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Le ginseng rouge est utilisé dans la médecine traditionnelle asiatique depuis des centaines d’années.Dans cette étude, nous avons évalué la capacité de quatre types de ginseng rouge (ginseng rouge chinois, ginseng rouge coréen A, ginseng rouge coréen B et ginseng rouge coréen C) cultivés dans différentes régions à inhiber la formation et la croissance de poumons d'origine cancérigène. tumeurs.Un test au benzo(a)pyrène (B(a)P) a été réalisé sur des souris A/J, et le ginseng rouge coréen B s'est avéré le plus efficace pour réduire la charge tumorale parmi les quatre variétés de ginseng rouge.De plus, nous avons analysé le contenu de divers ginsénosides (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 et Rg5) dans quatre extraits de ginseng rouge et avons découvert que le ginseng rouge coréen B avait les niveaux les plus élevés de ginsénoside Rg3 (G-Rg3), ce qui suggère que le G-Rg3 pourrait jouer un rôle important dans son efficacité thérapeutique.Ce travail montre que le G-Rg3 a une biodisponibilité relativement faible.Cependant, lorsque G-Rg3 a été co-administré avec le vérapamil, un inhibiteur de la P-gp, l'efflux de G-Rg3 dans les cellules Caco-2 a été diminué, le taux d'absorption intestinale de G-Rg3 a été augmenté dans un modèle de rat, et G-Rg3 a été augmenté.Dans les cellules Caco-2, la sortie de Rg3 diminue et le niveau de concentration de Rg3 diminue.Le G-Rg3 est augmenté dans l'intestin et le plasma, et sa capacité à prévenir les tumeurs est également améliorée dans un modèle de rat de tumorigenèse induite par le B(a)P.Nous avons également constaté que le G-Rg3 réduisait la cytotoxicité induite par le B(a)P et la formation d'adduits à l'ADN dans les cellules pulmonaires humaines, et rétablissait l'expression et l'activité des enzymes de phase II via la voie Nrf2, ce qui pourrait être lié au mécanisme d'action potentiel. d'inhibition de G -Rg3..À propos de la survenue de tumeurs pulmonaires.Notre étude démontre le rôle potentiellement important du G-Rg3 dans le ciblage des tumeurs pulmonaires dans des modèles murins.La biodisponibilité orale de ce ginsénoside est améliorée en ciblant la glycoprotéine P, permettant à la molécule d'exercer des effets anticancéreux.
Le type de cancer du poumon le plus courant est le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), qui est l’une des principales causes de décès par cancer en Chine et en Amérique du Nord1,2.Le principal facteur qui augmente le risque de développer un cancer du poumon non à petites cellules est le tabagisme.La fumée de cigarette contient plus de 60 substances cancérigènes, dont le benzo(a)pyrène (B(a)P), des nitrosamines et des isotopes radioactifs issus de la désintégration du radon.3 Les hydrocarbures aromatiques polycycliques B(a)P sont la principale cause de toxicité des cigarettes. fumée.Lors de l'exposition au B(a)P, le cytochrome P450 le convertit en B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-époxyde (BPDE), qui réagit avec l'ADN pour former l'adduit BPDE-ADN 4. De plus, ces les adduits induisent une tumorigenèse pulmonaire chez des souris présentant un stade tumoral et une histopathologie similaires à ceux des tumeurs pulmonaires humaines5.Cette caractéristique fait du modèle de cancer du poumon induit par le B(a)P un système approprié pour évaluer des composés ayant de possibles propriétés anticancéreuses.
Une stratégie possible pour prévenir le développement du cancer du poumon dans les groupes à haut risque, en particulier les fumeurs, consiste à utiliser des agents chimiopréventifs pour supprimer le développement de lésions néoplasiques intraépithéliales et ainsi empêcher leur progression ultérieure vers une tumeur maligne.Les études animales montrent que divers agents chimiopréventifs sont efficaces6.Notre précédent rapport7 soulignait les bons effets préventifs du ginseng rouge sur le cancer du poumon.Cette plante est utilisée depuis des siècles dans la médecine traditionnelle asiatique pour prolonger la vie et la santé, et ses effets antitumoraux ont été documentés8.
Le facteur actif du ginseng est le ginsénoside, qui est utilisé comme marqueur composite pour évaluer la qualité des extraits de ginseng.L'analyse quantitative des extraits bruts de ginseng implique généralement l'utilisation de plusieurs ginsénosides, notamment RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 et Rc9,10.Les ginsénosides ont peu d’utilité clinique en raison de leur très faible biodisponibilité orale11.Bien que le mécanisme de cette faible biodisponibilité ne soit pas clair, l’efflux de ginsénosides provoqué par la glycoprotéine P (P-gp)12 pourrait en être la cause.La P-gp est l'un des transporteurs d'efflux les plus importants de la superfamille des transporteurs de cassettes de liaison à l'ATP, qui utilise l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour libérer des substances intracellulaires dans l'environnement externe.Les transporteurs de la P-gp sont généralement largement distribués dans l’intestin, les reins, le foie et la barrière hémato-encéphalique13.La P-gp joue un rôle essentiel dans l’absorption intestinale, et son inhibition augmente l’absorption orale et la disponibilité de certains médicaments anticancéreux12,14.Des exemples d'inhibiteurs précédemment utilisés dans la littérature sont le vérapamil et la cyclosporine A15.Ce travail consiste à établir un système murin pour étudier le cancer du poumon induit par le B(a)P afin d'évaluer la capacité de différents extraits de ginseng rouge de Chine et de Corée à affecter les tumeurs malignes.Les extraits ont été analysés individuellement pour identifier les ginsénosides spécifiques susceptibles d'affecter la cancérogenèse.Le vérapamil a ensuite été utilisé pour cibler la P-gp et améliorer la biodisponibilité orale et l'efficacité thérapeutique des ginsénosides ciblant le cancer.
