Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter mellores resultados, recomendamos utilizar unha versión máis recente do seu navegador (ou desactivar o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilo nin JavaScript.
O ginseng vermello úsase na medicina tradicional asiática durante centos de anos.Neste estudo, avaliamos a capacidade de catro tipos de ginseng vermello (ginseng vermello chinés, ginseng vermello coreano A, ginseng vermello coreano B e ginseng vermello coreano C) cultivados en diferentes rexións para inhibir a formación e crecemento do pulmón inducido por carcinóxenos. tumores.Realizouse unha proba de benzo(a)pireno (B(a)P) en ratos A/J, e descubriuse que o ginseng vermello coreano B era o máis eficaz para reducir a carga tumoral entre as catro variedades de ginseng vermello.Ademais, analizamos o contido de varios ginsenósidos (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Rg5) en catro extractos de ginseng vermello e descubrimos que o ginseng vermello coreano B tiña os niveis máis altos de ginsenósido Rg3 (G-Rg3), o que suxire que G-Rg3 pode desempeñar un papel importante na súa eficacia terapéutica.Este traballo mostra que o G-Rg3 ten unha biodisponibilidade relativamente baixa.Non obstante, cando G-Rg3 foi coadministrado co inhibidor de P-gp verapamilo, o efluxo de G-Rg3 ás células Caco-2 diminuíu, a taxa de absorción intestinal de G-Rg3 aumentou nun modelo de rata e G-Rg3. incrementouse.Nas células Caco-2, a saída de Rg3 diminúe e o nivel de concentración de Rg3 diminúe.G-Rg3 aumenta no intestino e no plasma, e a súa capacidade de previr tumores tamén se mellora nun modelo de rata de tumorigénesis inducida por B(a)P.Tamén descubrimos que G-Rg3 reduciu a citotoxicidade inducida por B(a)P e a formación de aductos de ADN nas células pulmonares humanas, e restableceu a expresión e actividade dos encimas da fase II a través da vía Nrf2, o que pode estar relacionado co posible mecanismo de acción. da inhibición de G -Rg3..Sobre a aparición de tumores pulmonares.O noso estudo demostra un papel potencialmente importante para G-Rg3 no obxectivo de tumores pulmonares en modelos de rato.A biodisponibilidade oral deste ginsenósido mellora ao dirixirse á glicoproteína P, o que permite que a molécula exercer efectos anticanceríxenos.
O tipo máis común de cancro de pulmón é o cancro de pulmón de células non pequenas (NSCLC), que é unha das principais causas de morte por cancro en China e América do Norte1,2.O principal factor que aumenta o risco de desenvolver cancro de pulmón de células non pequenas é o tabaquismo.O fume do cigarro contén máis de 60 axentes canceríxenos, incluíndo benzo(a)pireno (B(a)P), nitrosaminas e isótopos radioactivos procedentes da descomposición do radón.3 Os hidrocarburos aromáticos policíclicos B(a)P son a principal causa de toxicidade no cigarro. fume.Tras a exposición a B(a)P, o citocromo P450 convérteo en B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido (BPDE), que reacciona co ADN para formar o aducto BPDE-ADN 4. Ademais, estes os aductos inducen a tumorigénesis pulmonar en ratos con estadio tumoral e histopatoloxía semellante aos tumores pulmonares humanos5.Esta característica fai do modelo de cancro de pulmón inducido por B(a)P un sistema axeitado para avaliar compostos con posibles propiedades anticancerígenas.
Unha posible estratexia para previr o desenvolvemento de cancro de pulmón en grupos de alto risco, especialmente fumadores, é o uso de axentes quimiopreventivos para suprimir o desenvolvemento de lesións neoplásicas intraepiteliais e evitar así a súa posterior progresión cara a malignidade.Os estudos en animais mostran que diversos axentes quimiopreventivos son eficaces6.O noso informe anterior7 destacou os bos efectos preventivos do ginseng vermello sobre o cancro de pulmón.Esta herba utilizouse durante séculos na medicina tradicional asiática para prolongar a vida e a saúde, e está documentado que ten efectos antitumorales8.
O factor activo do ginseng é o ginsenósido, que se usa como marcador composto para avaliar a calidade dos extractos de ginseng.A análise cuantitativa dos extractos de ginseng bruto normalmente implica o uso de varios ginsenósidos, incluíndo RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 e Rc9,10.Os ginsenósidos teñen pouco uso clínico debido á súa moi pobre biodisponibilidade oral11.Aínda que o mecanismo desta escasa biodisponibilidade non está claro, a causa pode ser a saída de ginsenósidos causada pola glicoproteína P (P-gp)12.P-gp é un dos transportadores de efluxo máis importantes da superfamilia de transportadores de casetes de unión ao ATP, que utiliza a enerxía da hidrólise do ATP para liberar substancias intracelulares ao medio externo.Os transportadores de P-gp adoitan estar amplamente distribuídos no intestino, os riles, o fígado e a barreira hematoencefálica13.P-gp xoga un papel crítico na absorción intestinal, e a inhibición da P-gp aumenta a absorción oral e a dispoñibilidade dalgúns fármacos contra o cancro12,14.Exemplos de inhibidores usados anteriormente na literatura son o verapamilo e a ciclosporina A15.Este traballo implica establecer un sistema de rato para estudar o cancro de pulmón inducido por B(a)P para avaliar a capacidade de diferentes extractos de ginseng vermello de China e Corea para afectar as neoplasias malignas.Os extractos foron analizados individualmente para identificar ginsenósidos específicos que poden afectar a carcinoxénese.Despois utilizouse o verapamilo para dirixir a P-gp e mellorar a biodisponibilidade oral e a eficacia terapéutica dos ginsenósidos contra o cancro.
