisega.Joonisel 1B on kujutatud erinevat tüüpi punase ženšenniga ravitud loomade makroskoopilisi kopsukasvajaid ja joonisel 1C on kujutatud kasvajaproovi tüüpiline valgusmikroskoopia.KRGB-ga ravitud loomade kasvajakoormus (1,5 ± 0,35) oli väiksem kui kontrollloomadel (0,82 ± 0,2, P < 0,05), nagu on näidatud joonisel 1D.Kasvaja koormuse inhibeerimise keskmine aste oli 45%.Muud testitud punase ženšenni ekstraktid ei näidanud selliseid olulisi muutusi kasvajakoormuses (P > 0,05).Hiiremudelil ei täheldatud 20-nädalase punase ženšenni ravi ajal ilmseid kõrvaltoimeid, sealhulgas kehakaalu muutust (andmeid pole näidatud) ega maksa- või neerutoksilisust (joonis 1E, F).
Punase ženšenni ekstrakt ravib A/J hiirte kopsukasvaja arengut.(A) Eksperimentaalne disain.(B) Suured kopsukasvajad hiiremudelis.Kasvajad on tähistatud nooltega.a: Hiina punase ženšenni rühm.b: Korea punase ženšenni A-rühm.c: Korea punase ženšenni rühm B. d: Korea punase ženšenni rühm C. d: kontrollrühm.(C) Valgusmikroskoopia, mis näitab kopsukasvajat.Suurendus: 100. b: 400. (D) Kasvajakoormus punase ženšenni ekstrakti rühmas.(E) Maksaensüümi ALT tase plasmas.(F) Neeruensüümi Cr tase plasmas.Andmed on väljendatud kui keskmine ± standardhälve.*P <0,05.
Selles uuringus tuvastatud punase ženšenni ekstrakte analüüsiti üliefektiivse vedelikkromatograafia tandem-massispektromeetria (UPLC-MS/MS) abil, et määrata kindlaks järgmised ginsenosiidid: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 ja Rg5.Analüütide mõõtmiseks kasutatud UPLC ja MS tingimusi kirjeldati eelmises aruandes19.Nelja punase ženšenni ekstrakti UPLC-MS/MS kromatogrammid on näidatud joonisel 2A.Ginsenosiidi kogusisalduses oli olulisi erinevusi, kõrgeim ginsenosiidi kogusisaldus CRG-s (590,27 ± 41,28 μmol/L) (joonis 2B).Üksikute ginsenosiidide hindamisel (joonis 2C) näitas KRGB G-Rg3 kõrgeimat taset võrreldes teiste ginsenosiididega (G-Rg3 puhul 58,33 ± 3,81 μmol/L ja G -Rg3r puhul 41,56 ± 2,88 μmol/L).punase ženšenni tüüp (P < 0,001).G-Rg3 esineb stereoisomeeride paarina G-Rg3r ja G-Rg3s, mis erinevad hüdroksüülrühma asukoha poolest süsiniku juures 20 (joonis 2D).Tulemused näitavad, et G-Rg3r või G-Rg3 võib B (a) P-indutseeritud vähi hiiremudelis omada olulist vähivastast potentsiaali.
Ginsenosiidide sisaldus erinevates punase ženšenni ekstraktides.(A) Nelja punase ženšenni ekstrakti UPLC-MS/MS kromatogrammid.(B) Ginsenosiidi kogusisalduse hindamine näidatud ekstraktides.(C) Üksikute ginsenosiidide tuvastamine märgistatud ekstraktides.(D) Ginsenosiidi stereoisomeeride G-Rg3r ja G-Rg3s struktuurid.Andmed on väljendatud kolmekordsete määramiste keskmise ± standardhälbena.***P <0,001.
UPLC-MS/MS uuring nõudis ginsenosiidide kvantifitseerimist soole- ja vereproovides pärast 20-nädalast ravi.Ravi KRGB-ga näitas ainult 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 sisaldust veres.Järelejäänud ginsenosiide ei tuvastatud, mis viitab halvale suukaudsele biosaadavusele ja seega vähenenud kokkupuutele nende ginsenosiididega.
