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लाल जिनसेंग का उपयोग पारंपरिक एशियाई चिकित्सा में सैकड़ों वर्षों से किया जाता रहा है।इस अध्ययन में, हमने विभिन्न क्षेत्रों में उगाए गए चार प्रकार के लाल जिनसेंग (चीनी लाल जिनसेंग, कोरियाई लाल जिनसेंग ए, कोरियाई लाल जिनसेंग बी, और कोरियाई लाल जिनसेंग सी) की कार्सिनोजेन-प्रेरित फेफड़ों के निर्माण और वृद्धि को रोकने की क्षमता का मूल्यांकन किया। ट्यूमर.ए/जे चूहों पर बेंजो(ए)पाइरीन (बी(ए)पी) परीक्षण किया गया और कोरियाई लाल जिनसेंग बी को चार लाल जिनसेंग किस्मों के बीच ट्यूमर के बोझ को कम करने में सबसे प्रभावी पाया गया।इसके अलावा, हमने चार लाल जिनसेंग अर्क में विभिन्न जिनसैनोसाइड्स (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 और Rg5) की सामग्री का विश्लेषण किया और पाया कि कोरियाई लाल जिनसेंग बी में मौजूद था। जिनसैनोसाइड Rg3 (G-Rg3) का उच्चतम स्तर, यह सुझाव देता है कि G-Rg3 इसकी चिकित्सीय प्रभावकारिता में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।यह कार्य दर्शाता है कि G-Rg3 की जैवउपलब्धता अपेक्षाकृत कम है।हालाँकि, जब G-Rg3 को P-gp अवरोधक वेरापामिल के साथ प्रशासित किया गया, तो Caco-2 कोशिकाओं में G-Rg3 का प्रवाह कम हो गया, चूहे के मॉडल में G-Rg3 के आंतों के अवशोषण की दर बढ़ गई, और G-Rg3 वृद्धि की गई थी।Caco-2 कोशिकाओं में, Rg3 का बहिर्वाह कम हो जाता है, और Rg3 सांद्रता का स्तर कम हो जाता है।जी-आरजी3 आंत और प्लाज्मा में बढ़ जाता है, और बी(ए)पी-प्रेरित ट्यूमरजेनसिस के चूहे मॉडल में ट्यूमर को रोकने की इसकी क्षमता भी बढ़ जाती है।हमने यह भी पाया कि जी-आरजी3 ने मानव फेफड़ों की कोशिकाओं में बी(ए)पी-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी और डीएनए एडक्ट गठन को कम कर दिया, और एनआरएफ2 मार्ग के माध्यम से चरण II एंजाइमों की अभिव्यक्ति और गतिविधि को बहाल किया, जो कार्रवाई के संभावित तंत्र से संबंधित हो सकता है। G निषेध का -Rg3..फेफड़े के ट्यूमर की घटना के बारे में.हमारा अध्ययन माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर को लक्षित करने में जी-आरजी3 की संभावित महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाता है।इस जिनसैनोसाइड की मौखिक जैवउपलब्धता को पी-ग्लाइकोप्रोटीन को लक्षित करके बढ़ाया जाता है, जिससे अणु कैंसर विरोधी प्रभाव डाल सकता है।
फेफड़ों के कैंसर का सबसे आम प्रकार नॉन-स्मॉल सेल लंग कैंसर (एनएससीएलसी) है, जो चीन और उत्तरी अमेरिका1,2 में कैंसर से होने वाली मौतों के प्रमुख कारणों में से एक है।गैर-लघु कोशिका फेफड़ों के कैंसर के विकास के जोखिम को बढ़ाने वाला मुख्य कारक धूम्रपान है।सिगरेट के धुएं में 60 से अधिक कार्सिनोजेन होते हैं, जिनमें बेंजो (ए) पाइरीन (बी (ए) पी), नाइट्रोसामाइन और रेडॉन के क्षय से रेडियोधर्मी आइसोटोप शामिल हैं। पॉलीसाइक्लिक एरोमैटिक हाइड्रोकार्बन बी (ए) पी सिगरेट में विषाक्तता का मुख्य कारण हैं धुआँ।बी(ए)पी के संपर्क में आने पर, साइटोक्रोम पी450 इसे बी(ए)पी-7,8-डायहाइड्रोडिओल-9,10-एपॉक्साइड (बीपीडीई) में बदल देता है, जो डीएनए के साथ प्रतिक्रिया करके बीपीडीई-डीएनए एडक्ट 4 बनाता है। मानव फेफड़ों के ट्यूमर के समान ट्यूमर चरण और हिस्टोपैथोलॉजी वाले चूहों में फेफड़ों के ट्यूमरजनन को प्रेरित करने वाले पदार्थ।यह सुविधा बी(ए)पी-प्रेरित फेफड़े के कैंसर मॉडल को संभावित कैंसररोधी गुणों वाले यौगिकों के मूल्यांकन के लिए एक उपयुक्त प्रणाली बनाती है।
उच्च जोखिम वाले समूहों, विशेष रूप से धूम्रपान करने वालों में फेफड़ों के कैंसर के विकास को रोकने के लिए एक संभावित रणनीति, इंट्रापीथेलियल नियोप्लास्टिक घावों के विकास को दबाने के लिए कीमोप्रिवेंटिव एजेंटों का उपयोग है और इस तरह उनकी घातक प्रगति को रोका जा सकता है।पशु अध्ययन से पता चलता है कि विभिन्न कीमोप्रिवेंटिव एजेंट प्रभावी6 हैं।हमारी पिछली रिपोर्ट7 में फेफड़ों के कैंसर पर लाल जिनसेंग के अच्छे निवारक प्रभावों पर प्रकाश डाला गया था।इस जड़ी बूटी का उपयोग सदियों से पारंपरिक एशियाई चिकित्सा में जीवन और स्वास्थ्य को लम्बा करने के लिए किया जाता रहा है, और इसके एंटीट्यूमर प्रभाव होने का दस्तावेजीकरण किया गया है8।