Non está claro o mecanismo polo cal as saponinas de ginseng exercen efectos terapéuticos sobre a carcinoxénese.As investigacións demostraron que varios ginsenósidos poden reducir o dano no ADN causado por axentes canceríxenos reducindo o estrés oxidativo e activando os encimas de desintoxicación da fase II, evitando así o dano celular.A glutatión S-transferase (GST) é un encima típico da fase II que se require para reducir o dano no ADN causado por axentes canceríxenos17.O factor 2 relacionado co eritroide nuclear 2 (Nrf2) é un importante factor de transcrición que regula a homeostase redox e activa a expresión dos encimas da fase II e as respostas antioxidantes citoprotectoras18.O noso estudo tamén examinou os efectos dos ginsenósidos identificados na redución da citotoxicidade inducida por B(a)P e na formación de adutos de BPDE-ADN, así como na indución de encimas da fase II modulando a vía Nrf2 nas células pulmonares normais.
O establecemento dun modelo de rato de cancro inducido por B(a)P é consistente co traballo anterior5.A figura 1A mostra o deseño experimental dun tratamento de 20 semanas dun modelo de cancro de rato inducido por B(a)P, auga (control), extracto de ginseng vermello chinés (CRG), extracto de ginseng vermello coreano A (KRGA) e vermello coreano. ginseng.Extracto B (KRGB) e Extracto C de ginseng vermello coreano (KRGC).Despois de 20 semanas de tratamento con ginseng vermello, os ratos foron sacrificados por asfixia por CO2.A figura 1B mostra tumores pulmonares macroscópicos en animais tratados con diferentes tipos de ginseng vermello, e a figura 1C mostra unha micrografía de luz representativa dunha mostra de tumor.A carga tumoral dos animais tratados con KRGB (1,5 ± 0,35) foi menor que a dos animais control (0,82 ± 0,2, P <0,05), como se mostra na Figura 1D.O grao medio de inhibición da carga tumoral foi do 45%.Outros extractos de ginseng vermello probados non mostraron cambios tan significativos na carga do tumor (P > 0,05).Non se observaron efectos secundarios obvios no modelo de rato durante 20 semanas de tratamento con ginseng vermello, incluíndo ningún cambio no peso corporal (datos non mostrados) e ningunha toxicidade hepática ou renal (Figura 1E, F).
O extracto de ginseng vermello trata o desenvolvemento de tumores pulmonares en ratos A/J.(A) Deseño experimental.(B) Tumores pulmonares grandes nun modelo de rato.Os tumores indícanse mediante frechas.a: grupo de ginseng vermello chinés.b: grupo A de ginseng vermello coreano.c: ginseng vermello coreano grupo B. d: ginseng vermello coreano grupo C. d: grupo control.(C) Micrografía luminosa que mostra un tumor pulmonar.Aumento: 100. b: 400. (D) Carga tumoral no grupo do extracto de ginseng vermello.(E) Niveis plasmáticos da enzima hepática ALT.(F) Niveis plasmáticos da enzima renal Cr.Os datos exprésanse como media ± desviación estándar.*P <0,05.
Os extractos de ginseng vermello identificados neste estudo foron analizados mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de ultra-performance (UPLC-MS/MS) para cuantificar os seguintes ginsenósidos: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Rg5.As condicións UPLC e MS utilizadas para medir os analitos foron descritas nun informe anterior19.Os cromatogramas UPLC-MS/MS de catro extractos de ginseng vermello móstranse na Figura 2A.Houbo diferenzas significativas no contido total de ginsenósido, co contido máis alto de ginsenósido total en CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figura 2B).Ao avaliar os ginsenósidos individuais (Figura 2C), KRGB mostrou o nivel máis alto de G-Rg3 en comparación con outros ginsenósidos (58,33 ± 3,81 μmol/L para G-Rg3s e 41,56 ± 2,88 μmol/L para G-Rg3r).L).tipo de ginseng vermello (P < 0,001).G-Rg3 ocorre como un par de estereoisómeros G-Rg3r e G-Rg3s, que difiren na posición do grupo hidroxilo no carbono 20 (Fig. 2D).Os resultados indican que G-Rg3r ou G-Rg3 poden ter un importante potencial contra o cancro nun modelo de rato cancro inducido por B(a)P.
Contido de ginsenósidos en varios extractos de ginseng vermello.(A) Cromatogramas UPLC-MS/MS de catro extractos de ginseng vermello.(B) Estimación do contido total de ginsenósido nos extractos indicados.(C) Detección de ginsenósidos individuais en extractos marcados.(D) Estruturas dos estereoisómeros de ginsenósidos G-Rg3r e G-Rg3s.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar das determinacións por triplicado.***P <0,001.