Käärsoole adenokartsinoomi rakuliin Caco-2 on morfoloogiliselt ja biokeemiliselt sarnane inimese sooleepiteelirakkudega, mis näitab selle kasulikkust enterotsüütide transpordi hindamisel läbi sooleepiteeli barjääri.See analüüs põhines varasemal uuringul 20 .Joonistel fig 3A, B, C, D, E, F on kujutatud tüüpilisi pilte G-Rg3r ja G-Rg3 transtsellulaarsest transpordist, kasutades Caco-2 ühekihilist mudelit.G-Rg3r või G-Rg3 transtsellulaarne transport Caco-2 monokihtide vahel basolateraalsest tipust (Pb-a) oli oluliselt kõrgem kui tipust basolateraalsele küljele (Pa-b).G-Rg3r puhul oli keskmine Pa-b väärtus 0,38 ± 0,06, mis tõusis 0,73 ± 0,06-ni pärast töötlemist 50 μmol/L verapamiiliga ja 1,14 ± 0,09-ni pärast töötlemist 100 μmol/L verapamiiliga (p <, 0,011 ja 0,001 vastavalt joonis 2).3A).G-Rg3 vaatlused järgisid sarnast mustrit (joonis 3B) ja tulemused näitasid, et ravi verapamiiliga suurendas G-Rg3r ja G-Rg3 transporti.Verapamiiliga töötlemine põhjustas ka keskmise Pb-a ja G-Rg3r ja G-Rg3 väljavoolu suhte märkimisväärse vähenemise (joonis 3C, D, E, F), mis näitab, et verapamiiliga töötlemine vähendab ginsenosiidi sisaldust Caco-2 väljavoolurakkudes..
G-Rg3 transtsellulaarne transport Caco-2 monokihtides ja imendumine soolestikus roti perfusioonianalüüsis.(A) G-Rg3r rühma Pa-b väärtus Caco-2 monokihis.(B) G-Rg3s rühmade Pa-b väärtus Caco-2 monokihis.(C) G-Rg3r rühma Pb väärtus Caco-2 monokihis.(D) G-Rg3s rühmade Pb väärtus Caco-2 monokihis.(E) G-Rg3r rühmade saagisuhe Caco-2 monokihis.(F) G-Rg3 rühmade saagisuhe Caco-2 monokihis.(G) G-Rg3r soolestiku imendumise protsent rottide perfusioonianalüüsis.(H) G-Rg3 soolestikus imendumise protsent rottide perfusioonianalüüsis.Läbilaskvust ja imendumist võrreldi ilma verapamiili lisamiseta.Andmed on väljendatud viie sõltumatu katse keskmise ± standardhälbena.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Kooskõlas varasema tööga20 viidi läbi rottide ortotoopiline sooleperfusioon, et teha kindlaks, kas G-Rg3 imendumine soolestikus suureneb pärast ravi verapamiiliga.Joonistel fig 3G, H on näidatud tüüpilised perfusioonianalüüsid, et hinnata G-Rg3r ja G-Rg3 soolestikus imendumise protsenti vähimudeli rottidel ülaltoodud ajaperioodide jooksul.Esialgne nõrga G-Rg3r omastamise protsent ligikaudu 10% suurenes pärast 50 μM verapamiiliga töötlemist enam kui 20%-ni ja pärast 100 μM verapamiiliga töötlemist enam kui 25%-ni.Samuti näitas G-Rg3, mille algne omastamine oli 10%, tipp pärast 50 μM verapamiiliga töötlemist üle 20% ja pärast 100 μM verapamiiliga töötlemist peaaegu 30%, mis viitab sellele, et verapamiiliga P-gp inhibeerimine võimendab. soole G-absorptsioon Rg3 kopsuvähi hiiremudelis.
Ülaltoodud meetodi kohaselt jaotati B (a) P-indutseeritud vähimudeli hiired juhuslikult kuueks rühmaks, nagu on näidatud joonisel 4A.G-Rg3 ravirühmas võrreldes kontrollrühmaga ei täheldatud märkimisväärset kehakaalu langust ega toksilisuse kliinilisi tunnuseid (andmeid pole näidatud).Pärast 20-nädalast ravi koguti iga hiire kopsud.Joonisel 4B on näidatud makroskoopilised kopsukasvajad hiirtel ülaltoodud ravirühmades ja joonisel 4C on kujutatud tüüpilise kasvaja tüüpiline valgusmikroskoopia.Mis puudutab kasvajakoormust igas rühmas (joonis 4D), siis G-Rg3r ja G-Rg3s-ga ravitud hiirte väärtused olid vastavalt 0,75 ± 0,29 mm3 ja 0,81 ± 0,30 mm3, samas kui ravitud G-hiirte väärtused -Rg3-ga olid vastavalt 1,63 ±0,40 mm3.kontrollhiirtel (p < 0,001), mis näitab, et G-Rg3 ravi vähendas hiirte kasvajakoormust.Verapamiili manustamine suurendas seda vähenemist veelgi: verapamiil+ G-Rg3r hiirte väärtused vähenesid 0,75 ± 0,29 mm3-lt 0,33 ± 0,25 mm3-le (p < 0,01) ja verapamiil+ väärtused 0,81 ± 0,30 mm2-lt vähenesid 1,9-le ± 0,30 mm2-le. mm3 G. -Rg3s-ga töödeldud hiirtel (p < 0,05), mis näitab, et verapamiil võib tugevdada G-Rg3 inhibeerivat toimet tuumorigeneesile.Kasvajakoormus ei näidanud olulisi erinevusi kontrollrühma ja verapamiili rühma, G-Rg3r rühma ja G-Rg3s rühma ning verapamiil + G-Rg3r rühma ja verapamiili + G-Rg3s rühma vahel.Lisaks ei olnud hinnatud raviga seotud olulisi maksa- või neerutoksilisust (joonis 4E, F).