Le mécanisme par lequel les saponines de ginseng exercent des effets thérapeutiques sur la carcinogenèse reste flou.La recherche a montré que divers ginsénosides peuvent réduire les dommages à l'ADN causés par les agents cancérigènes en réduisant le stress oxydatif et en activant les enzymes de détoxification de phase II, prévenant ainsi les dommages cellulaires.La glutathion S-transférase (GST) est une enzyme typique de phase II nécessaire pour réduire les dommages à l'ADN causés par les cancérogènes17.Le facteur 2 lié à l'érythroïde nucléaire 2 (Nrf2) est un facteur de transcription important qui régule l'homéostasie rédox et active l'expression des enzymes de phase II et des réponses antioxydantes cytoprotectrices18.Notre étude a également examiné les effets des ginsénosides identifiés sur la réduction de la cytotoxicité induite par le B(a)P et de la formation d'adduits BPDE-ADN, ainsi que sur l'induction d'enzymes de phase II en modulant la voie Nrf2 dans les cellules pulmonaires normales.
L’établissement d’un modèle murin de cancer induit par le B(a)P est conforme aux travaux antérieurs5.La figure 1A montre le plan expérimental d'un traitement de 20 semaines d'un modèle de cancer de souris induit par le B(a)P, l'eau (témoin), l'extrait de ginseng rouge chinois (CRG), l'extrait de ginseng rouge coréen A (KRGA) et le rouge coréen. ginseng.Extrait B (KRGB) et extrait C de ginseng rouge coréen (KRGC).Après 20 semaines de traitement au ginseng rouge, les souris ont été sacrifiées par asphyxie au CO2.La figure 1B montre des tumeurs macroscopiques du poumon chez des animaux traités avec différents types de ginseng rouge, et la figure 1C montre une micrographie lumineuse représentative d'un échantillon de tumeur.La charge tumorale des animaux traités au KRGB (1,5 ± 0,35) était inférieure à celle des animaux témoins (0,82 ± 0,2, P <0,05), comme le montre la figure 1D.Le degré moyen d'inhibition de la charge tumorale était de 45 %.D'autres extraits de ginseng rouge testés n'ont pas montré de changements aussi significatifs dans la charge tumorale (P > 0,05).Aucun effet secondaire évident n'a été observé chez le modèle murin pendant 20 semaines de traitement au ginseng rouge, notamment aucun changement de poids corporel (données non présentées) et aucune toxicité hépatique ou rénale (Figure 1E, F).
L'extrait de ginseng rouge traite le développement des tumeurs pulmonaires chez les souris A/J.(A) Conception expérimentale.(B) Grosses tumeurs du poumon dans un modèle de souris.Les tumeurs sont indiquées par des flèches.a : groupe du ginseng rouge chinois.b : groupe A du ginseng rouge coréen.c : groupe de ginseng rouge coréen B. d : groupe de ginseng rouge coréen C. d : groupe témoin.(C) Micrographie lumineuse montrant une tumeur du poumon.Grossissement : 100. b : 400. (D) Charge tumorale dans le groupe d’extrait de ginseng rouge.(E) Niveaux plasmatiques de l’enzyme hépatique ALT.(F) Niveaux plasmatiques de l’enzyme rénale Cr.Les données sont exprimées en moyenne ± écart type.*P <0,05.
Les extraits de ginseng rouge identifiés dans cette étude ont été analysés par spectrométrie de masse tandem par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC-MS/MS) pour quantifier les ginsénosides suivants : Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 et Rg5.Les conditions UPLC et MS utilisées pour mesurer les analytes ont été décrites dans un rapport précédent19.Les chromatogrammes UPLC-MS/MS de quatre extraits de ginseng rouge sont présentés à la figure 2A.Il y avait des différences significatives dans la teneur totale en ginsénosides, la teneur totale en ginsénosides la plus élevée étant dans le CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figure 2B).Lors de l’évaluation des ginsénosides individuels (Figure 2C), le KRGB a montré le niveau le plus élevé de G-Rg3 par rapport aux autres ginsénosides (58,33 ± 3,81 μmol/L pour les G-Rg3 et 41,56 ± 2,88 μmol/L pour le G-Rg3r).L).type ginseng rouge (P < 0,001).G-Rg3 se présente sous la forme d'une paire de stéréoisomères G-Rg3r et G-Rg3, qui diffèrent par la position du groupe hydroxyle au carbone 20 (Fig. 2D).Les résultats indiquent que G-Rg3r ou G-Rg3 peuvent avoir un potentiel anticancéreux important dans un modèle murin de cancer induit par B(a)P.