O estudo UPLC-MS/MS requiriu a cuantificación de ginsenósidos en mostras intestinais e de sangue despois de 20 semanas de tratamento.O tratamento con KRGB mostrou a presenza de só 0,0063 ± 0,0005 μg/ml de Rg5 no sangue.Non se detectaron ginsenósidos restantes, o que indica unha biodisponibilidade oral deficiente e, polo tanto, unha exposición reducida a estes ginsenósidos.
A liña celular de adenocarcinoma de colon Caco-2 é morfolóxica e bioquímicamente similar ás células epiteliais intestinais humanas, demostrando a súa utilidade para avaliar o transporte de enterocitos a través da barreira epitelial intestinal.Esta análise baseouse nun estudo anterior 20 .As figuras 3A,B,C,D,E,F mostran imaxes representativas do transporte transcelular de G-Rg3r e G-Rg3 usando un modelo de monocapa de Caco-2.O transporte transcelular de G-Rg3r ou G-Rg3 a través das monocapas de Caco-2 desde o lado basolateral ao apical (Pb-a) foi significativamente maior que desde o lado apical ao basolateral (Pa-b).Para G-Rg3r, o valor medio de Pa-b foi de 0,38 ± 0,06, que aumentou a 0,73 ± 0,06 despois do tratamento con 50 μmol/L de verapamilo e a 1,14 ± 0,09 despois do tratamento con 100 μmol/L de verapamilo (p < 0,001 e 0,01). respectivamente; Figura 2).3A).As observacións de G-Rg3 seguiron un patrón similar (Fig. 3B), e os resultados mostraron que o tratamento con verapamilo mellorou o transporte de G-Rg3r e G-Rg3.O tratamento con verapamilo tamén deu lugar a unha diminución significativa das relacións medias de saída de Pb-a e G-Rg3r e G-Rg3s (Figura 3C, D, E, F), o que indica que o tratamento con verapamil reduce o contido de ginsenósido nas células de efluxo Caco-2..
Transporte transcelular de G-Rg3 en monocapas de Caco-2 e absorción intestinal nun ensaio de perfusión en ratas.(A) Valor Pa-b do grupo G-Rg3r na monocapa de Caco-2.(B) Valor Pa-b dos grupos G-Rg3s na monocapa de Caco-2.(C) Valor de Pb do grupo G-Rg3r na monocapa de Caco-2.(D) Valor de Pb dos grupos G-Rg3s na monocapa de Caco-2.(E) Relación de rendemento dos grupos G-Rg3r nunha monocapa de Caco-2.(F) Relación de rendemento dos grupos G-Rg3 nunha monocapa de Caco-2.(G) Porcentaxe de absorción intestinal de G-Rg3r nun ensaio de perfusión en ratas.(H) Porcentaxe de absorción intestinal de G-Rg3 nun ensaio de perfusión en ratas.Comparáronse a permeabilidade e a absorción sen a adición de verapamilo.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar de cinco experimentos independentes.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
En consonancia co traballo anterior20, realizouse a perfusión intestinal ortotópica de ratas para determinar se a absorción de G-Rg3 no intestino aumenta despois do tratamento con verapamilo.As figuras 3G, H mostran ensaios de perfusión representativos para avaliar a porcentaxe de absorción intestinal de G-Rg3r e G-Rg3 en ratas modelo de cancro durante os períodos de tempo anteriores.A porcentaxe inicial de captación débil de G-Rg3r de aproximadamente un 10% aumentou a máis do 20% despois do tratamento con verapamilo 50 μM e a máis do 25% despois do tratamento con verapamilo 100 μM.Así mesmo, G-Rg3, que tivo unha captación inicial do 10%, tamén mostrou un pico superior ao 20% despois do tratamento con 50 μM de verapamilo e case un 30% despois do tratamento con 100 μM de verapamilo, o que suxire que a inhibición da P-gp por verapamilo mellora. G-absorción intestinal Rg3 nun modelo de rato de cancro de pulmón.
Segundo o método anterior, os ratos modelo de cancro inducido por B(a)P dividíronse aleatoriamente en seis grupos, como se mostra na Figura 4A.Non se observaron perdas de peso significativas nin signos clínicos de toxicidade no grupo de tratamento con G-Rg3 en comparación co grupo control (datos non mostrados).Despois de 20 semanas de tratamento, recolléronse os pulmóns de cada rato.A Figura 4B mostra tumores pulmonares macroscópicos en ratos dos grupos de tratamento anteriores, e a Figura 4C mostra unha micrografía de luz representativa dun tumor representativo.En canto á carga tumoral en cada grupo (Fig. 4D), os valores dos ratos tratados con G-Rg3r e G-Rg3s foron 0,75 ± 0,29 mm3 e 0,81 ± 0,30 mm3, respectivamente, mentres que os valores dos ratos G tratados con -Rg3s foron 1,63 respectivamente ±0,40 mm3.ratos control (p < 0,001), o que indica que o tratamento con G-Rg3 reduciu a carga tumoral nos ratos.A administración de verapamilo mellorou aínda máis esta redución: os valores dos ratos verapamil+ G-Rg3r diminuíron de 0,75 ± 0,29 mm3 a 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), e os valores de verapamil+ diminuíron de 0,81 ± 0,30 mm3 a 0,30 mm3 ± 0,29 ± 0,29 ± 0,01. mm3 en ratos tratados con G. -Rg3s (p < 0,05), o que indica que o verapamilo pode mellorar o efecto inhibidor de G-Rg3 na tumorigénesis.A carga tumoral non mostrou diferenzas significativas entre o grupo control e o grupo verapamilo, o grupo G-Rg3r e o grupo G-Rg3s, e o grupo verapamilo + G-Rg3r e o grupo verapamilo + G-Rg3s.Ademais, non houbo toxicidades hepáticas ou renais significativas asociadas cos tratamentos avaliados (Figura 4E, F).