Kasvajakoormus pärast G-Rg3-ravi ning plasma või soole G-Rg3r ja G-Rg3 tase näidatud rühmades.(A) Eksperimentaalne disain.(B) Makroskoopilised kasvajad hiiremudelis.Kasvajad on tähistatud nooltega.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r kombinatsioonis verapamiiliga.d: G-Rg3 kombinatsioonis verapamiiliga.d: verapamiil.e: juhtimine.(C) Kasvaja optiline mikrograaf suurendusel.Vastus: 100x.b: 400X.(D) G-Rg3 + verapamiili ravi mõju kasvajakoormusele A / J hiirtel.(E) Maksaensüümi ALT tase plasmas.(F) Neeruensüümi Cr tase plasmas.(G) Näidatud rühmade G-Rg3r või G-Rg3 tase plasmas.(H) G-Rg3r või G-Rg3 tase näidatud rühmade soolestikus.Andmed on väljendatud kolmekordsete määramiste keskmise ± standardhälbena.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3 tasemeid B(a)P-indutseeritud vähimudeli hiirtel hinnati UPLC-MS/MS abil pärast 20-nädalast raviperioodi vastavalt meetodite jaotises kirjeldatud meetodile.Joonistel 4G ja H on näidatud vastavalt plasma ja soolestiku G-Rg3 tase.Plasma G-Rg3r tase oli 0,44 ± 0,32 μmol/L ja tõusis verapamiili samaaegsel manustamisel 1,17 ± 0,47 μmol/L-ni (p < 0,001), samas kui soolestiku G-Rg3r tase oli 0,53 ± 0,08 µg/lKombineerituna verapamiiliga tõusis g 1,35 ± 0,13 μg/g-ni (p < 0,001).G-Rg3 puhul järgisid tulemused sarnast mustrit, mis näitab, et ravi verapamiiliga suurendas G-Rg3 suukaudset biosaadavust A/J hiirtel.
B(a)P ja G-Rg3 tsütotoksilisuse hindamiseks hEL-rakkudel kasutati rakkude elujõulisuse testi.B(a)P indutseeritud tsütotoksilisus hEL-rakkudes on näidatud joonisel fig 5A, samas kui G-Rg3r ja G-Rg3 mittetoksilised omadused on näidatud joonistel 5A ja 5B.5B, C. G-Rg3 tsütoprotektiivse toime hindamiseks manustati hEL rakkudesse B(a)P koos erinevate G-Rg3r või G-Rg3 kontsentratsioonidega.Nagu on näidatud joonisel 5D, taastas G-Rg3r kontsentratsioonidel 5 μM, 10 μM ja 20 μM rakkude elujõulisuse vastavalt 58, 3%, 79, 3% ja 77, 3%.Sarnaseid tulemusi võib näha ka G-Rg3s rühmas.Kui G-Rg3 kontsentratsioonid olid 5 uM, 10 uM ja 20 uM, taastus rakkude elujõulisus vastavalt 58,3%, 72,7% ja 76,7% (joonis 5E).).BPDE-DNA aduktide olemasolu mõõdeti ELISA komplekti abil.Meie tulemused näitasid, et BPDE-DNA adukti tase tõusis B(a)P-ga ravitud rühmas võrreldes kontrollrühmaga, kuid võrreldes G-Rg3 kaasraviga suurenes BPDE-DNA adukti tase B(a)P rühmas. B ravitud rühmas vähenes DNA adukti tase oluliselt.Ainult B(a)P-ga töötlemise tulemused on näidatud joonisel 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 G-Rg3r puhul, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 G-Rg3s puhul, p < 0,001).