Teneur en ginsénosides dans divers extraits de ginseng rouge.(A) Chromatogrammes UPLC-MS/MS de quatre extraits de ginseng rouge.(B) Estimation de la teneur totale en ginsénoside dans les extraits indiqués.(C) Détection de ginsénosides individuels dans des extraits marqués.(D) Structures des stéréoisomères de ginsénoside G-Rg3r et G-Rg3s.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de déterminations en triple.***P <0,001.
L’étude UPLC-MS/MS a nécessité la quantification des ginsénosides dans des échantillons intestinaux et sanguins après 20 semaines de traitement.Le traitement par KRGB a montré la présence de seulement 0,0063 ± 0,0005 µg/ml de Rg5 dans le sang.Aucun ginsénosides restants n'a été détecté, ce qui indique une faible biodisponibilité orale et donc une exposition réduite à ces ginsénosides.
La lignée cellulaire d'adénocarcinome du côlon Caco-2 est morphologiquement et biochimiquement similaire aux cellules épithéliales intestinales humaines, démontrant son utilité dans l'évaluation du transport des entérocytes à travers la barrière épithéliale intestinale.Cette analyse était basée sur une étude antérieure 20 .Les figures 3A, B, C, D, E, F montrent des images représentatives du transport transcellulaire de G-Rg3r et G-Rg3 à l'aide d'un modèle monocouche Caco-2.Le transport transcellulaire de G-Rg3r ou G-Rg3 à travers les monocouches de Caco-2, du côté basolatéral au côté apical (Pb-a), était significativement plus élevé que du côté apical au côté basolatéral (Pa-b).Pour G-Rg3r, la valeur moyenne de Pa-b était de 0,38 ± 0,06, qui augmentait à 0,73 ± 0,06 après un traitement avec 50 μmol/L de vérapamil et à 1,14 ± 0,09 après un traitement avec 100 μmol/L de vérapamil (p < 0,01 et 0,001, respectivement ; figure 2).3A).Les observations pour G-Rg3 ont suivi un schéma similaire (Fig. 3B) et les résultats ont montré que le traitement au vérapamil améliorait le transport de G-Rg3r et de G-Rg3.Le traitement au vérapamil a également entraîné une diminution significative des taux d'efflux moyens de Pb-a et G-Rg3r et G-Rg3s (Figure 3C, D, E, F), indiquant que le traitement au vérapamil réduit la teneur en ginsénoside dans les cellules d'efflux Caco-2..
Transport transcellulaire de G-Rg3 dans des monocouches de Caco-2 et absorption intestinale dans un test de perfusion chez le rat.(A) Valeur Pa-b du groupe G-Rg3r dans la monocouche Caco-2.(B) Valeur Pa-b des groupes G-Rg3s dans la monocouche Caco-2.(C) Valeur Pb du groupe G-Rg3r dans la monocouche Caco-2.(D) Valeur Pb des groupes G-Rg3s dans la monocouche Caco-2.(E) Rapport de rendement des groupes G-Rg3r dans une monocouche Caco-2.(F) Rapport de rendement des groupes G-Rg3 dans une monocouche Caco-2.(G) Pourcentage d’absorption intestinale de G-Rg3r dans un test de perfusion chez le rat.(H) Pourcentage d’absorption intestinale de G-Rg3 dans un test de perfusion chez le rat.La perméabilité et l'absorption ont été comparées sans ajout de vérapamil.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de cinq expériences indépendantes.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Conformément à des travaux antérieurs20, une perfusion intestinale orthotopique de rats a été réalisée pour déterminer si l'absorption de G-Rg3 dans l'intestin augmente après un traitement au vérapamil.Les figures 3G, H montrent des tests de perfusion représentatifs pour évaluer le pourcentage d'absorption intestinale de G-Rg3r et G-Rg3 chez des rats modèles de cancer au cours des périodes ci-dessus.Le pourcentage initial de faible absorption de G-Rg3r, d'environ 10 %, a augmenté jusqu'à plus de 20 % après un traitement avec 50 μM de vérapamil et à plus de 25 % après un traitement avec 100 μM de vérapamil.De même, G-Rg3, qui présentait une absorption initiale de 10 %, a également montré un pic de plus de 20 % après un traitement avec 50 μM de vérapamil et près de 30 % après un traitement avec 100 μM de vérapamil, ce qui suggère que l'inhibition de la P-gp par le vérapamil augmente. Absorption intestinale du G Rg3 dans un modèle murin de cancer du poumon.