Carga tumoral despois do tratamento con G-Rg3 e niveis plasmáticos ou intestinais de G-Rg3r e G-Rg3 nos grupos indicados.(A) Deseño experimental.(B) Tumores macroscópicos nun modelo de rato.Os tumores indícanse mediante frechas.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r en combinación con verapamilo.d: G-Rg3 en combinación con verapamilo.d: Verapamil.e: control.(C) Micrografía óptica do tumor ao aumento.Resposta: 100x.b: 400X.(D) Efecto do tratamento con G-Rg3 + verapamilo sobre a carga tumoral en ratos A/J.(E) Niveis plasmáticos da enzima hepática ALT.(F) Niveis plasmáticos da enzima renal Cr.(G) Niveis plasmáticos de G-Rg3r ou G-Rg3 dos grupos indicados.(H) Niveis de G-Rg3r ou G-Rg3s nos intestinos dos grupos indicados.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar das determinacións por triplicado.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Os niveis de G-Rg3 nos ratos modelo de cancro inducido por B(a)P foron avaliados por UPLC-MS/MS despois dun período de tratamento de 20 semanas segundo o método descrito na sección Métodos.As figuras 4G e H mostran os niveis plasmáticos e intestinais de G-Rg3, respectivamente.Os niveis plasmáticos de G-Rg3r foron de 0,44 ± 0,32 μmol/L e aumentaron a 1,17 ± 0,47 μmol/L coa administración concomitante de verapamilo (p < 0,001), mentres que os niveis intestinais de G-Rg3r foron de 0,53 ± 0,08 μg/l.Cando se combina con verapamilo, g aumentou a 1,35 ± 0,13 μg/g (p <0,001).Para G-Rg3, os resultados seguiron un patrón similar, o que indica que o tratamento con verapamilo aumentou a biodisponibilidade oral de G-Rg3 en ratos A/J.
Utilizouse o ensaio de viabilidade celular para avaliar a citotoxicidade de B(a)P e G-Rg3 en células hEL.A citotoxicidade inducida por B(a)P nas células hEL móstrase na Figura 5A, mentres que as propiedades non tóxicas de G-Rg3r e G-Rg3 móstranse nas Figuras 5A e 5B.5B, C. Para avaliar o efecto citoprotector de G-Rg3, B(a)P foi coadministrado con varias concentracións de G-Rg3r ou G-Rg3 en células hEL.Como se mostra na Figura 5D, G-Rg3r en concentracións de 5 μM, 10 μM e 20 μM restableceu a viabilidade celular ao 58,3%, 79,3% e 77,3%, respectivamente.Tamén se poden ver resultados similares no grupo G-Rg3s.Cando as concentracións de G-Rg3s eran de 5 µM, 10 µM e 20 µM, a viabilidade celular restableceuse ao 58,3%, 72,7% e 76,7%, respectivamente (Figura 5E).).A presenza de aductos BPDE-ADN foi medida mediante un kit ELISA.Os nosos resultados mostraron que os niveis de aducto de BPDE-ADN aumentaron no grupo tratado con B(a)P en comparación co grupo control, pero en comparación co cotratamento con G-Rg3, os niveis de aducto de BPDE-ADN no grupo B(a)P B no grupo tratado, os niveis de aducto de ADN reducíronse significativamente.Os resultados do tratamento con B(a)P só móstranse na Figura 5F (1,87 ± 0,33 fronte a 3,77 ± 0,42 para G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 fronte a 3,77 ± 0,42 para G -Rg3s, p <0,001).
Viabilidade celular e formación de adutos de BPDE-ADN en células hEL tratadas con G-Rg3 e B(a)P.(A) Viabilidade das células hEL tratadas con B (a) P.(B) Viabilidade das células hEL tratadas con G-Rg3r.(C) Viabilidade das células hEL tratadas con G-Rg3.(D) Viabilidade das células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3r.(E) Viabilidade das células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3.(F) Niveis de aduto de BPDE-ADN en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar das determinacións por triplicado.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
A expresión do encima GST detectouse despois do cotratamento con 10 μM de B(a)P e 10 μM de G-Rg3r ou G-Rg3s.Os nosos resultados mostraron que B(a)P suprimiu a expresión de GST (59,7 ± 8,2% no grupo G-Rg3r e 39 ± 4,5% no grupo G-Rg3s), e B(a)P estivo asociado con calquera con G-Rg3r. , ou con G-Rg3r ou con G-Rg3r.O cotratamento con G-Rg3s restableceu a expresión de GST.Expresión GST (103,7 ± 15,5% no grupo G-Rg3r e 110 ± 11,1% no grupo G-Rg3s, p <0,05 e p <0,001, respectivamente, Fig. 6A, B e C).A actividade do GST foi avaliada mediante un kit de ensaio de actividade.Os nosos resultados mostraron que o grupo de tratamento combinado tivo unha actividade GST maior en comparación co grupo B(a)P só (96,3 ± 6,6% fronte ao 35,7 ± 7,8% no grupo G-Rg3r fronte ao 92,3 ± 6,5 no grupo G-Rg3r). ).% vs 35,7 ± 7,8% no grupo G-Rg3s, p <0,001, Figura 6D).