Rakkude elujõulisus ja BPDE-DNA adukti moodustumine G-Rg3 ja B(a)P-ga töödeldud hEL rakkudes.(A) B(a)P-ga töödeldud hEL-rakkude elujõulisus.(B) G-Rg3r-ga töödeldud hEL-rakkude elujõulisus.(C) G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkude elujõulisus.(D) B(a)P ja G-Rg3r-ga töödeldud hEL-rakkude elujõulisus.(E) B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkude elujõulisus.(F) BPDE-DNA adukti tasemed B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.Andmed on väljendatud kolmekordsete määramiste keskmise ± standardhälbena.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST ensüümi ekspressioon tuvastati pärast samaaegset töötlemist 10 μM B (a) P ja 10 μM G-Rg3r või G-Rg3s-ga.Meie tulemused näitasid, et B(a)P pärssis GST ekspressiooni (59,7 ± 8,2% G-Rg3r rühmas ja 39 ± 4,5% G-Rg3s rühmas) ja B(a)P oli seotud kummagi G-Rg3r-ga. või G-Rg3r-ga või G-Rg3r-ga.Kaasravi G-Rg3-ga taastas GST ekspressiooni.GST ekspressioon (103,7 ± 15,5% G-Rg3r rühmas ja 110 ± 11,1% G-Rg3s rühmas, vastavalt p < 0,05 ja p < 0,001, joonised 6A, B ja C).GST aktiivsust hinnati aktiivsuse analüüsi komplekti abil.Meie tulemused näitasid, et kombineeritud ravi rühmas oli kõrgem GST aktiivsus võrreldes ainult B(a)P rühmaga (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% G-Rg3r rühmas vs. 92,3 ± 6,5 G-Rg3r rühmas ).% vs 35,7 ± 7,8% G-Rg3s rühmas, p < 0,001, joonis 6D).
GST ja Nrf2 ekspressioon B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.(A) GST ekspressiooni tuvastamine Western blot analüüsiga.(B) GST kvantitatiivne ekspressioon B(a)P ja G-Rg3r-ga töödeldud hEL-rakkudes.(C) GST kvantitatiivne ekspressioon B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.(D) GST aktiivsus B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.(E) Nrf2 ekspressiooni tuvastamine Western blot analüüsiga.(F) Nrf2 kvantitatiivne ekspressioon B(a)P ja G-Rg3r-ga töödeldud hEL-rakkudes.(G) Nrf2 kvantitatiivne ekspressioon B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.Andmed on väljendatud kolmekordsete määramiste keskmise ± standardhälbena.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3-vahendatud B (a) P-indutseeritud tuumorigeneesi pärssimisega seotud radade selgitamiseks hinnati Nrf2 ekspressiooni Western blot analüüsiga.Nagu on näidatud joonistel 6E, F, G, vähenes kontrollrühmaga võrreldes ainult Nrf2 tase B(a)P ravirühmas;kuid võrreldes B(a)P ravirühmaga tõusid B(a) Nrf2 tasemed PG-Rg3 rühmas (106 ± 9,5% G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2% G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% G-Rg3s, p < 0,01).
Kinnitasime Nrf2 ennetavat rolli, pärssides Nrf2 ekspressiooni spetsiifilise väikese segava RNA (siRNA) abil.Nrf2 knockdown kinnitati Western blot analüüsiga (joonis 7A, B).Nagu on näidatud joonistel 7C, D, põhjustas hEL-rakkude samaaegne töötlemine B(a)P ja G-Rg3-ga BPDE-DNA aduktide arvu vähenemise (1,47 ± 0,21) võrreldes B(a)P-ga töötlemisega. üksi siRNA kontrollrühmas.) G-Rg3r oli 4,13 ± 0,49, G-Rg3s oli 1,8 ± 0,32 ja 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Kuid G-Rg3 inhibeeriv toime BPDE-DNA moodustumisele kaotati Nrf2 knockdowniga.SiNrf2 rühmas ei olnud BPDE-DNA adukti moodustumises olulist erinevust B(a)P ja G-Rg3 kaasravi ning ainult B(a)P ravi vahel (3,0 ± 0,21 G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32). ).G-Rg3r versus 3,6 G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0 ± 0,37, p > 0,05).