Selon la méthode ci-dessus, les souris modèles de cancer induites par B(a)P ont été divisées au hasard en six groupes, comme le montre la figure 4A.Aucune perte de poids significative ni signe clinique de toxicité n'ont été observés dans le groupe de traitement G-Rg3 par rapport au groupe témoin (données non présentées).Après 20 semaines de traitement, les poumons de chaque souris ont été collectés.La figure 4B montre des tumeurs pulmonaires macroscopiques chez des souris dans les groupes de traitement ci-dessus, et la figure 4C montre une micrographie lumineuse représentative d'une tumeur représentative.Concernant la charge tumorale dans chaque groupe (Fig. 4D), les valeurs pour les souris traitées avec G-Rg3r et G-Rg3 étaient respectivement de 0,75 ± 0,29 mm3 et 0,81 ± 0,30 mm3, tandis que les valeurs pour les souris G traitées avec -Rg3s étaient respectivement de 1,63 ±0,40 mm3.souris témoins (p <0,001), indiquant que le traitement par G-Rg3 réduisait la charge tumorale chez la souris.L'administration de vérapamil a encore renforcé cette réduction : les valeurs chez les souris vérapamil+ G-Rg3r ont diminué de 0,75 ± 0,29 mm3 à 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), et les valeurs pour vérapamil+ de 0,81 ± 0,30 mm3 ont diminué à 0,29 ± 0,21. mm3 chez les souris traitées au G. -Rg3s (p < 0,05), ce qui indique que le vérapamil peut renforcer l'effet inhibiteur du G-Rg3 sur la tumorigenèse.La charge tumorale n'a montré aucune différence significative entre le groupe témoin et le groupe vérapamil, le groupe G-Rg3r et le groupe G-Rg3s, et le groupe vérapamil + G-Rg3r et le groupe vérapamil + G-Rg3s.De plus, aucune toxicité hépatique ou rénale significative n’a été associée aux traitements évalués (Figure 4E, F).
Charge tumorale après traitement par G-Rg3 et taux plasmatiques ou intestinaux de G-Rg3r et G-Rg3 dans les groupes indiqués.(A) Conception expérimentale.(B) Tumeurs macroscopiques dans un modèle de souris.Les tumeurs sont indiquées par des flèches.a : G-Rg3r.b : G-Rg3.c : G-Rg3r en association avec le vérapamil.d : G-Rg3 en association avec le vérapamil.d : Vérapamil.e : contrôle.(C) Micrographie optique de la tumeur au grossissement.Réponse : 100x.b : 400X.(D) Effet du traitement G-Rg3 + vérapamil sur la charge tumorale chez les souris A/J.(E) Niveaux plasmatiques de l’enzyme hépatique ALT.(F) Niveaux plasmatiques de l’enzyme rénale Cr.(G) Niveaux plasmatiques de G-Rg3r ou G-Rg3 des groupes indiqués.(H) Niveaux de G-Rg3r ou G-Rg3 dans les intestins des groupes indiqués.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de déterminations en triple.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Les niveaux de G-Rg3 chez les souris modèles de cancer induits par B (a) P ont été évalués par UPLC-MS / MS après une période de traitement de 20 semaines selon la méthode décrite dans la section Méthodes.Les figures 4G et H montrent respectivement les taux plasmatiques et intestinaux de G-Rg3.Les taux plasmatiques de G-Rg3r étaient de 0,44 ± 0,32 μmol/L et ont augmenté jusqu'à 1,17 ± 0,47 μmol/L avec l'administration concomitante de vérapamil (p < 0,001), tandis que les taux intestinaux de G-Rg3r étaient de 0,53 ± 0,08 µg/l.Lorsqu'il est associé au vérapamil, g a augmenté jusqu'à 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Pour le G-Rg3, les résultats ont suivi une tendance similaire, indiquant que le traitement au vérapamil a augmenté la biodisponibilité orale du G-Rg3 chez les souris A/J.
Un test de viabilité cellulaire a été utilisé pour évaluer la cytotoxicité de B (a) P et G-Rg3 sur les cellules hEL.La cytotoxicité induite par B(a)P dans les cellules hEL est présentée sur la figure 5A, tandis que les propriétés non toxiques de G-Rg3r et G-Rg3 sont présentées sur les figures 5A et 5B.5B, C. Pour évaluer l'effet cytoprotecteur du G-Rg3, B (a) P a été co-administré avec diverses concentrations de G-Rg3r ou de G-Rg3 dans des cellules hEL.Comme le montre la figure 5D, G-Rg3r à des concentrations de 5 μM, 10 μM et 20 μM ont restauré la viabilité cellulaire à 58,3 %, 79,3 % et 77,3 %, respectivement.Des résultats similaires peuvent également être observés dans le groupe G-Rg3s.Lorsque les concentrations de G-Rg3 étaient de 5 µM, 10 µM et 20 µM, la viabilité cellulaire a été restaurée à 58,3 %, 72,7 % et 76,7 %, respectivement (Figure 5E).).La présence d'adduits BPDE-ADN a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA.Nos résultats ont montré que les niveaux d'adduits BPDE-ADN étaient augmentés dans le groupe traité par B(a)P par rapport au groupe témoin, mais par rapport au co-traitement G-Rg3, les niveaux d'adduits BPDE-ADN dans le groupe B(a)P B dans le groupe traité, les niveaux d’adduits à l’ADN étaient considérablement réduits.Les résultats du traitement avec B(a)P seul sont présentés sur la figure 5F (1,87 ± 0,33 contre 3,77 ± 0,42 pour G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 contre 3,77 ± 0,42 pour G -Rg3s, p < 0,001).