Expresión de GST e Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3.(A) Detección da expresión de GST mediante transferencia Western.(B) Expresión cuantitativa de GST en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3r.(C) Expresión cuantitativa de GST en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3s.(D) Actividade GST en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3.(E) Detección da expresión de Nrf2 mediante transferencia Western.(F) Expresión cuantitativa de Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3r.(G) Expresión cuantitativa de Nrf2 en células hEL tratadas con B(a)P e G-Rg3s.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar das determinacións por triplicado.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Para dilucidar as vías implicadas na supresión mediada por G-Rg3 da tumorigénesis inducida por B(a)P, a expresión de Nrf2 foi avaliada mediante transferencia Western.Como se mostra nas figuras 6E,F,G, en comparación co grupo control, só diminuíu o nivel de Nrf2 no grupo de tratamento con B(a)P;non obstante, en comparación co grupo de tratamento con B(a)P, os niveis de B(a) Nrf2 no grupo PG-Rg3 aumentaron (106 ± 9,5% para G-Rg3r fronte a 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% para G-Rg3r vs 41 ± 9,8% para G-Rg3s, p < 0,01).
Confirmamos o papel preventivo de Nrf2 suprimindo a expresión de Nrf2 mediante un pequeno ARN interferente específico (siRNA).Nrf2 knockdown foi confirmado por Western blot (Fig. 7A, B).Como se mostra nas figuras 7C, D, o cotratamento das células hEL con B(a)P e G-Rg3 deu lugar a unha diminución do número de aductos de BPDE-ADN (1,47 ± 0,21) en comparación co tratamento con B(a)P. só no grupo de siRNA control.) G-Rg3r foi de 4,13 ± 0,49, G-Rg3s foi de 1,8 ± 0,32 e 4,1 ± 0,57, p <0,01).Non obstante, o efecto inhibidor de G-Rg3 sobre a formación de BPDE-ADN foi abolido pola caída de Nrf2.No grupo siNrf2, non houbo diferenzas significativas na formación de adutos de BPDE-ADN entre o cotratamento con B(a)P e G-Rg3 e o tratamento con B(a)P só (3,0 ± 0,21 para G-Rg3r fronte a 3,56 ± 0,32). ).para G-Rg3r fronte a 3,6 para G-Rg3s fronte a ±0,45 fronte a 4,0±0,37, p > 0,05).
Efecto do knockdown de Nrf2 na formación de adutos de BPDE-ADN nas células hEL.(A) A caída de Nrf2 foi confirmada por Western Blotting.(B) Cuantificación da intensidade da banda Nrf2.(C) Efecto da caída de Nrf2 nos niveis de aducto de BPDE-ADN en células hEL tratadas con B (a) P e G-Rg3r.(D) Efecto da caída de Nrf2 nos niveis de aducto de BPDE-ADN en células hEL tratadas con B (a) P e G-Rg3.Os datos exprésanse como a media ± desviación estándar das determinacións por triplicado.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Este estudo avaliou os efectos preventivos de varios extractos de ginseng vermello nun modelo de rato de cancro de pulmón inducido por B(a)P, e o tratamento con KRGB reduciu significativamente a carga do tumor.Tendo en conta que o G-Rg3 ten o maior contido neste extracto de ginseng, estudouse o importante papel deste ginsenósido na inhibición da tumorigénesis.Tanto G-Rg3r como G-Rg3 (dous epímeros de G-Rg3) reduciron significativamente a carga tumoral nun modelo de rato de cancro inducido por B(a)P.G-Rg3r e G-Rg3 exercen efectos contra o cancro ao inducir a apoptose das células tumorais21, inhibindo o crecemento tumoral22, detendo o ciclo celular23 e afectando a anxioxénese24.Tamén se demostrou que G-Rg3 inhibe a metástase celular25, e documentouse a capacidade de G-Rg3 para mellorar os efectos da quimioterapia e a radioterapia26,27.Poon et al demostraron que o tratamento con G-Rg3 podería reducir os efectos xenotóxicos de B(a)P28.Este estudo demostra o potencial terapéutico do G-Rg3 para dirixirse a moléculas canceríxenas ambientais e previr o cancro.