जिनसेंग का सक्रिय कारक जिनसेनोसाइड है, जिसका उपयोग जिनसेंग अर्क की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एक समग्र मार्कर के रूप में किया जाता है।कच्चे जिनसेंग अर्क के मात्रात्मक विश्लेषण में आमतौर पर आरके1, आरजी1, एफ1, रे, आरबी1, आरबी2, आरबी3, आरडी, आरएच1, आरएच2, आरजी3, आरजी5 और आरसी9,10 सहित कई जिनसैनोसाइड्स का उपयोग शामिल होता है।जिनसैनोसाइड्स का मौखिक जैवउपलब्धता बहुत कम होने के कारण इसका नैदानिक उपयोग बहुत कम है11।हालांकि इस खराब जैवउपलब्धता का तंत्र स्पष्ट नहीं है, पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी)12 के कारण होने वाला जिनसैनोसाइड्स का प्रवाह इसका कारण हो सकता है।पी-जीपी एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर सुपरफैमिली में सबसे महत्वपूर्ण इफ्लक्स ट्रांसपोर्टरों में से एक है, जो बाहरी वातावरण में इंट्रासेल्युलर पदार्थों को जारी करने के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस की ऊर्जा का उपयोग करता है।पी-जीपी ट्रांसपोर्टर आम तौर पर आंत, गुर्दे, यकृत और रक्त-मस्तिष्क बाधा13 में व्यापक रूप से वितरित होते हैं।पी-जीपी आंतों के अवशोषण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और पी-जीपी के निषेध से मौखिक अवशोषण और कुछ कैंसर रोधी दवाओं की उपलब्धता बढ़ जाती है।साहित्य में पहले इस्तेमाल किए गए अवरोधकों के उदाहरण वेरापामिल और साइक्लोस्पोरिन ए15 हैं।इस कार्य में घातक बीमारियों को प्रभावित करने के लिए चीन और कोरिया के विभिन्न लाल जिनसेंग अर्क की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए बी (ए) पी-प्रेरित फेफड़ों के कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक माउस प्रणाली स्थापित करना शामिल है।विशिष्ट जिनसैनोसाइड्स की पहचान करने के लिए अर्क का व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया था जो कार्सिनोजेनेसिस को प्रभावित कर सकते हैं।तब वेरापामिल का उपयोग पी-जीपी को लक्षित करने और कैंसर-लक्षित जिनसैनोसाइड्स की मौखिक जैवउपलब्धता और चिकित्सीय प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए किया गया था।
वह तंत्र जिसके द्वारा जिनसेंग सैपोनिन कार्सिनोजेनेसिस पर चिकित्सीय प्रभाव डालता है, अस्पष्ट बना हुआ है।शोध से पता चला है कि विभिन्न जिनसैनोसाइड्स ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और चरण II विषहरण एंजाइमों को सक्रिय करके कार्सिनोजेन्स के कारण होने वाली डीएनए क्षति को कम कर सकते हैं, जिससे कोशिका क्षति को रोका जा सकता है।ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) एक विशिष्ट चरण II एंजाइम है जो कार्सिनोजेन्स17 के कारण होने वाले डीएनए क्षति को कम करने के लिए आवश्यक है।न्यूक्लियर एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (एनआरएफ2) एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक है जो रेडॉक्स होमोस्टैसिस को नियंत्रित करता है और चरण II एंजाइम और साइटोप्रोटेक्टिव एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रियाओं18 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है।हमारे अध्ययन ने बी (ए) पी-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी और बीपीडीई-डीएनए एडक्ट गठन को कम करने के साथ-साथ सामान्य फेफड़ों की कोशिकाओं में एनआरएफ 2 मार्ग को संशोधित करके चरण II एंजाइमों को प्रेरित करने पर पहचाने गए जिनसैनोसाइड्स के प्रभावों की भी जांच की।
बी(ए)पी-प्रेरित कैंसर के माउस मॉडल की स्थापना पिछले कार्यके अनुरूप है।चित्र 1ए बी(ए)पी, पानी (नियंत्रण), चीनी लाल जिनसेंग अर्क (सीआरजी), कोरियाई लाल जिनसेंग अर्क ए (केआरजीए), और कोरियाई लाल द्वारा प्रेरित माउस कैंसर मॉडल के 20-सप्ताह के उपचार के प्रायोगिक डिजाइन को दर्शाता है। जिनसेंग.अर्क बी (केआरजीबी) और कोरियाई लाल जिनसेंग अर्क सी (केआरजीसी)।लाल जिनसेंग उपचार के 20 सप्ताह के बाद, चूहों को CO2 श्वासावरोध द्वारा बलि दी गई।चित्र 1बी विभिन्न प्रकार के लाल जिनसेंग के साथ इलाज किए गए जानवरों में मैक्रोस्कोपिक फेफड़े के ट्यूमर को दर्शाता है, और चित्र 1सी ट्यूमर नमूने का एक प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ दिखाता है।केआरजीबी-उपचारित जानवरों (1.5 ± 0.35) का ट्यूमर बोझ नियंत्रण जानवरों (0.82 ± 0.2, पी <0.05) की तुलना में कम था, जैसा कि चित्र 1डी में दिखाया गया है।ट्यूमर लोड निषेध की औसत डिग्री 45% थी।परीक्षण किए गए अन्य लाल जिनसेंग अर्क ने ट्यूमर के बोझ में ऐसे महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाए (पी > 0.05)।लाल जिनसेंग उपचार के 20 सप्ताह के दौरान माउस मॉडल में कोई स्पष्ट दुष्प्रभाव नहीं देखा गया, जिसमें शरीर के वजन में कोई बदलाव नहीं (डेटा नहीं दिखाया गया) और कोई यकृत या गुर्दे की विषाक्तता नहीं (चित्र 1ई,एफ)।
लाल जिनसेंग अर्क ए/जे चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास का इलाज करता है।(ए) प्रायोगिक डिजाइन।(बी) माउस मॉडल में बड़े फेफड़े के ट्यूमर।ट्यूमर को तीरों द्वारा दर्शाया गया है।ए: चीनी लाल जिनसेंग समूह।बी: कोरियाई लाल जिनसेंग का समूह ए।सी: कोरियाई लाल जिनसेंग समूह बी। डी: कोरियाई लाल जिनसेंग समूह सी। डी: नियंत्रण समूह।(सी) फेफड़े के ट्यूमर को दर्शाने वाला हल्का माइक्रोग्राफ।आवर्धन: 100. बी: 400. (डी) लाल जिनसेंग अर्क समूह में ट्यूमर लोड।(ई) लिवर एंजाइम एएलटी का प्लाज्मा स्तर।(एफ) वृक्क एंजाइम सीआर का प्लाज्मा स्तर।डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05.