Viabilité cellulaire et formation d'adduits BPDE-ADN dans les cellules hEL traitées avec G-Rg3 et B(a)P.(A) Viabilité des cellules hEL traitées avec B(a)P.(B) Viabilité des cellules hEL traitées avec G-Rg3r.(C) Viabilité des cellules hEL traitées avec G-Rg3.(D) Viabilité des cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3r.(E) Viabilité des cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.(F) Niveaux d’adduit BPDE-ADN dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de déterminations en triple.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
L'expression de l'enzyme GST a été détectée après co-traitement avec 10 μM de B (a) P et 10 μM de G-Rg3r ou G-Rg3.Nos résultats ont montré que B(a)P supprimait l'expression de la GST (59,7 ± 8,2 % dans le groupe G-Rg3r et 39 ± 4,5 % dans le groupe G-Rg3s), et que B(a)P était associé à G-Rg3r. , ou avec G-Rg3r, ou avec G-Rg3r.Le co-traitement avec les G-Rg3 a restauré l'expression de la GST.Expression de la GST (103,7 ± 15,5 % dans le groupe G-Rg3r et 110 ± 11,1 % dans le groupe G-Rg3s, p < 0,05 et p < 0,001, respectivement, Fig. 6A, B et C).L'activité de la GST a été évaluée à l'aide d'un kit de test d'activité.Nos résultats ont montré que le groupe de traitement combiné présentait une activité GST plus élevée que le groupe B(a)P uniquement (96,3 ± 6,6 % contre 35,7 ± 7,8 % dans le groupe G-Rg3r contre 92,3 ± 6,5 dans le groupe G-Rg3r. ).% vs 35,7 ± 7,8 % dans le groupe G-Rg3s, p < 0,001, Figure 6D).
Expression de GST et Nrf2 dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.(A) Détection de l’expression de la GST par Western blot.(B) Expression quantitative de la GST dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3r.(C) Expression quantitative de la GST dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.(D) Activité GST dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.(E) Détection de l’expression de Nrf2 par Western blot.(F) Expression quantitative de Nrf2 dans des cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3r.(G) Expression quantitative de Nrf2 dans des cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de déterminations en triple.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Pour élucider les voies impliquées dans la suppression médiée par G-Rg3 de la tumorigenèse induite par B (a) P, l'expression de Nrf2 a été évaluée par Western blot.Comme le montrent les figures 6E, F, G, par rapport au groupe témoin, seul le niveau de Nrf2 dans le groupe de traitement B(a)P a diminué ;cependant, par rapport au groupe de traitement B(a)P, les taux de B(a) Nrf2 dans le groupe PG-Rg3 ont augmenté (106 ± 9,5 % pour G-Rg3r contre 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6,2 % pour G-Rg3r contre 41 ± 9,8 % pour les G-Rg3, p < 0,01).
Nous avons confirmé le rôle préventif de Nrf2 en supprimant l'expression de Nrf2 à l'aide de petits ARN interférents spécifiques (siRNA).L'inactivation de Nrf2 a été confirmée par Western blot (Fig. 7A, B).Comme le montrent les figures 7C, D, le co-traitement des cellules hEL avec B(a)P et G-Rg3 a entraîné une diminution du nombre d'adduits BPDE-ADN (1,47 ± 0,21) par rapport au traitement avec B(a)P. seul dans le groupe siARN témoin.) G-Rg3r était de 4,13 ± 0,49, G-Rg3s était de 1,8 ± 0,32 et 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Cependant, l’effet inhibiteur du G-Rg3 sur la formation de BPDE-ADN a été aboli par l’inactivation de Nrf2.Dans le groupe siNrf2, il n'y avait pas de différence significative dans la formation d'adduits BPDE-ADN entre le co-traitement B(a)P et G-Rg3 et le traitement B(a)P seul (3,0 ± 0,21 pour G-Rg3r contre 3,56 ± 0,32). ).pour G-Rg3r versus 3,6 pour G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Effet de l'inactivation de Nrf2 sur la formation d'adduits BPDE-ADN dans les cellules hEL.(A) Le renversement de Nrf2 a été confirmé par Western blot.(B) Quantification de l’intensité de la bande Nrf2.(C) Effet de l’inactivation de Nrf2 sur les niveaux d’adduits BPDE-ADN dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3r.(D) Effet de l’inactivation de Nrf2 sur les niveaux d’adduits BPDE-ADN dans les cellules hEL traitées avec B(a)P et G-Rg3.Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type de déterminations en triple.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Cette étude a évalué les effets préventifs de divers extraits de ginseng rouge sur un modèle murin de cancer du poumon induit par le B(a)P, et le traitement par KRGB a réduit de manière significative la charge tumorale.Considérant que le G-Rg3 a la teneur la plus élevée dans cet extrait de ginseng, le rôle important de ce ginsénoside dans l'inhibition de la tumorigenèse a été étudié.G-Rg3r et G-Rg3 (deux épimères de G-Rg3) ont tous deux réduit de manière significative la charge tumorale dans un modèle murin de cancer induit par B(a)P.G-Rg3r et G-Rg3 exercent des effets anticancéreux en induisant l'apoptose des cellules tumorales21, en inhibant la croissance tumorale22, en arrêtant le cycle cellulaire23 et en affectant l'angiogenèse24.Il a également été démontré que le G-Rg3 inhibe les métastases cellulaires25, et sa capacité à renforcer les effets de la chimiothérapie et de la radiothérapie a été documentée26,27.Poon et al. ont démontré que le traitement par G-Rg3 pouvait réduire les effets génotoxiques du B(a)P28.Cette étude démontre le potentiel thérapeutique du G-Rg3 pour cibler les molécules cancérigènes environnementales et prévenir le cancer.