A pesar do seu bo potencial profiláctico, a escasa biodisponibilidade oral dos ginsenósidos supón un desafío para o uso clínico destas moléculas.A análise farmacocinética da administración oral de ginsenósidos en ratas mostrou que a súa biodisponibilidade aínda é inferior ao 5%29.Estas probas mostraron que despois do período de tratamento de 20 semanas, só os niveis sanguíneos de Rg5 diminuíron.Aínda que aínda está por dilucidar o mecanismo subxacente da escasa biodisponibilidade, pénsase que a P-gp está implicada no efluxo de ginsenósidos.Este traballo demostrou por primeira vez que a administración de verapamilo, un bloqueador de P-gp, aumenta a biodisponibilidade oral de G-Rg3r e G-Rg3s.Así, este achado suxire que G-Rg3r e G-Rg3s actúan como substratos da P-gp para regular a súa saída.
Este traballo demostra que o tratamento combinado con verapamilo aumenta a biodisponibilidade oral de G-Rg3 nun modelo de rato de cancro de pulmón.Este achado está apoiado polo aumento do transporte transcelular intestinal de G-Rg3 tras o bloqueo da P-gp, aumentando así a súa absorción.Os ensaios en células Caco2 mostraron que o tratamento con verapamilo reduciu a saída de G-Rg3r e G-Rg3s mentres melloraba a permeabilidade da membrana.Un estudo de Yang et al.Os estudos demostraron que o tratamento con ciclosporina A (outro bloqueador de P-gp) aumenta a biodisponibilidade do ginsenósido Rh2 desde un valor inicial do 1%20 ata máis do 30%.Os compostos de ginsenósidos K e Rg1 tamén mostraron resultados similares30,31.Cando se coadministraron verapamilo e ciclosporina A, o efluxo do composto K nas células Caco-2 reduciuse significativamente de 26,6 a menos de 3, mentres que os seus niveis intracelulares aumentaron 40 veces30.En presenza de verapamilo, os niveis de Rg1 aumentaron nas células epiteliais do pulmón de rata, o que suxire un papel da P-gp no efluxo de ginsenósidos, como mostran Meng et al.31.Non obstante, o verapamilo non tivo o mesmo efecto sobre a saída dalgúns ginsenósidos (como Rg1, F1, Rh1 e Re), o que indica que non se ven afectados polos substratos P-gp, como mostran Liang et al.32 .Esta observación pode estar relacionada coa implicación doutros transportadores e estruturas alternativas de ginsenósidos.
O mecanismo do efecto preventivo do G-Rg3 sobre o cancro non está claro.Estudos anteriores demostraron que o G-Rg3 prevén o dano no ADN e a apoptose ao reducir o estrés oxidativo e a inflamación16,33, que pode ser o mecanismo subxacente para previr a tumorigénesis inducida por B(a)P.Algúns informes indican que a xenotoxicidade inducida por B(a)P pode reducirse modulando os encimas da fase II para formar BPDE-DNA34.O GST é un encima típico de fase II que inhibe a formación de adutos de BPDE-ADN promovendo a unión de GSH a BPDE, reducindo así o dano no ADN inducido por B(a)P35.Os nosos resultados mostran que o tratamento con G-Rg3 reduce a citotoxicidade inducida por B(a)P e a formación de adutos de BPDE-ADN nas células hEL e restaura a expresión e actividade de GST in vitro.Non obstante, estes efectos estaban ausentes en ausencia de Nrf2, o que suxire que G-Rg3 induce efectos citoprotectores a través da vía Nrf2.Nrf2 é un importante factor de transcrición dos encimas de desintoxicación da fase II que promove a eliminación de xenobióticos36.A activación da vía Nrf2 induce a citoprotección e reduce o dano tisular37.Ademais, varios informes apoiaron o papel de Nrf2 como supresor de tumores na carcinoxénese38.O noso estudo mostra que a indución da vía Nrf2 por G-Rg3 xoga un importante papel regulador na xenotoxicidade inducida por B(a)P ao provocar a desintoxicación de B(a)P activando encimas da fase II, inhibindo así o proceso de tumorigénesis.
O noso traballo revela o potencial do ginseng vermello na prevención do cancro de pulmón inducido por B(a)P en ratos mediante a importante implicación do ginsenósido G-Rg3.A escasa biodisponibilidade oral desta molécula dificulta a súa aplicación clínica.Non obstante, este estudo mostra por primeira vez que G-Rg3 é un substrato da P-gp, e a administración dun inhibidor da P-gp aumenta a biodisponibilidade de G-Rg3 in vitro e in vivo.G-Rg3 reduce a citotoxicidade inducida por B(a)P regulando a vía Nrf2, que pode ser un mecanismo potencial para a súa función preventiva.O noso estudo confirma o potencial do ginsenósido G-Rg3 para a prevención e tratamento do cancro de pulmón.