इस अध्ययन में पहचाने गए लाल जिनसेंग अर्क का विश्लेषण अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-MS/MS) द्वारा निम्नलिखित जिनसैनोसाइड्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 और Rg5।एनालिटिक्स को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली यूपीएलसी और एमएस स्थितियों का वर्णन पिछली रिपोर्ट19 में किया गया था।चार लाल जिनसेंग अर्क के यूपीएलसी-एमएस/एमएस क्रोमैटोग्राम चित्र 2ए में दिखाए गए हैं।कुल जिनसैनोसाइड सामग्री में महत्वपूर्ण अंतर थे, सीआरजी में उच्चतम कुल जिनसैनोसाइड सामग्री (590.27 ± 41.28 μmol/L) (चित्र 2बी) के साथ।व्यक्तिगत जिनसैनोसाइड्स (चित्र 2सी) का मूल्यांकन करते समय, केआरजीबी ने अन्य जिनसैनोसाइड्स की तुलना में जी-आरजी3 का उच्चतम स्तर दिखाया (जी-आरजी3एस के लिए 58.33 ± 3.81 μmol/L और G-Rg3r).L के लिए 41.56 ± 2.88 μmol/L)।लाल जिनसेंग प्रकार (पी <0.001)।G-Rg3 स्टीरियोइसोमर्स G-Rg3r और G-Rg3s की एक जोड़ी के रूप में होता है, जो कार्बन 20 पर हाइड्रॉक्सिल समूह की स्थिति में भिन्न होता है (चित्र 2D)।नतीजे बताते हैं कि जी-आरजी3आर या जी-आरजी3 में बी(ए)पी-प्रेरित कैंसर माउस मॉडल में महत्वपूर्ण कैंसररोधी क्षमता हो सकती है।
विभिन्न लाल जिनसेंग अर्क में जिनसैनोसाइड्स की सामग्री।(ए) चार लाल जिनसेंग अर्क के यूपीएलसी-एमएस/एमएस क्रोमैटोग्राम।(बी) संकेतित अर्क में कुल जिनसैनोसाइड सामग्री का अनुमान।(सी) लेबल किए गए अर्क में व्यक्तिगत जिनसैनोसाइड्स का पता लगाना।(डी) जिनसैनोसाइड स्टीरियोइसोमर्स जी-आरजी3आर और जी-आरजी3एस की संरचनाएं।डेटा को तीन प्रतियों के निर्धारण के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।***पी <0.001.
यूपीएलसी-एमएस/एमएस अध्ययन के लिए उपचार के 20 सप्ताह के बाद आंतों और रक्त के नमूनों में जिनसैनोसाइड्स की मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता थी।केआरजीबी के साथ उपचार से रक्त में केवल 0.0063 ± 0.0005 μg/ml Rg5 की उपस्थिति देखी गई।कोई शेष जिनसैनोसाइड्स नहीं पाया गया, जो खराब मौखिक जैवउपलब्धता का संकेत देता है और इसलिए इन जिनसैनोसाइड्स के संपर्क में कमी आई है।
बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा कोशिका रेखा Caco-2 रूपात्मक और जैव रासायनिक रूप से मानव आंतों के उपकला कोशिकाओं के समान है, जो आंतों के उपकला अवरोध के पार एंटरोसाइट परिवहन का आकलन करने में इसकी उपयोगिता को प्रदर्शित करता है।यह विश्लेषण पहले के अध्ययन 20 पर आधारित था।आंकड़े 3ए, बी, सी, डी, ई, एफ कैको-2 मोनोलेयर मॉडल का उपयोग करके जी-आरजी3आर और जी-आरजी3 के ट्रांससेलुलर परिवहन की प्रतिनिधि छवियां दिखाते हैं।बेसोलेटरल से एपिकल साइड (पीबी-ए) तक काको-2 मोनोलेयर्स में जी-आरजी3आर या जी-आरजी3 का ट्रांससेलुलर ट्रांसपोर्ट एपिकल से बेसोलेटरल साइड (पीए-बी) की तुलना में काफी अधिक था।G-Rg3r के लिए, माध्य Pa-b मान 0.38 ± 0.06 था, जो 50 μmol/L वेरापामिल के साथ उपचार के बाद 0.73 ± 0.06 हो गया और 100 μmol/L वेरापामिल (p < 0.01 और 0.001) के साथ उपचार के बाद 1.14 ± 0.09 हो गया। क्रमशः; चित्र 2)।3ए).जी-आरजी3 के लिए अवलोकनों ने एक समान पैटर्न (चित्र 3बी) का पालन किया, और परिणामों से पता चला कि वेरापामिल उपचार ने जी-आरजी3आर और जी-आरजी3 के परिवहन को बढ़ाया।वेरापामिल उपचार के परिणामस्वरूप माध्य Pb-a और G-Rg3r और G-Rg3s प्रवाह अनुपात (चित्र 3C,D,E,F) में उल्लेखनीय कमी आई, यह दर्शाता है कि वेरापामिल उपचार Caco-2 प्रवाह कोशिकाओं में जिनसेनोसाइड सामग्री को कम कर देता है।.
Caco-2 मोनोलेयर्स में G-Rg3 का ट्रांससेलुलर परिवहन और चूहे के छिड़काव परख में आंतों का अवशोषण।(ए) Caco-2 मोनोलेयर में G-Rg3r समूह का Pa-b मान।(बी) Caco-2 मोनोलेयर में G-Rg3s समूहों का Pa-b मान।(सी) काको-2 मोनोलेयर में जी-आरजी3आर समूह का पीबी मान।(D) Caco-2 मोनोलेयर में G-Rg3s समूहों का Pb मान।(ई) काको-2 मोनोलेयर में जी-आरजी3आर समूहों का उपज अनुपात।(एफ) काको-2 मोनोलेयर में जी-आरजी3 समूहों का उपज अनुपात।(जी) चूहों में छिड़काव परख में जी-आरजी3आर के आंतों के अवशोषण का प्रतिशत।(एच) चूहों में छिड़काव परख में जी-आरजी3 के आंतों के अवशोषण का प्रतिशत।वेरापामिल को शामिल किए बिना पारगम्यता और अवशोषण की तुलना की गई।डेटा को पांच स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001।
पहले के काम20 के अनुरूप, यह निर्धारित करने के लिए चूहों के ऑर्थोटोपिक आंतों का छिड़काव किया गया था कि वेरापामिल उपचार के बाद आंत में जी-आरजी3 अवशोषण बढ़ता है या नहीं।उपरोक्त समय अवधि के दौरान कैंसर मॉडल चूहों में जी-आरजी3आर और जी-आरजी3 के आंतों के अवशोषण के प्रतिशत का मूल्यांकन करने के लिए आंकड़े 3जी,एच प्रतिनिधि छिड़काव परीक्षण दिखाते हैं।कमजोर G-Rg3r ग्रहण का प्रारंभिक प्रतिशत लगभग 10% था जो 50 μM वेरापामिल के साथ उपचार के बाद 20% से अधिक और 100 μM वेरापामिल के साथ उपचार के बाद 25% से अधिक हो गया।इसी तरह, जी-आरजी3, जिसकी प्रारंभिक क्षमता 10% थी, ने भी 50 μM वेरापामिल के साथ उपचार के बाद 20% से अधिक और 100 μM वेरापामिल के साथ उपचार के बाद लगभग 30% की वृद्धि देखी, जिससे पता चलता है कि वेरापामिल द्वारा पी-जीपी का निषेध बढ़ जाता है। फेफड़ों के कैंसर के एक माउस मॉडल में आंतों का जी-अवशोषण Rg3।