Malgré leur bon potentiel prophylactique, la faible biodisponibilité orale des ginsénosides pose un défi pour l’utilisation clinique de ces molécules.L'analyse pharmacocinétique de l'administration orale de ginsénosides chez le rat a montré que sa biodisponibilité est toujours inférieure à 5 %29.Ces tests ont montré qu’après une période de traitement de 20 semaines, seuls les taux sanguins de Rg5 diminuaient.Bien que le mécanisme sous-jacent à cette faible biodisponibilité reste à élucider, la P-gp serait impliquée dans l’efflux des ginsénosides.Ce travail a démontré pour la première fois que l'administration de vérapamil, un bloqueur de la P-gp, augmente la biodisponibilité orale du G-Rg3r et des G-Rg3.Ainsi, cette découverte suggère que G-Rg3r et G-Rg3 agissent comme substrats de la P-gp pour réguler son efflux.
Ce travail démontre qu'un traitement combiné avec le vérapamil augmente la biodisponibilité orale du G-Rg3 dans un modèle murin de cancer du poumon.Cette découverte est étayée par une augmentation du transport transcellulaire intestinal de G-Rg3 lors du blocage de la P-gp, augmentant ainsi son absorption.Les analyses sur les cellules Caco2 ont montré que le traitement au vérapamil réduisait l'efflux de G-Rg3r et de G-Rg3 tout en améliorant la perméabilité membranaire.Une étude de Yang et al.Des études ont montré que le traitement par la cyclosporine A (un autre bloqueur de la P-gp) augmente la biodisponibilité du ginsénoside Rh2 d'une valeur de base de 1 %20 à plus de 30 %.Les composés de ginsénosides K et Rg1 ont également montré des résultats similaires30,31.Lorsque le vérapamil et la cyclosporine A étaient co-administrés, l’efflux du composé K dans les cellules Caco-2 était significativement réduit, passant de 26,6 à moins de 3, tandis que ses niveaux intracellulaires augmentaient de 40 fois30.En présence de vérapamil, les taux de Rg1 ont augmenté dans les cellules épithéliales du poumon de rat, suggérant un rôle de la P-gp dans l'efflux de ginsénoside, comme l'ont montré Meng et al.31.Cependant, le vérapamil n'a pas eu le même effet sur l'efflux de certains ginsénosides (tels que Rg1, F1, Rh1 et Re), ce qui indique qu'ils ne sont pas affectés par les substrats de la P-gp, comme l'ont montré Liang et al.32 .Cette observation peut être liée à l'implication d'autres transporteurs et de structures alternatives de ginsénoside.
Le mécanisme de l’effet préventif du G-Rg3 sur le cancer n’est pas clair.Des études antérieures ont montré que le G-Rg3 prévient les dommages à l'ADN et l'apoptose en réduisant le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui pourrait être le mécanisme sous-jacent à la prévention de la tumorigenèse induite par le B(a)P.Certains rapports indiquent que la génotoxicité induite par le B(a)P peut être réduite en modulant les enzymes de phase II pour former du BPDE-ADN34.La GST est une enzyme typique de phase II qui inhibe la formation d'adduits BPDE-ADN en favorisant la liaison du GSH au BPDE, réduisant ainsi les dommages à l'ADN induits par B(a)P35.Nos résultats montrent que le traitement par G-Rg3 réduit la cytotoxicité induite par le B(a)P et la formation d'adduits BPDE-ADN dans les cellules hEL et rétablit l'expression et l'activité de la GST in vitro.Cependant, ces effets étaient absents en l’absence de Nrf2, ce qui suggère que G-Rg3 induit des effets cytoprotecteurs via la voie Nrf2.Nrf2 est un facteur de transcription majeur pour les enzymes de détoxification de phase II qui favorise l'élimination des xénobiotiques36.L'activation de la voie Nrf2 induit une cytoprotection et réduit les dommages tissulaires37.De plus, plusieurs rapports ont soutenu le rôle de Nrf2 en tant que suppresseur de tumeur dans la carcinogenèse .Notre étude montre que l'induction de la voie Nrf2 par G-Rg3 joue un rôle régulateur important dans la génotoxicité induite par le B(a)P en provoquant une détoxification du B(a)P en activant les enzymes de phase II, inhibant ainsi le processus de tumorigenèse.