Obtivéronse ratos A/J femias de seis semanas (20 ± 1 g) e ratas Wistar machos de 7 semanas (250 ± 20 g) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, EUA) e do Instituto de Zooloxía de Wuhan.Universidade (Wuhan, China).O Centro de Colección de Cultura de Tipo Chinés (Wuhan, China) proporcionounos células Caco-2 e hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA) é unha fonte de B(a)P e tricaprina.Os ginsenósidos purificados G-Rg3r e G-Rg3s, dimetilsulfóxido (DMSO), kit de ensaio de proliferación CellTiter-96 (MTS), verapamilo, medio mínimo esencial (MEM) e soro fetal bovino (FBS) foron adquiridos de Chengdu Must Bio-Technology. .Co, Ltd.(Chengdu, China).O kit QIAamp DNA mini e o kit ELISA de aducto BPDE-DNA foron adquiridos a Qiagen (Stanford, CA, EUA) e Cell Biolabs (San Diego, CA, EUA).O kit de ensaio de actividade GST e o kit de ensaio de proteína total (método estándar BCA) foron adquiridos a Solarbio (Beijing, China).Todos os extractos de ginseng vermello almacénanse no Laboratorio Mingyu 7. A Universidade Bautista de Hong Kong (Hong Kong, China) e o Korea Cancer Center (Seúl, Corea) son fontes comerciais de extracto de CRG e varios extractos de ginseng vermello de diversas orixes coreanas (incluíndo KRGA, KRGB). e KRGC).O ginseng vermello está feito a partir das raíces de ginseng fresco de 6 anos.O extracto de ginseng vermello obtense lavando o ginseng con auga tres veces, concentrando despois o extracto acuoso e, finalmente, secado a baixa temperatura para obter o extracto de ginseng en po.Os anticorpos (anti-Nrf2, anti-GST e β-actina), inmunoglobulina G anti-coello conxugada con peroxidase de rábano (IgG), reactivo de transfección, ARNsi de control e ARNsi Nrf2 foron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), EUA).
Cultiváronse células Caco2 e hEL en pratos de cultivo celular de 100 mm2 con MEM que conteñen 10% FBS a 37 °C nunha atmosfera humidificada de 5% CO2.Para determinar o efecto das condicións de tratamento, as células hEL foron incubadas con diferentes concentracións de B(a)P e G-Rg3 en MEM durante 48 h.As células pódense analizar ou recoller máis para preparar extractos sen células.
Todos os experimentos foron aprobados polo Comité de Ética Animal Experimental da Facultade Médica de Tongji, Universidade de Ciencia e Tecnoloxía de Huazhong (n.º de aprobación 2019; número de rexistro 4587TH).Todos os experimentos realizáronse de acordo coas directrices e regulamentos pertinentes, e o estudo realizouse de acordo coas directrices de Investigación animal: Informes de experimentos in vivo (ARRIVE).Os ratos A/J de oito semanas de idade foron primeiro inxectado intraperitonealmente con B(a)P en solución de tricarina (100 mg/kg, 0,2 ml).Despois dunha semana, os ratos foron divididos aleatoriamente en grupos de control e diferentes grupos de tratamento, 15 ratos en cada grupo, e foron sometidos a sonda unha vez ao día.Despois de 20 semanas de tratamento, os animais foron sacrificados por asfixia de CO2.Os pulmóns foron recollidos e fixados durante 24 horas.O número de tumores superficiais e os tamaños individuais dos tumores cuantificáronse para cada pulmón baixo un microscopio de disección.As estimacións do volume do tumor (V) calculáronse mediante a seguinte expresión: V (mm3) = 4/3πr3, onde r é o diámetro do tumor.A suma neta de todos os volumes do tumor nos pulmóns dos ratos representou o volume total do tumor, e o volume total medio do tumor en cada grupo representou a carga do tumor.Recolléronse mostras de sangue enteiro e intestinais e almacenáronse a -80 ° C para a determinación UPLC-MS/MS.Recolliuse soro e utilizouse un analizador químico automatizado para analizar os niveis de alanina aminotransferase (ALT) e creatinina sérica (Cr) para avaliar a función hepática e renal.
As mostras recollidas retiráronse da cámara frigorífica, desconxeláronse, pesáronse e colocáronse en tubos como se describe anteriormente.A isto engadiuse 0,5 μM de florizina (estándar interno) en 0,8 ml de solución de metanol.Despois homoxeneizouse o tecido usando Tissue-Tearor e o homoxeneado foi posteriormente transferido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.A mestura foi centrifugada a 15500 rpm durante 15 minutos.Despois de eliminar 1,0 ml de sobrenadante, seque con nitróxeno.Para a súa recuperación utilizáronse douscentos microlitros de metanol.O sangue recóllese e procesa nunha liña e úsase como referencia para todas as medicións.
Sementáronse placas Transwell de 24 pozos con 1,0 × 105 células Caco-2 por pozo para avaliar a mellora potencial do transporte de G-Rg3 coa adición de verapamilo.Despois de 3 semanas de cultivo, as células laváronse con HBSS e preincubáronse a 37 °C.Inxectáronse 400 μl de 10 μM de G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s ou unha mestura con 50 ou 100 μM de verapamilo) no lado basolateral ou apical da monocapa, e 600 μl de solución de HBSS á outra. lado.Recoller 100 µl de medio de cultivo nos momentos sinalados (0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos) e engadir 100 µl de HBSS para completar este volume.As mostras almacenáronse a -4 °C ata a súa detección por UPLC-MS/MS.A expresión Papp = dQ/(dT × A × C0) úsase para cuantificar a aparente permeabilidade apical e basolateral unidireccional e viceversa (Pa-b e Pb-a, respectivamente);dQ/dT é o cambio de concentración, A (0,6 cm2) é a superficie da monocapa e C0 é a concentración inicial do doador.A relación de efluxo calcúlase como Pb-a/Pa-b, que representa a taxa de saída do fármaco de estudo.