उपरोक्त विधि के अनुसार, बी(ए)पी-प्रेरित कैंसर मॉडल चूहों को यादृच्छिक रूप से छह समूहों में विभाजित किया गया था, जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है।नियंत्रण समूह (डेटा नहीं दिखाया गया) की तुलना में जी-आरजी3 उपचार समूह में कोई महत्वपूर्ण वजन घटाने या विषाक्तता के नैदानिक लक्षण नहीं देखे गए।20 सप्ताह के उपचार के बाद, प्रत्येक चूहे के फेफड़े एकत्र किए गए।चित्र 4बी उपरोक्त उपचार समूहों में चूहों में मैक्रोस्कोपिक फेफड़े के ट्यूमर को दर्शाता है, और चित्र 4सी एक प्रतिनिधि ट्यूमर का प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ दिखाता है।प्रत्येक समूह में ट्यूमर के बोझ के संबंध में (चित्र 4डी), जी-आरजी3आर और जी-आरजी3एस से उपचारित चूहों के लिए मान क्रमशः 0.75 ± 0.29 मिमी3 और 0.81 ± 0.30 मिमी3 थे, जबकि उपचारित जी चूहों के लिए मान -Rg3s के साथ क्रमशः 1.63 ±0.40 mm3 थे।नियंत्रण चूहों (पी <0.001), यह दर्शाता है कि जी-आरजी3 उपचार ने चूहों में ट्यूमर का बोझ कम कर दिया है।वेरापामिल के प्रशासन ने इस कमी को और बढ़ा दिया: वेरापामिल+ जी-आरजी3आर चूहों में मान 0.75 ± 0.29 मिमी3 से घटकर 0.33 ± 0.25 मिमी3 (पी <0.01) हो गया, और वेरापामिल+ के लिए मान 0.81 ± 0.30 मिमी3 से घटकर 0.29 ± 0.21 हो गया। जी-आरजी3एस-उपचारित चूहों में एमएम3 (पी <0.05), यह दर्शाता है कि वेरापामिल ट्यूमरजेनिसिस पर जी-आरजी3 के निरोधात्मक प्रभाव को बढ़ा सकता है।ट्यूमर के बोझ ने नियंत्रण समूह और वेरापामिल समूह, जी-आरजी3आर समूह और जी-आरजी3एस समूह और वेरापामिल+जी-आरजी3आर समूह और वेरापामिल+जी-आरजी3एस समूह के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया।इसके अलावा, मूल्यांकन किए गए उपचारों से जुड़े कोई महत्वपूर्ण यकृत या गुर्दे की विषाक्तता नहीं थी (चित्रा 4ई,एफ)।
संकेतित समूहों में G-Rg3 उपचार और प्लाज्मा या आंतों G-Rg3r और G-Rg3 स्तर के बाद ट्यूमर का बोझ।(ए) प्रायोगिक डिजाइन।(बी) माउस मॉडल में मैक्रोस्कोपिक ट्यूमर।ट्यूमर को तीरों द्वारा दर्शाया गया है।ए: जी-आरजी3आर।बी: जी-आरजी3एस।सी: वेरापामिल के साथ संयोजन में जी-आरजी3आर।डी: वेरापामिल के साथ संयोजन में जी-आरजी3।डी: वेरापामिल।ई: नियंत्रण.(सी) आवर्धन पर ट्यूमर का ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ।उत्तर: 100x.बी: 400X.(डी) ए/जे चूहों में ट्यूमर के बोझ पर जी-आरजी3 + वेरापामिल उपचार का प्रभाव।(ई) लिवर एंजाइम एएलटी का प्लाज्मा स्तर।(एफ) वृक्क एंजाइम सीआर का प्लाज्मा स्तर।(जी) संकेतित समूहों के जी-आरजी3आर या जी-आरजी3 का प्लाज्मा स्तर।(एच) संकेतित समूहों की आंतों में जी-आरजी3आर या जी-आरजी3एस का स्तर।डेटा को तीन प्रतियों के निर्धारण के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001।
विधि अनुभाग में वर्णित विधि के अनुसार 20 सप्ताह की उपचार अवधि के बाद बी (ए) पी-प्रेरित कैंसर मॉडल चूहों में जी-आरजी 3 स्तर का मूल्यांकन यूपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा किया गया था।आंकड़े 4जी और एच क्रमशः प्लाज्मा और आंत्र जी-आरजी3 स्तर दिखाते हैं।प्लाज्मा G-Rg3r का स्तर 0.44 ± 0.32 μmol/L था और वेरापामिल (पी <0.001) के सहवर्ती प्रशासन के साथ बढ़कर 1.17 ± 0.47 μmol/L हो गया, जबकि आंतों में G-Rg3r का स्तर 0.53 ± 0.08 µg/L था।वेरापामिल के साथ मिलाने पर, जी बढ़कर 1.35 ± 0.13 μg/g (पी <0.001) हो गया।जी-आरजी3 के लिए, परिणाम एक समान पैटर्न का पालन करते हैं, जो दर्शाता है कि वेरापामिल उपचार ने ए/जे चूहों में जी-आरजी3 की मौखिक जैवउपलब्धता में वृद्धि की है।
सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग एचईएल कोशिकाओं पर बी (ए) पी और जी-आरजी 3 की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।एचईएल कोशिकाओं में बी(ए)पी द्वारा प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी को चित्र 5ए में दिखाया गया है, जबकि जी-आरजी3आर और जी-आरजी3 के गैर-विषैले गुणों को चित्र 5ए और 5बी में दिखाया गया है।5बी, सी. जी-आरजी3 के साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, बी(ए)पी को एचईएल कोशिकाओं में जी-आरजी3आर या जी-आरजी3 की विभिन्न सांद्रता के साथ सह-प्रशासित किया गया था।जैसा कि चित्र 5डी में दिखाया गया है, 5 μM, 10 μM और 20 μM की सांद्रता पर G-Rg3r ने सेल व्यवहार्यता को क्रमशः 58.3%, 79.3% और 77.3% तक बहाल कर दिया।इसी तरह के परिणाम G-Rg3s समूह में भी देखे जा सकते हैं।जब G-Rg3s की सांद्रता 5 µM, 10 µM और 20 µM थी, तो सेल व्यवहार्यता क्रमशः 58.3%, 72.7% और 76.7% पर बहाल हो गई थी (चित्र 5E)।).बीपीडीई-डीएनए एडिक्ट्स की उपस्थिति को एलिसा किट का उपयोग करके मापा गया था।हमारे परिणामों से पता चला कि नियंत्रण समूह की तुलना में बी (ए) पी-उपचारित समूह में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट स्तर बढ़ गया था, लेकिन जी-आरजी 3 सह-उपचार की तुलना में, बी (ए) पी समूह में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट स्तर उपचारित समूह में बी, डीएनए जोड़ का स्तर काफी कम हो गया था।अकेले बी(ए)पी के साथ उपचार के परिणाम चित्र 5एफ (जी-आरजी3आर के लिए 1.87 ± 0.33 बनाम 3.77 ± 0.42, जी-आरजी3एस के लिए 1.93 ± 0.48 बनाम 3.77 ± 0.42, पी <0.001) में दिखाए गए हैं।
जी-आरजी3 और बी(ए)पी से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता और बीपीडीई-डीएनए एडक्ट गठन।(ए) बी(ए)पी से उपचारित एचईएल कोशिकाओं की व्यवहार्यता।(बी) जी-आरजी3आर से उपचारित एचईएल कोशिकाओं की व्यवहार्यता।(सी) जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं की व्यवहार्यता।(डी) बी(ए)पी और जी-आरजी3आर से उपचारित एचईएल कोशिकाओं की व्यवहार्यता।(ई) बी(ए)पी और जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं की व्यवहार्यता।(एफ) बी(ए)पी और जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट का स्तर।डेटा को तीन प्रतियों के निर्धारण के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001।