Nos travaux révèlent le potentiel du ginseng rouge dans la prévention du cancer du poumon induit par le B(a)P chez la souris grâce à l'implication importante du ginsénoside G-Rg3.La faible biodisponibilité orale de cette molécule freine son application clinique.Cependant, cette étude montre pour la première fois que le G-Rg3 est un substrat de la P-gp et que l'administration d'un inhibiteur de la P-gp augmente la biodisponibilité du G-Rg3 in vitro et in vivo.Le G-Rg3 réduit la cytotoxicité induite par le B(a)P en régulant la voie Nrf2, ce qui pourrait constituer un mécanisme potentiel pour sa fonction préventive.Notre étude confirme le potentiel du ginsénoside G-Rg3 pour la prévention et le traitement du cancer du poumon.
Des souris A/J femelles de six semaines (20 ± 1 g) et des rats Wistar mâles de 7 semaines (250 ± 20 g) ont été obtenus auprès du laboratoire Jackson (Bar Harbor, États-Unis) et de l'Institut de zoologie de Wuhan.Université (Wuhan, Chine).Le Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, Chine) nous a fourni des cellules Caco-2 et hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) est une source de B(a)P et de tricaprine.Les ginsénosides purifiés G-Rg3r et G-Rg3, le diméthylsulfoxyde (DMSO), le kit de test de prolifération CellTiter-96 (MTS), le vérapamil, le milieu essentiel minimal (MEM) et le sérum fœtal bovin (FBS) ont été achetés auprès de Chengdu Must Bio-Technology. .Co., Ltd.(Chengdu, Chine).Le mini kit QIAamp DNA et le kit ELISA d'adduit BPDE-ADN ont été achetés auprès de Qiagen (Stanford, CA, USA) et Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).Le kit de test d'activité GST et le kit de test de protéines totales (méthode BCA standard) ont été achetés auprès de Solarbio (Beijing, Chine).Tous les extraits de ginseng rouge sont stockés dans le laboratoire Mingyu 7. L'Université baptiste de Hong Kong (Hong Kong, Chine) et le Korea Cancer Center (Séoul, Corée) sont des sources commerciales d'extrait de CRG et de divers extraits de ginseng rouge de diverses origines coréennes (y compris KRGA, KRGB). et KRGC).Le ginseng rouge est fabriqué à partir de racines de ginseng frais âgées de 6 ans.L'extrait de ginseng rouge est obtenu en lavant le ginseng avec de l'eau trois fois, puis en concentrant l'extrait aqueux et enfin en le séchant à basse température pour obtenir de la poudre d'extrait de ginseng.Les anticorps (anti-Nrf2, anti-GST et β-actine), l'immunoglobuline G (IgG) anti-lapin conjuguée à la peroxydase de raifort, le réactif de transfection, le siARN témoin et le siARN Nrf2 ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californie) .), ETATS-UNIS).
Les cellules Caco2 et hEL ont été cultivées dans des boîtes de culture cellulaire de 100 mm2 avec du MEM contenant 10 % de FBS à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.Pour déterminer l'effet des conditions de traitement, les cellules hEL ont été incubées avec différentes concentrations de B (a) P et G-Rg3 dans du MEM pendant 48 h.Les cellules peuvent être analysées ou collectées pour préparer des extraits acellulaires.
Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d'éthique des animaux expérimentaux du Tongji Medical College de l'Université des sciences et technologies de Huazhong (approbation n° 2019 ; enregistrement n° 4587TH).Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur, et l'étude a été menée conformément aux directives Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Des souris A/J âgées de huit semaines ont d'abord reçu une injection intrapéritonéale de B(a)P dans une solution de tricaprine (100 mg/kg, 0,2 ml).Après une semaine, les souris ont été divisées au hasard en groupes témoins et en différents groupes de traitement, 15 souris dans chaque groupe, et gavées une fois par jour.Après 20 semaines de traitement, les animaux ont été sacrifiés par asphyxie au CO2.Les poumons ont été collectés et fixés pendant 24 heures.Le nombre de tumeurs superficielles et la taille des tumeurs individuelles ont été quantifiés pour chaque poumon au microscope à dissection.Les estimations du volume de la tumeur (V) ont été calculées à l'aide de l'expression suivante : V (mm3) = 4/3πr3, où r est le diamètre de la tumeur.La somme nette de tous les volumes tumoraux dans les poumons des souris représentait le volume tumoral total, et le volume tumoral total moyen dans chaque groupe représentait la charge tumorale.Des échantillons de sang total et d'intestins ont été collectés et conservés à -80 ° C pour la détermination UPLC-MS/MS.Le sérum a été collecté et un analyseur chimique automatisé a été utilisé pour analyser les taux d'alanine aminotransférase (ALT) et de créatinine sérique (Cr) afin d'évaluer la fonction hépatique et rénale.
Les échantillons collectés ont été retirés de l'entrepôt frigorifique, décongelés, pesés et placés dans des tubes comme décrit ci-dessus.On y a ajouté 0,5 µM de phlorizine (étalon interne) dans 0,8 ml de solution de méthanol.Le tissu a ensuite été homogénéisé à l'aide de Tissue-Tearor et l'homogénat a ensuite été transféré dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.Le mélange a été centrifugé à 15 500 tr/min pendant 15 minutes.Après avoir retiré 1,0 ml de surnageant, sécher à l'azote.Deux cents microlitres de méthanol ont été utilisés pour la récupération.Le sang est collecté et traité sur une seule ligne et sert de référence pour toutes les mesures.