Nrf2 knockdowni mõju BPDE-DNA adukti moodustumisele hEL rakkudes.(A) Nrf2 knockdown kinnitati Western blot analüüsiga.(B) Nrf2 riba intensiivsuse kvantifitseerimine.(C) Nrf2 knockdowni mõju BPDE-DNA adukti tasemele B (a) P ja G-Rg3r-ga töödeldud hEL rakkudes.(D) Nrf2 knockdowni mõju BPDE-DNA adukti tasemele B(a)P ja G-Rg3-ga töödeldud hEL-rakkudes.Andmed on väljendatud kolmekordsete määramiste keskmise ± standardhälbena.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Selles uuringus hinnati erinevate punase ženšenni ekstraktide ennetavat mõju B(a)P-indutseeritud kopsuvähi hiiremudelile ja KRGB-ravi vähendas oluliselt kasvajakoormust.Arvestades, et G-Rg3 sisaldus selles ženšenni ekstraktis on kõrgeim, on uuritud selle ginsenosiidi olulist rolli tuumorigeneesi pärssimisel.Nii G-Rg3r kui ka G-Rg3 (G-Rg3 kaks epimeeri) vähendasid B (a) P-indutseeritud vähi hiiremudelis oluliselt kasvajakoormust.G-Rg3r ja G-Rg3 avaldavad vähivastast toimet, kutsudes esile kasvajarakkude apoptoosi21, pärssides kasvaja kasvu22, peatades rakutsükli23 ja mõjutades angiogeneesi24.Samuti on näidatud, et G-Rg3 pärsib raku metastaase25 ning dokumenteeritud on G-Rg3 võime tugevdada keemiaravi ja kiiritusravi mõjusid 26, 27.Poon jt näitasid, et G-Rg3 ravi võib vähendada B (a) P28 genotoksilist toimet.See uuring näitab G-Rg3 terapeutilist potentsiaali keskkonna kantserogeensete molekulide sihtimisel ja vähi ennetamisel.
Vaatamata heale profülaktilisele potentsiaalile on ginsenosiidide halb suukaudne biosaadavus nende molekulide kliinilisel kasutamisel väljakutseks.Ginsenosiidide suukaudse manustamise farmakokineetiline analüüs rottidele näitas, et selle biosaadavus on endiselt alla 5%29.Need testid näitasid, et pärast 20-nädalast raviperioodi vähenes ainult Rg5 tase veres.Kuigi halva biosaadavuse aluseks olevat mehhanismi tuleb veel selgitada, arvatakse, et P-gp on seotud ginsenosiidide väljavooluga.See töö näitas esimest korda, et P-gp blokaatori verapamiili manustamine suurendab G-Rg3r ja G-Rg3 suukaudset biosaadavust.Seega viitab see leid sellele, et G-Rg3r ja G-Rg3 toimivad P-gp substraatidena, et reguleerida selle väljavoolu.
See töö näitab, et kombineeritud ravi verapamiiliga suurendab G-Rg3 suukaudset biosaadavust kopsuvähi hiiremudelis.Seda leidu toetab G-Rg3 suurenenud soolestiku transtsellulaarne transport P-gp blokaadi korral, suurendades seeläbi selle imendumist.Caco2 rakkudes tehtud analüüsid näitasid, et ravi verapamiiliga vähendas G-Rg3r ja G-Rg3 väljavoolu, parandades samal ajal membraani läbilaskvust.Yangi jt uuring.Uuringud on näidanud, et ravi tsüklosporiin A-ga (teine P-gp blokaator) suurendab ginsenosiidi Rh2 biosaadavust algväärtuselt 1%20 enam kui 30%ni.Ginsenosiidide ühendid K ja Rg1 näitasid samuti sarnaseid tulemusi30, 31.Verapamiili ja tsüklosporiin A koosmanustamisel vähenes ühendi K väljavool Caco-2 rakkudes oluliselt 26,6-lt alla 3-le, samas kui selle rakusisene tase tõusis 40 korda30.Verapamiili juuresolekul suurenes Rg1 tase roti kopsuepiteelirakkudes, mis viitab P-gp rollile ginsenosiidi väljavoolus, nagu on näidanud Meng et al.31.Kuid verapamiil ei avaldanud sama mõju mõne ginsenosiidi (nagu Rg1, F1, Rh1 ja Re) väljavoolule, mis näitab, et P-gp substraadid neid ei mõjuta, nagu on näidanud Liang et al.32 .See tähelepanek võib olla seotud teiste transportijate ja alternatiivsete ginsenosiidi struktuuride kaasamisega.