10 μM B(a)P और 10 μM G-Rg3r या G-Rg3s के साथ सह-उपचार के बाद जीएसटी एंजाइम अभिव्यक्ति का पता लगाया गया।हमारे परिणामों से पता चला कि बी (ए) पी ने जीएसटी अभिव्यक्ति को दबा दिया (जी-आरजी 3 आर समूह में 59.7 ± 8.2% और जी-आरजी 3 एस समूह में 39 ± 4.5%), और बी (ए) पी जी-आरजी 3 आर के साथ जुड़ा हुआ था , या G-Rg3r के साथ, या G-Rg3r के साथ।G-Rg3s के साथ सह-उपचार ने जीएसटी अभिव्यक्ति को बहाल किया।जीएसटी अभिव्यक्ति (जी-आरजी3आर समूह में 103.7 ± 15.5% और जी-आरजी3एस समूह में 110 ± 11.1%, क्रमशः पी <0.05 और पी <0.001, चित्र 6ए, बी, और सी)।जीएसटी गतिविधि का मूल्यांकन एक गतिविधि परख किट का उपयोग करके किया गया था।हमारे परिणामों से पता चला कि संयोजन उपचार समूह में केवल बी(ए)पी समूह की तुलना में अधिक जीएसटी गतिविधि थी (जी-आरजी3आर समूह में 96.3 ± 6.6% बनाम 35.7 ± 7.8% बनाम जी-आरजी3आर समूह में 92.3 ± 6.5) ).जी-आरजी3एस समूह में % बनाम 35.7 ± 7.8%, पी <0.001, चित्र 6डी)।
बी(ए)पी और जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में जीएसटी और एनआरएफ2 की अभिव्यक्ति।(ए) वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा जीएसटी अभिव्यक्ति का पता लगाना।(बी) बी(ए)पी और जी-आरजी3आर से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में जीएसटी की मात्रात्मक अभिव्यक्ति।(सी) बी(ए)पी और जी-आरजी3एस से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में जीएसटी की मात्रात्मक अभिव्यक्ति।(डी) बी(ए)पी और जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में जीएसटी गतिविधि।(ई) वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एनआरएफ2 अभिव्यक्ति का पता लगाना।(एफ) बी(ए)पी और जी-आरजी3आर से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में एनआरएफ2 की मात्रात्मक अभिव्यक्ति।(जी) बी(ए)पी और जी-आरजी3एस से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में एनआरएफ2 की मात्रात्मक अभिव्यक्ति।डेटा को तीन प्रतियों के निर्धारण के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001।
बी(ए)पी-प्रेरित ट्यूमरजेनसिस के जी-आरजी3-मध्यस्थता दमन में शामिल मार्गों को स्पष्ट करने के लिए, एनआरएफ2 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था।जैसा कि चित्र 6ई,एफ,जी में दिखाया गया है, नियंत्रण समूह की तुलना में, केवल बी(ए)पी उपचार समूह में एनआरएफ2 का स्तर कम हो गया था;हालाँकि, बी (ए) पी उपचार समूह की तुलना में, पीजी-आरजी 3 समूह में बी (ए) एनआरएफ 2 का स्तर बढ़ गया था (जी-आरजी 3 आर के लिए 106 ± 9.5% बनाम 51.3 ± 6.8%, 117 ± 6. 2% जी-आरजी3आर बनाम 41 ± 9.8% जी-आरजी3एस के लिए, पी <0.01)।
हमने विशिष्ट छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (siRNA) का उपयोग करके एनआरएफ2 अभिव्यक्ति को दबाकर एनआरएफ2 की निवारक भूमिका की पुष्टि की।वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एनआरएफ2 नॉकडाउन की पुष्टि की गई (चित्र 7ए,बी)।जैसा कि चित्र 7सी,डी में दिखाया गया है, बी(ए)पी और जी-आरजी3 के साथ एचईएल कोशिकाओं के सह-उपचार के परिणामस्वरूप बी(ए)पी के साथ उपचार की तुलना में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट्स की संख्या में कमी आई (1.47 ± 0.21) अकेले नियंत्रण siRNA समूह में।) G-Rg3r 4.13 ± 0.49 था, G-Rg3s 1.8 ± 0.32 और 4.1 ± 0.57, p < 0.01 था)।हालाँकि, BPDE-DNA गठन पर G-Rg3 का निरोधात्मक प्रभाव Nrf2 नॉकडाउन द्वारा समाप्त कर दिया गया था।SiNrf2 समूह में, B(a)P और G-Rg3 सह-उपचार और अकेले B(a)P उपचार के बीच BPDE-DNA जोड़ गठन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (G-Rg3r के लिए 3.0 ± 0.21 बनाम 3.56 ± 0.32) ).G-Rg3r के लिए बनाम 3.6 G-Rg3s के लिए बनाम ±0.45 बनाम 4.0±0.37, p > 0.05)।
एचईएल कोशिकाओं में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट गठन पर एनआरएफ2 नॉकडाउन का प्रभाव।(ए) एनआरएफ2 नॉकडाउन की पुष्टि वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा की गई थी।(बी) एनआरएफ2 बैंड तीव्रता की मात्रा का ठहराव।(सी) बी(ए)पी और जी-आरजी3आर से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट स्तरों पर एनआरएफ2 नॉकडाउन का प्रभाव।(डी) बी(ए)पी और जी-आरजी3 से उपचारित एचईएल कोशिकाओं में बीपीडीई-डीएनए एडक्ट स्तरों पर एनआरएफ2 नॉकडाउन का प्रभाव।डेटा को तीन प्रतियों के निर्धारण के माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।*पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001।
इस अध्ययन ने बी(ए)पी-प्रेरित फेफड़ों के कैंसर के एक माउस मॉडल पर विभिन्न लाल जिनसेंग अर्क के निवारक प्रभावों का मूल्यांकन किया, और केआरजीबी उपचार ने ट्यूमर के बोझ को काफी कम कर दिया।यह ध्यान में रखते हुए कि इस जिनसेंग अर्क में जी-आरजी3 की मात्रा सबसे अधिक है, ट्यूमरजेनिसिस को रोकने में इस जिनसेनोसाइड की महत्वपूर्ण भूमिका का अध्ययन किया गया है।G-Rg3r और G-Rg3 (G-Rg3 के दो एपिमर) दोनों ने B(a)P-प्रेरित कैंसर के एक माउस मॉडल में ट्यूमर के बोझ को काफी कम कर दिया।जी-आरजी3आर और जी-आरजी3 ट्यूमर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को प्रेरित करके, ट्यूमर के विकास को रोककर, कोशिका चक्र23 को रोककर और एंजियोजेनेसिस24 को प्रभावित करके कैंसर विरोधी प्रभाव डालते हैं।G-Rg3 को सेलुलर मेटास्टेसिस को रोकने के लिए भी दिखाया गया है, और कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी के प्रभाव को बढ़ाने के लिए G-Rg3 की क्षमता का दस्तावेजीकरण किया गया है।पून एट अल ने प्रदर्शित किया कि जी-आरजी3 उपचार बी(ए)पी28 के जीनोटॉक्सिक प्रभाव को कम कर सकता है।यह अध्ययन पर्यावरणीय कैंसरजन्य अणुओं को लक्षित करने और कैंसर को रोकने में जी-आरजी3 की चिकित्सीय क्षमता को प्रदर्शित करता है।