As ratas Wistar machos foron en xaxún durante 24 horas, beberon só auga e anestesiaron cunha inxección intravenosa de solución de pentobarbital ao 3,5%.O tubo de silicona intubado ten o extremo do duodeno como entrada e o extremo do íleon como saída.Use unha bomba peristáltica para bombear a entrada con 10 µM de G-Rg3r ou G-Rg3s en HBSS isotónico a un caudal de 0,1 ml/min.O efecto do verapamilo avaliouse engadindo 50 μM ou 100 μM do composto a 10 μM de G-Rg3r ou G-Rg3s.UPLC-MS/MS realizouse en extractos de perfusión recollidos nos puntos de tempo 60, 90, 120 e 150 minutos despois do inicio da perfusión.A porcentaxe de absorción cuantificase coa fórmula % de absorción = (1 – Cout/Cin) × 100%;a concentración de G-Rg3 na saída e entrada exprésase por Cout e Cin, respectivamente.
As células hEL sementáronse en placas de 96 pozos cunha densidade de 1 × 104 células por pozo e tratáronse con B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ou G-Rg3 disolto en DMSO .A continuación, os fármacos diluíronse con medio de cultivo a varias concentracións (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) durante 48 horas.Usando un kit de ensaio MTS dispoñible comercialmente, as células foron sometidas a un protocolo estándar e despois medironse cun lector de microplacas a 490 nm.O nivel de viabilidade celular dos grupos cotratados con B(a)P (10 μM) e G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) foi valorado segundo o método anterior e comparouse co grupo non tratado.
As células hEL sementáronse en placas de 6 pozos cunha densidade de 1 × 105 células/pozo e tratáronse con 10 μMB(a)P en presenza ou ausencia de 10 μM de G-Rg3.Despois de 48 horas de tratamento, o ADN foi extraído de células hEL utilizando o QIAamp DNA Mini Kit segundo o protocolo do fabricante.A formación de adutos de BPDE-ADN detectouse mediante un kit ELISA de adutos de BPDE-ADN.Os niveis relativos de aducto de BPDE-ADN foron medidos mediante un lector de microplacas medindo a absorbancia a 450 nm.
As células hEL sementáronse en placas de 96 pozos cunha densidade de 1 × 104 células por pozo e tratáronse con 10 μMB(a)P en ausencia ou presenza de 10 μM G-Rg3 durante 48 h.A actividade GST foi medida mediante un kit de ensaio de actividade GST comercial segundo o protocolo do fabricante.A activación relativa do GST foi medida por absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.
As células hEL laváronse con PBS xeado e despois lisáronse usando un tampón de ensaio de radioinmunoprecipitación que contén inhibidores da protease e inhibidores da fosfatase.Despois da cuantificación de proteínas mediante un kit de ensaio de proteína total, separáronse 30 μg de proteína en cada mostra mediante SDS-PAGE ao 12% e transferíronse a unha membrana de PVDF mediante electroforese.Bloqueáronse as membranas con leite desnatado ao 5% e incubáronse con anticorpos primarios durante a noite a 4 °C.Despois da incubación con anticorpos secundarios conxugados con peroxidase de rábano picante, engadíronse reactivos de quimioluminiscencia mellorada para visualizar o sinal de unión.A intensidade de cada banda de proteína cuantificouse mediante o software ImageJ.
Utilizouse o software GraphPad Prism 7.0 para analizar todos os datos, expresados como media ± desviación estándar.A variación entre os grupos de tratamento avaliouse mediante a proba t de Student ou a análise unidireccional da varianza, cun valor de P <0,05 que indica significación estatística.
Todos os datos obtidos ou analizados durante este estudo inclúense neste artigo publicado e ficheiros de información complementaria.
Torre, LA, Siegel, RL e Jemal, A. Estatísticas do cancro de pulmón.adverbio.Caducou.medicina.bioloxía.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Carcinóxenos do tabaco, os seus biomarcadores e o cancro inducido polo tabaco.Nat.Capelán de cancro.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH e Venitt, S. ADN e aductos de proteínas nos tecidos humanos resultantes da exposición ao fume do tabaco.internacionalidade.J. Cancro.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA e Yu M. Efecto de Houttuynia cordata e silibinina na tumorigénesis pulmonar inducida por benzo(a)pireno en ratos A/J.Cancro 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Produto natural anticanceroso illado de materiais medicinais chineses.mandíbula.medicina.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Eficacia do polifenón E, ginseng vermello e rapamicina na tumorigénesis pulmonar inducida por benzo(a)pireno en ratos A/J.Cancro 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS e Yuan, KS Red, participación na terapia do cancro.mandíbula.J. Nutt.medicina.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS e Gao, L. Ginsenosides nas raíces e follas do ginseng americano.J. Agric.Química dos alimentos.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA e Yuan KS Farmacoloxía do ginseng: moitos compoñentes e moitos efectos.bioquímica.farmacoloxía.58, 1685–1693 (1999).
Hora de publicación: 17-09-2023