G-Rg3 vähi ennetava toime mehhanism on ebaselge.Varasemad uuringud on näidanud, et G-Rg3 takistab DNA kahjustusi ja apoptoosi, vähendades oksüdatiivset stressi ja põletikku 16, 33, mis võib olla B (a) P-indutseeritud tuumorigeneesi vältimise alusmehhanism.Mõned aruanded näitavad, et B(a)P poolt indutseeritud genotoksilisust saab vähendada II faasi ensüümide moduleerimisega, moodustades BPDE-DNA34.GST on tüüpiline II faasi ensüüm, mis inhibeerib BPDE-DNA adukti moodustumist, soodustades GSH seondumist BPDE-ga, vähendades seeläbi B(a)P35 poolt indutseeritud DNA kahjustusi.Meie tulemused näitavad, et G-Rg3-ravi vähendab B (a) P-indutseeritud tsütotoksilisust ja BPDE-DNA adukti moodustumist hEL-rakkudes ning taastab GST ekspressiooni ja aktiivsuse in vitro.Kuid need toimed puudusid Nrf2 puudumisel, mis viitab sellele, et G-Rg3 kutsub esile tsütoprotektiivseid toimeid Nrf2 raja kaudu.Nrf2 on II faasi detoksikatsiooniensüümide peamine transkriptsioonifaktor, mis soodustab ksenobiootikumide kliirensit36.Nrf2 raja aktiveerimine kutsub esile tsütoprotektsiooni ja vähendab koekahjustusi37.Lisaks on mitmed aruanded toetanud Nrf2 rolli kasvaja supressorina kantserogeneesis38.Meie uuring näitab, et Nrf2 raja indutseerimine G-Rg3 poolt mängib olulist regulatiivset rolli B (a) P-indutseeritud genotoksilisuses, põhjustades B (a) P detoksikatsiooni, aktiveerides II faasi ensüüme, inhibeerides seeläbi tuumorigeneesi protsessi.
Meie töö näitab punase ženšenni potentsiaali B(a)P-indutseeritud kopsuvähi ennetamisel hiirtel ginsenoside G-Rg3 olulise kaasamise kaudu.Selle molekuli halb suukaudne biosaadavus takistab selle kliinilist kasutamist.See uuring näitab aga esimest korda, et G-Rg3 on P-gp substraat ja P-gp inhibiitori manustamine suurendab G-Rg3 biosaadavust in vitro ja in vivo.G-Rg3 vähendab B (a) P-indutseeritud tsütotoksilisust, reguleerides Nrf2 rada, mis võib olla selle ennetava funktsiooni potentsiaalne mehhanism.Meie uuring kinnitab ginsenoside G-Rg3 potentsiaali kopsuvähi ennetamiseks ja raviks.
Kuue nädala vanused emased A/J hiired (20 ± 1 g) ja 7-nädalased isased Wistari rotid (250 ± 20 g) saadi Jacksoni laborist (Bar Harbor, USA) ja Wuhani zooloogiainstituudist.Ülikool (Wuhan, Hiina).Hiina tüübikultuuri kogumise keskus (Wuhan, Hiina) varustas meid Caco-2 ja hEL-rakkudega.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) on B(a)P ja trikapriini allikas.Puhastatud ginsenosiidid G-Rg3r ja G-Rg3s, dimetüülsulfoksiid (DMSO), CellTiter-96 proliferatsioonitesti komplekt (MTS), verapamiil, minimaalne oluline sööde (MEM) ja veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Hiina).QIAamp DNA minikomplekt ja BPDE-DNA adukti ELISA komplekt osteti firmalt Qiagen (Stanford, CA, USA) ja Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).GST aktiivsuse analüüsi komplekt ja koguvalgu analüüsi komplekt (standardne BCA meetod) osteti ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina).Kõiki punase ženšenni ekstrakte hoitakse Mingyu Laboratory 7-s. Hongkongi baptistiülikool (Hongkong, Hiina) ja Korea vähikeskus (Soul, Korea) on CRG ekstrakti ja erinevate Korea päritolu (sh KRGA, KRGB) erinevate punaste ženšenni ekstraktide kaubanduslikud allikad. ja KRGC).Punane ženšenn on valmistatud 6-aastase värske ženšenni juurtest.Punase ženšenni ekstrakt saadakse ženšenni kolm korda veega pesemisel, seejärel vesiekstrakti kontsentreerimisel ja lõpuks kuivatamisel madalal temperatuuril, et saada ženšenni ekstrakti pulber.Antikehad (anti-Nrf2, anti-GST ja β-aktiin), mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud küülikuvastane immunoglobuliin G (IgG), transfektsioonireaktiiv, kontroll-siRNA ja Nrf2 siRNA osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Caco2 ja hEL rakke kultiveeriti 100 mm2 rakukultuuri tassides MEM-iga, mis sisaldas 10% FBS-i, temperatuuril 37 °C 5% CO2 niisutatud atmosfääris.Ravitingimuste mõju määramiseks inkubeeriti hEL-rakke erinevate B (a) P ja G-Rg3 kontsentratsioonidega MEM-is 48 tundi.Rakke saab täiendavalt analüüsida või koguda, et valmistada rakuvabad ekstraktid.