उनकी अच्छी रोगनिरोधी क्षमता के बावजूद, जिनसैनोसाइड्स की खराब मौखिक जैव उपलब्धता इन अणुओं के नैदानिक उपयोग के लिए एक चुनौती है।चूहों में जिनसैनोसाइड्स के मौखिक प्रशासन के फार्माकोकाइनेटिक विश्लेषण से पता चला है कि इसकी जैवउपलब्धता अभी भी 5%29 से कम है।इन परीक्षणों से पता चला कि 20 सप्ताह की उपचार अवधि के बाद, केवल Rg5 के रक्त स्तर में कमी आई।हालाँकि खराब जैवउपलब्धता के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया जाना बाकी है, लेकिन माना जाता है कि पी-जीपी जिनसैनोसाइड्स के प्रवाह में शामिल है।इस कार्य ने पहली बार प्रदर्शित किया कि वेरापामिल, एक पी-जीपी अवरोधक, के प्रशासन से जी-आरजी3आर और जी-आरजी3एस की मौखिक जैवउपलब्धता बढ़ जाती है।इस प्रकार, इस खोज से पता चलता है कि G-Rg3r और G-Rg3s इसके प्रवाह को विनियमित करने के लिए P-gp के सब्सट्रेट के रूप में कार्य करते हैं।
यह कार्य दर्शाता है कि वेरापामिल के साथ संयोजन उपचार से फेफड़ों के कैंसर के एक माउस मॉडल में जी-आरजी3 की मौखिक जैवउपलब्धता बढ़ जाती है।इस खोज को पी-जीपी नाकाबंदी पर जी-आरजी3 के बढ़े हुए आंतों के ट्रांससेलुलर परिवहन द्वारा समर्थित किया गया है, जिससे इसका अवशोषण बढ़ जाता है।Caco2 कोशिकाओं में परीक्षण से पता चला कि वेरापामिल उपचार ने झिल्ली पारगम्यता में सुधार करते हुए G-Rg3r और G-Rg3s के प्रवाह को कम कर दिया।यांग एट अल द्वारा एक अध्ययन।अध्ययनों से पता चला है कि साइक्लोस्पोरिन ए (एक अन्य पी-जीपी अवरोधक) के साथ उपचार से जिनसैनोसाइड आरएच2 की जैवउपलब्धता 1%20 के आधारभूत मूल्य से बढ़कर 30% से अधिक हो जाती है।जिनसैनोसाइड्स यौगिक K और Rg1 ने भी समान परिणाम 30,31 दिखाए।जब वेरापामिल और साइक्लोस्पोरिन ए को सह-प्रशासित किया गया, तो काको-2 कोशिकाओं में यौगिक K का प्रवाह 26.6 से घटकर 3 से भी कम हो गया, जबकि इसका इंट्रासेल्युलर स्तर 40 गुना बढ़ गया।वेरापामिल की उपस्थिति में, चूहे के फेफड़े की उपकला कोशिकाओं में आरजी1 का स्तर बढ़ गया, जिससे जिनसैनोसाइड इफ्लक्स में पी-जीपी की भूमिका का पता चलता है, जैसा कि मेंग एट अल.31 द्वारा दिखाया गया है।हालाँकि, वेरापामिल का कुछ जिनसैनोसाइड्स (जैसे Rg1, F1, Rh1 और Re) के प्रवाह पर समान प्रभाव नहीं था, यह दर्शाता है कि वे P-gp सब्सट्रेट्स से प्रभावित नहीं हैं, जैसा कि लिआंग एट अल द्वारा दिखाया गया है।32 .यह अवलोकन अन्य ट्रांसपोर्टरों और वैकल्पिक जिनसैनोसाइड संरचनाओं की भागीदारी से संबंधित हो सकता है।
कैंसर पर G-Rg3 के निवारक प्रभाव का तंत्र स्पष्ट नहीं है।पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जी-आरजी3 ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम करके डीएनए क्षति और एपोप्टोसिस को रोकता है, जो बी (ए) पी-प्रेरित ट्यूमरजेनिसिस को रोकने के लिए अंतर्निहित तंत्र हो सकता है।कुछ रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि बी(ए)पी द्वारा प्रेरित जीनोटॉक्सिसिटी को बीपीडीई-डीएनए34 बनाने के लिए चरण II एंजाइमों को संशोधित करके कम किया जा सकता है।जीएसटी एक विशिष्ट चरण II एंजाइम है जो जीएसएच को बीपीडीई से जोड़ने को बढ़ावा देकर बीपीडीई-डीएनए एडक्ट गठन को रोकता है, जिससे बी (ए) पी 35 द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति को कम किया जाता है।हमारे परिणाम बताते हैं कि जी-आरजी3 उपचार एचईएल कोशिकाओं में बी(ए)पी-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी और बीपीडीई-डीएनए एडक्ट गठन को कम करता है और इन विट्रो में जीएसटी अभिव्यक्ति और गतिविधि को बहाल करता है।हालाँकि, ये प्रभाव Nrf2 की अनुपस्थिति में अनुपस्थित थे, यह सुझाव देते हुए कि G-Rg3 Nrf2 मार्ग के माध्यम से साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव उत्पन्न करता है।एनआरएफ2 चरण II विषहरण एंजाइमों के लिए एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है जो ज़ेनोबायोटिक्स36 की निकासी को बढ़ावा देता है।Nrf2 मार्ग का सक्रियण साइटोप्रोटेक्शन को प्रेरित करता है और ऊतक क्षति को कम करता है।इसके अलावा, कई रिपोर्टों ने कार्सिनोजेनेसिस38 में ट्यूमर दमनकर्ता के रूप में एनआरएफ2 की भूमिका का समर्थन किया है।हमारे अध्ययन से पता चलता है कि जी-आरजी3 द्वारा एनआरएफ2 मार्ग का प्रेरण चरण II एंजाइमों को सक्रिय करके बी(ए)पी विषहरण का कारण बनकर बी(ए)पी-प्रेरित जीनोटॉक्सिसिटी में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाता है, जिससे ट्यूमरजेनिसिस प्रक्रिया बाधित होती है।
हमारा काम जिनसेनोसाइड जी-आरजी3 की महत्वपूर्ण भागीदारी के माध्यम से चूहों में बी(ए)पी-प्रेरित फेफड़ों के कैंसर को रोकने में लाल जिनसेंग की क्षमता का खुलासा करता है।इस अणु की खराब मौखिक जैवउपलब्धता इसके नैदानिक अनुप्रयोग में बाधा उत्पन्न करती है।हालाँकि, यह अध्ययन पहली बार दिखाता है कि जी-आरजी3 पी-जीपी का एक सब्सट्रेट है, और पी-जीपी अवरोधक के प्रशासन से इन विट्रो और विवो में जी-आरजी3 की जैवउपलब्धता बढ़ जाती है।जी-आरजी3 एनआरएफ2 मार्ग को विनियमित करके बी(ए)पी-प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को कम करता है, जो इसके निवारक कार्य के लिए एक संभावित तंत्र हो सकता है।हमारा अध्ययन फेफड़ों के कैंसर की रोकथाम और उपचार के लिए जिनसैनोसाइड जी-आरजी3 की क्षमता की पुष्टि करता है।