Des plaques Transwell à 24 puits ont été ensemencées avec 1,0 × 105 cellules Caco-2 par puits pour évaluer l'amélioration potentielle du transport G-Rg3 par l'ajout de vérapamil.Après 3 semaines de culture, les cellules ont été lavées avec du HBSS et préincubées à 37°C.400 μL de G-Rg3 10 μM (G-Rg3r, G-Rg3s ou un mélange avec 50 ou 100 μM de vérapamil) ont été injectés sur la face basolatérale ou apicale de la monocouche, et 600 μL de solution HBSS ont été ajoutés à l'autre. côté.Recueillir 100 µl de milieu de culture aux instants désignés (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) et ajouter 100 µl de HBSS pour compléter ce volume.Les échantillons ont été conservés à -4 ° C jusqu'à leur détection par UPLC-MS/MS.L'expression Papp = dQ/(dT × A × C0) est utilisée pour quantifier la perméabilité apparente unidirectionnelle apicale et basolatérale et vice versa (Pa-b et Pb-a, respectivement) ;dQ/dT est le changement de concentration, A (0,6 cm2) est la surface de la monocouche et C0 est la concentration initiale du donneur.Le rapport d'efflux est calculé en Pb-a/Pa-b, ce qui représente le taux d'efflux du médicament à l'étude.
Les rats Wistar mâles ont été mis à jeun pendant 24 heures, ont bu uniquement de l'eau et ont été anesthésiés avec une injection intraveineuse d'une solution de pentobarbital à 3,5 %.Le tube en silicone intubé a l’extrémité du duodénum comme entrée et l’extrémité de l’iléon comme sortie.Utilisez une pompe péristaltique pour pomper l’entrée avec 10 µM G-Rg3r ou G-Rg3s en HBSS isotonique à un débit de 0,1 ml/min.L'effet du vérapamil a été évalué en ajoutant 50 μM ou 100 μM du composé à 10 μM de G-Rg3r ou de G-Rg3.UPLC-MS/MS a été réalisée sur des extraits de perfusion collectés à des moments 60, 90, 120 et 150 minutes après le début de la perfusion.Le pourcentage d'absorption est quantifié par la formule % absorption = (1 – Cout/Cin) × 100 % ;la concentration de G-Rg3 en sortie et en entrée est exprimée respectivement par Cout et Cin.
Les cellules hEL ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 104 cellules par puits et traitées avec du B (a) P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ou du G-Rg3 dissous dans du DMSO. .Les médicaments ont ensuite été dilués avec du milieu de culture à différentes concentrations (0, 1, 2, 5, 10, 20 µM) sur 48 heures.À l’aide d’un kit de test MTS disponible dans le commerce, les cellules ont été soumises à un protocole standard puis mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques à 490 nm.Le niveau de viabilité cellulaire des groupes co-traités avec B (a) P (10 μM) et G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) a été évalué selon la méthode ci-dessus et comparé au groupe non traité.
Les cellules hEL ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 × 105 cellules / puits et traitées avec 10 μMB (a) P en présence ou en l'absence de 10 μM de G-Rg3.Après 48 heures de traitement, l'ADN a été extrait des cellules hEL à l'aide du QIAamp DNA Mini Kit selon le protocole du fabricant.La formation d’adduits BPDE-ADN a été détectée à l’aide d’un kit ELISA d’adduits BPDE-ADN.Les niveaux relatifs d'adduit BPDE-ADN ont été mesurés à l'aide d'un lecteur de microplaques en mesurant l'absorbance à 450 nm.
Les cellules hEL ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 104 cellules par puits et traitées avec 10 μMB (a) P en l'absence ou en présence de 10 μM de G-Rg3 pendant 48 h.L'activité GST a été mesurée à l'aide d'un kit de test d'activité GST commercial selon le protocole du fabricant.L'activation relative de la GST a été mesurée par absorbance à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
Les cellules hEL ont été lavées avec du PBS glacé, puis lysées à l'aide d'un tampon de test de radioimmunoprécipitation contenant des inhibiteurs de protéase et des inhibiteurs de phosphatase.Après quantification des protéines à l'aide d'un kit d'analyse de protéines totales, 30 µg de protéines dans chaque échantillon ont été séparés par SDS-PAGE à 12 % et transférés sur une membrane PVDF par électrophorèse.Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % et incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4°C.Après incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort, des réactifs de chimiluminescence améliorés ont été ajoutés pour visualiser le signal de liaison.L'intensité de chaque bande protéique a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ.
Le logiciel GraphPad Prism 7.0 a été utilisé pour analyser toutes les données, exprimées en moyenne ± écart type.La variation entre les groupes de traitement a été évaluée à l'aide du test t de Student ou d'une analyse de variance unidirectionnelle, avec une valeur P <0,05 indiquant une signification statistique.
Toutes les données obtenues ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et dans les fichiers d'informations supplémentaires.
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Heure de publication : 17 septembre 2023