Kõik katsed kiitis heaks Huazhongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli Tongji meditsiinikolledži katseloomade eetika komitee (kinnitusnumber 2019; registreerimisnumber 4587TH).Kõik katsed viidi läbi vastavalt asjakohastele juhistele ja eeskirjadele ning uuring viidi läbi vastavalt Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) juhistele.Kaheksanädalastele A / J hiirtele süstiti esmalt intraperitoneaalselt B (a) P trikapriini lahuses (100 mg / kg, 0, 2 ml).Nädala pärast jagati hiired juhuslikult kontrollrühmadesse ja erinevatesse ravirühmadesse, igas rühmas oli 15 hiirt, ja neile tehti sondiga üks kord päevas.Pärast 20-nädalast ravi loomad surmati CO2 lämbumise tõttu.Kopsud koguti ja fikseeriti 24 tundi.Pindmiste kasvajate arv ja individuaalsed kasvaja suurused kvantifitseeriti iga kopsu kohta lahkamismikroskoobi all.Kasvaja mahu hinnangud (V) arvutati järgmise avaldise abil: V (mm3) = 4/3πr3, kus r on kasvaja läbimõõt.Hiirte kopsude kõigi kasvaja mahtude netosumma esindas kasvaja kogumahtu ja iga rühma keskmine kasvaja kogumaht esindas kasvaja koormust.UPLC-MS/MS määramiseks koguti täisvere- ja sooleproovid ja säilitati temperatuuril –80 °C.Seerum koguti ja alaniini aminotransferaasi (ALT) ja seerumi kreatiniini (Cr) taseme analüüsimiseks kasutati automaatset keemiaanalüsaatorit, et hinnata maksa- ja neerufunktsiooni.
Kogutud proovid eemaldati külmhoonest, sulatati, kaaluti ja asetati ülalkirjeldatud viisil katseklaasidesse.Sellele lisati 0,5 µM florisiini (sisestandard) 0,8 ml metanoolilahuses.Seejärel kude homogeniseeriti Tissue-Tearori abil ja homogenaat viidi seejärel 1,5 ml mikrotsentrifuugi katseklaasi.Segu tsentrifuugiti kiirusel 15500 p/min 15 minutit.Pärast 1,0 ml supernatandi eemaldamist kuivatage lämmastikuga.Taaskasutamiseks kasutati kakssada mikroliitrit metanooli.Veri kogutakse ja töödeldakse ühel real ning seda kasutatakse kõigi mõõtmiste võrdlusalusena.
24 süvendiga Transwelli plaatidele külvati 1,0 × 105 Caco-2 rakku süvendi kohta, et hinnata G-Rg3 transpordi võimalikku paranemist verapamiili lisamisega.Pärast 3-nädalast kultiveerimist pesti rakke HBSS-ga ja eelinkubeeriti 37 °C juures.Monokihi basolateraalsele või apikaalsele küljele süstiti 400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s või segu 50 või 100 μM verapamiiliga) ja teisele kihile lisati 600 μL HBSS lahust. pool.Koguge määratud aegadel (0, 15, 30, 45, 60, 90 ja 120 minutit) 100 µl söödet ja lisage selle mahu täiendamiseks 100 µl HBSS-i.Proove hoiti kuni UPLC-MS/MS-ga tuvastamiseni temperatuuril -4 °C.Avaldist Papp = dQ/(dT × A × C0) kasutatakse näilise ühesuunalise apikaalse ja basolateraalse läbilaskvuse kvantifitseerimiseks ja vastupidi (vastavalt Pa-b ja Pb-a);dQ/dT on kontsentratsiooni muutus, A (0,6 cm2) on monokihi pindala ja C0 on doonori algkontsentratsioon.Väljavoolu suhe arvutatakse kui Pb-a/Pa-b, mis esindab uuritava ravimi väljavoolu kiirust.
Isased Wistari rotid paastus 24 tundi, jõid ainult vett ja tuimastati 3,5% pentobarbitaali lahuse intravenoosse süstiga.Intubeeritud silikoontoru sissepääsuks on kaksteistsõrmiksoole ots ja väljapääsuks niudesoole ots.Kasutage peristaltilist pumpa, et pumbata sisselaskeava 10 µM G-Rg3r või G-Rg3s isotoonilises HBSS-is voolukiirusel 0,1 ml/min.Verapamiili toimet hinnati 50 μM või 100 μM ühendi lisamisega 10 μM G-Rg3r või G-Rg3s.UPLC-MS/MS viidi läbi perfusiooniekstraktidega, mis koguti ajapunktidel 60, 90, 120 ja 150 minutit pärast perfusiooni algust.Absorptsiooni protsent kvantifitseeritakse valemiga neeldumisprotsent = (1 – Cout/Cin) × 100%;G-Rg3 kontsentratsiooni väljalaske- ja sisselaskeava juures väljendatakse vastavalt Cout ja Cin.