छह सप्ताह की मादा ए/जे चूहे (20 ± 1 ग्राम) और 7 सप्ताह के नर विस्टार चूहे (250 ± 20 ग्राम) जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, यूएसए) और वुहान इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी से प्राप्त किए गए थे।विश्वविद्यालय (वुहान, चीन)।चाइनीज टाइप कल्चर कलेक्शन सेंटर (वुहान, चीन) ने हमें काको-2 और एचईएल सेल प्रदान किए।सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, यूएसए) बी(ए)पी और ट्राईकैप्रिन का एक स्रोत है।शुद्ध जिनसैनोसाइड्स जी-आरजी3आर और जी-आरजी3एस, डाइमिथाइल सल्फोऑक्साइड (डीएमएसओ), सेलटाइटर-96 प्रसार परख किट (एमटीएस), वेरापामिल, न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम), और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) चेंगदू मस्ट बायो-टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। .कंपनी लिमिटेड।(चेंगदू, चीन)।QIAamp DNA मिनी किट और BPDE-DNA एडक्ट एलिसा किट Qiagen (स्टैनफोर्ड, CA, USA) और सेल बायोलैब्स (सैन डिएगो, CA, USA) से खरीदे गए थे।जीएसटी गतिविधि परख किट और कुल प्रोटीन परख किट (मानक बीसीए विधि) सोलरबियो (बीजिंग, चीन) से खरीदे गए थे।सभी लाल जिनसेंग अर्क मिंग्यु प्रयोगशाला में संग्रहीत हैं। हांगकांग बैपटिस्ट यूनिवर्सिटी (हांगकांग, चीन) और कोरिया कैंसर सेंटर (सियोल, कोरिया) सीआरजी अर्क और विभिन्न कोरियाई मूल (केआरजीए, केआरजीबी सहित) के विभिन्न लाल जिनसेंग अर्क के वाणिज्यिक स्रोत हैं। और केआरजीसी)।लाल जिनसेंग 6 साल पुराने ताजा जिनसेंग की जड़ों से बनाया जाता है।लाल जिनसेंग अर्क जिनसेंग को तीन बार पानी से धोने, फिर जलीय अर्क को केंद्रित करने और अंत में कम तापमान पर सुखाने से जिनसेंग अर्क पाउडर प्राप्त करने के लिए प्राप्त किया जाता है।एंटीबॉडीज (एंटी-एनआरएफ2, एंटी-जीएसटी, और β-एक्टिन), हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी), ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक, नियंत्रण सीआरएनए, और एनआरएफ2 सीआरएनए सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए) से खरीदे गए थे। .), यूएसए)।
Caco2 और hEL कोशिकाओं को 5% CO2 के आर्द्र वातावरण में 37 ° C पर 10% FBS वाले MEM के साथ 100 मिमी 2 सेल कल्चर डिश में संवर्धित किया गया।उपचार स्थितियों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, एचईएल कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए एमईएम में बी (ए) पी और जी-आरजी 3 की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था।कोशिका-मुक्त अर्क तैयार करने के लिए कोशिकाओं का और अधिक विश्लेषण या संग्रह किया जा सकता है।
सभी प्रयोगों को टोंगजी मेडिकल कॉलेज की प्रायोगिक पशु आचार समिति, हुआज़होंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या 2019; पंजीकरण संख्या 4587TH) द्वारा अनुमोदित किया गया था।सभी प्रयोग प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किए गए थे, और अध्ययन पशु अनुसंधान: इन विवो प्रयोगों (ARRIVE) दिशानिर्देशों की रिपोर्टिंग के अनुसार आयोजित किया गया था।आठ सप्ताह के ए/जे चूहों को पहले ट्राइकैप्रिन घोल (100 मिलीग्राम/किग्रा, 0.2 मिली) में बी(ए)पी का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन लगाया गया।एक सप्ताह के बाद, चूहों को बेतरतीब ढंग से नियंत्रण समूहों और विभिन्न उपचार समूहों में विभाजित किया गया, प्रत्येक समूह में 15 चूहे, और दिन में एक बार उनकी जांच की गई।20 सप्ताह के उपचार के बाद, CO2 श्वासावरोध से जानवरों की बलि दे दी गई।फेफड़ों को एकत्र कर 24 घंटे के लिए ठीक किया गया।एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक फेफड़े के लिए सतही ट्यूमर की संख्या और व्यक्तिगत ट्यूमर के आकार की मात्रा निर्धारित की गई।ट्यूमर की मात्रा का अनुमान (V) की गणना निम्नलिखित अभिव्यक्ति का उपयोग करके की गई: V (mm3) = 4/3πr3, जहां r ट्यूमर का व्यास है।चूहों के फेफड़ों में सभी ट्यूमर की मात्रा का शुद्ध योग कुल ट्यूमर की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक समूह में औसत कुल ट्यूमर की मात्रा ट्यूमर भार का प्रतिनिधित्व करती है।यूपीएलसी-एमएस/एमएस निर्धारण के लिए संपूर्ण रक्त और आंतों के नमूने एकत्र किए गए और -80°C पर संग्रहीत किए गए।सीरम एकत्र किया गया था और यकृत और गुर्दे के कार्य का आकलन करने के लिए एलानिन एमिनोट्रांस्फरेज़ (एएलटी) और सीरम क्रिएटिनिन (सीआर) स्तरों का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित रसायन विश्लेषक का उपयोग किया गया था।
एकत्रित नमूनों को कोल्ड स्टोरेज से निकाला गया, पिघलाया गया, तौला गया और ऊपर वर्णित अनुसार ट्यूबों में रखा गया।इसमें 0.8 मिली मेथनॉल घोल में 0.5 μM फ़्लोरिज़िन (आंतरिक मानक) मिलाया गया था।फिर टिश्यू-टियरर का उपयोग करके ऊतक को समरूप बनाया गया और बाद में समरूप को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया।मिश्रण को 15 मिनट के लिए 15500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।1.0 मिली सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, नाइट्रोजन के साथ सुखाएं।पुनर्प्राप्ति के लिए दो सौ माइक्रोलीटर मेथनॉल का उपयोग किया गया था।रक्त को एक पंक्ति में एकत्र और संसाधित किया जाता है और सभी मापों के लिए संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाता है।
वेरापामिल को शामिल करके जी-आरजी3 परिवहन की संभावित वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए 24-वेल ट्रांसवेल प्लेटों को प्रति कुएं 1.0 × 105 काको-2 कोशिकाओं के साथ जोड़ा गया था।3 सप्ताह के संवर्धन के बाद, कोशिकाओं को एचबीएसएस से धोया गया और 37°C पर प्रीइनक्यूबेट किया गया।10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, या 50 या 100 μM वेरापामिल के साथ मिश्रण) का 400 μL मोनोलेयर के बेसोलैटरल या एपिकल पक्ष पर इंजेक्ट किया गया था, और 600 μL HBSS समाधान दूसरे में जोड़ा गया था। ओर।निर्दिष्ट समय (0, 15, 30, 45, 60, 90 और 120 मिनट) पर संस्कृति माध्यम के 100 μl एकत्र करें और इस मात्रा को बनाने के लिए 100 μl HBSS जोड़ें।यूपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा पता लगाए जाने तक नमूने -4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे।अभिव्यक्ति Papp = dQ/(dT × A × C0) का उपयोग स्पष्ट यूनिडायरेक्शनल एपिकल और बेसोलेटरल पारगम्यता और इसके विपरीत (क्रमशः Pa-b और Pb-a) को मापने के लिए किया जाता है;dQ/dT एकाग्रता में परिवर्तन है, A (0.6 सेमी2) मोनोलेयर का सतह क्षेत्र है, और C0 प्रारंभिक दाता एकाग्रता है।प्रवाह अनुपात की गणना Pb-a/Pa-b के रूप में की जाती है, जो अध्ययन दवा की प्रवाह दर को दर्शाता है।
नर विस्टार चूहों को 24 घंटे तक उपवास रखा गया, केवल पानी पिया गया और 3.5% पेंटोबार्बिटल घोल के अंतःशिरा इंजेक्शन से बेहोश किया गया।इंटुबेटेड सिलिकॉन ट्यूब में प्रवेश द्वार के रूप में ग्रहणी का अंत और निकास के रूप में इलियम का अंत होता है।0.1 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर आइसोटोनिक एचबीएसएस में 10 माइक्रोएम जी-आरजी3आर या जी-आरजी3एस के साथ इनलेट को पंप करने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें।वेरापामिल के प्रभाव का मूल्यांकन 10 μM G-Rg3r या G-Rg3s में 50 μM या 100 μM यौगिक जोड़कर किया गया था।यूपीएलसी-एमएस/एमएस का प्रदर्शन छिड़काव शुरू होने के बाद समय बिंदु 60, 90, 120 और 150 मिनट पर एकत्र किए गए छिड़काव अर्क पर किया गया था।अवशोषण का प्रतिशत सूत्र द्वारा निर्धारित किया जाता है % अवशोषण = (1 - Cout/Cin) × 100%;आउटलेट और इनलेट पर G-Rg3 की सांद्रता क्रमशः Cout और Cin द्वारा व्यक्त की जाती है।
एचईएल कोशिकाओं को प्रति कुएं 1 × 104 कोशिकाओं के घनत्व पर 96-वेल प्लेटों में डाला गया और डीएमएसओ में भंग बी (ए) पी (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) या जी-आरजी 3 के साथ इलाज किया गया। .फिर दवाओं को 48 घंटों में विभिन्न सांद्रता (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) में संस्कृति माध्यम से पतला किया गया।व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमटीएस परख किट का उपयोग करके, कोशिकाओं को एक मानक प्रोटोकॉल के अधीन किया गया और फिर 490 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया।बी(ए)पी (10 μM) और G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) के साथ सह-उपचारित समूहों के सेल व्यवहार्यता स्तर का मूल्यांकन उपरोक्त विधि के अनुसार किया गया था और अनुपचारित समूह के साथ तुलना की गई थी।
एचईएल कोशिकाओं को 1 × 105 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर 6-वेल प्लेटों में डाला गया और 10 μM G-Rg3 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 10 μMB(a)P के साथ इलाज किया गया।48 घंटे के उपचार के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार QIAamp डीएनए मिनी किट का उपयोग करके एचईएल कोशिकाओं से डीएनए निकाला गया।बीपीडीई-डीएनए एडडक्ट्स के गठन का पता बीपीडीई-डीएनए एडडक्ट एलिसा किट का उपयोग करके लगाया गया था।बीपीडीई-डीएनए एडक्ट के सापेक्ष स्तर को 450 एनएम पर अवशोषण को मापकर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था।
एचईएल कोशिकाओं को प्रति कुएं 1 × 104 कोशिकाओं के घनत्व पर 96-वेल प्लेटों में डाला गया और 48 घंटे के लिए 10 μM जी-आरजी 3 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 10 μMB (ए) पी के साथ इलाज किया गया।निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जीएसटी गतिविधि को वाणिज्यिक जीएसटी गतिविधि परख किट का उपयोग करके मापा गया था।सापेक्ष जीएसटी सक्रियण को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर अवशोषण द्वारा मापा गया था।
एचईएल कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोया गया और फिर प्रोटीज इनहिबिटर और फॉस्फेटस इनहिबिटर युक्त रेडियोइम्यूनोप्रेसिपिटेशन परख बफर का उपयोग करके लाइज़ किया गया।कुल प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के बाद, प्रत्येक नमूने में 30 μg प्रोटीन को 12% एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया।झिल्लियों को 5% मलाई रहित दूध से अवरुद्ध किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया।हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, बाइंडिंग सिग्नल को देखने के लिए उन्नत केमिलुमिनसेंस अभिकर्मकों को जोड़ा गया था।ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक प्रोटीन बैंड की तीव्रता निर्धारित की गई थी।
सभी डेटा का विश्लेषण करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म 7.0 सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था, जिसे माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया था।उपचार समूहों के बीच भिन्नता का मूल्यांकन छात्र के टी परीक्षण या भिन्नता के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था, जिसमें पी मान <0.05 सांख्यिकीय महत्व दर्शाता है।
इस अध्ययन के दौरान प्राप्त या विश्लेषण किए गए सभी डेटा इस प्रकाशित लेख और पूरक सूचना फ़ाइलों में शामिल हैं।
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पोस्ट करने का समय: सितम्बर-17-2023