hEL rakud külvati 96 süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta ja töödeldi B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 µM) või DMSO-s lahustatud G-Rg3-ga. .Seejärel lahjendati ravimeid 48 tunni jooksul söötmega erinevate kontsentratsioonideni (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM).Kasutades kaubanduslikult saadavat MTS-testikomplekti, allutati rakkudele standardprotokoll ja seejärel mõõdeti mikroplaadilugejaga 490 nm juures.B(a)P (10 μM) ja G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) samaaegselt töödeldud rühmade rakkude elujõulisuse taset hinnati ülaltoodud meetodil ja võrreldi ravimata rühmaga.
hEL-rakud külvati 6-augulistele plaatidele tihedusega 1 × 105 rakku süvendi kohta ja töödeldi 10 μMB (a) P-ga 10 μM G-Rg3 juuresolekul või puudumisel.Pärast 48-tunnist töötlemist ekstraheeriti DNA hEL-rakkudest, kasutades QIAamp DNA Mini komplekti vastavalt tootja protokollile.BPDE-DNA aduktide moodustumine tuvastati BPDE-DNA adukti ELISA komplekti kasutades.BPDE-DNA adukti suhtelisi tasemeid mõõdeti mikroplaadilugeja abil, mõõtes neeldumist lainepikkusel 450 nm.
hEL-rakud külvati 96-augulistele plaatidele tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta ja töödeldi 10 μMB (a) P-ga 10 μM G-Rg3 puudumisel või juuresolekul 48 tundi.GST aktiivsust mõõdeti, kasutades kaubanduslikku GST aktiivsuse analüüsi komplekti vastavalt tootja protokollile.Suhtelist GST aktivatsiooni mõõdeti neeldumise järgi 450 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat.
hEL rakke pesti jääkülma PBS-ga ja seejärel lüüsiti, kasutades proteaasi inhibiitoreid ja fosfataasi inhibiitoreid sisaldavat radioimmunosadestamise analüüsi puhvrit.Pärast valgu kvantifitseerimist, kasutades kogu valgu analüüsi komplekti, eraldati igas proovis 30 μg valku 12% SDS-PAGE abil ja kanti elektroforeesiga PVDF membraanile.Membraanid blokeeriti 5% kooritud piimaga ja inkubeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C.Pärast mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega inkubeerimist lisati seondumissignaali visualiseerimiseks tugevdatud kemoluminestsentsreagendid.Iga valguriba intensiivsus kvantifitseeriti ImageJ tarkvara abil.
Kõigi andmete analüüsimiseks kasutati tarkvara GraphPad Prism 7.0, väljendatuna keskmisena ± standardhälbena.Ravirühmade vahelisi erinevusi hinnati Studenti t-testi või ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, kusjuures P väärtus <0,05 näitab statistilist olulisust.
Kõik selle uuringu käigus saadud või analüüsitud andmed sisalduvad selles avaldatud artiklis ja täiendavates teabefailides.
Torre, LA, Siegel, RL ja Jemal, A. Kopsuvähi statistika.määrsõna.Aegunud.ravim.bioloogia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tubaka kantserogeenid, nende biomarkerid ja tubakast põhjustatud vähk.Nat.Vähi kaplan.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH ja Venitt, S. DNA ja valgu aduktid inimese kudedes, mis tulenevad tubakasuitsuga kokkupuutest.rahvusvahelisus.J. Vähk.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA ja Yu M. Houttuynia cordata ja silibiniini mõju benso(a)püreeni poolt indutseeritud kopsutuumorigeneesile A/J hiirtel.Cancer, 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Hiina meditsiinilistest materjalidest eraldatud vähivastane looduslik toode.lõualuu.ravim.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Polüfenoon E, punase ženšenni ja rapamütsiini efektiivsus benso(a) püreeni poolt indutseeritud kopsukasvaja tekkele A/J hiirtel.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS ja Yuan, KS Red, osalemine vähiravis.lõualuu.J. Nutt.ravim.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS ja Gao, L. Ginsenosides Ameerika ženšenni juurtes ja lehtedes.J. Agric.Toiduainete keemia.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA ja Yuan KS Ženšenni farmakoloogia: palju komponente ja palju toimeid.biokeemia.farmakoloogia.58, 1685–1693 (1999).
Postitusaeg: 17. september 2023