Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koji koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje rezultate preporučujemo korištenje novije verzije preglednika (ili isključivanje načina rada kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Crveni ginseng koristi se u tradicionalnoj azijskoj medicini stotinama godina.U ovoj smo studiji procijenili sposobnost četiriju vrsta crvenog ginsenga (kineski crveni ginseng, korejski crveni ginseng A, korejski crveni ginseng B i korejski crveni ginseng C) uzgojenih u različitim regijama da inhibiraju stvaranje i rast karcinogeno induciranih pluća tumori.Test s benzo(a)pirenom (B(a)P) proveden je na A/J miševima i pokazalo se da je korejski crveni ginseng B najučinkovitiji u smanjenju opterećenja tumorom među četiri vrste crvenog ginsenga.Osim toga, analizirali smo sadržaj različitih ginsenozida (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5) u četiri ekstrakta crvenog ginsenga i otkrili da korejski crveni ginseng B ima najviše razine ginsenosida Rg3 (G-Rg3), što sugerira da bi G-Rg3 mogao igrati važnu ulogu u njegovoj terapijskoj učinkovitosti.Ovaj rad pokazuje da G-Rg3 ima relativno nisku bioraspoloživost.Međutim, kada je G-Rg3 primijenjen istodobno s inhibitorom P-gp verapamilom, efluks G-Rg3 u Caco-2 stanice je smanjen, stopa intestinalne apsorpcije G-Rg3 je povećana u modelu štakora, a G-Rg3 bio povećan.U stanicama Caco-2 smanjuje se odljev Rg3, a smanjuje se razina koncentracije Rg3.G-Rg3 je povećan u crijevima i plazmi, a njegova sposobnost da spriječi tumore je također poboljšana u štakorskom modelu B(a)P-inducirane tumorigeneze.Također smo otkrili da G-Rg3 smanjuje citotoksičnost izazvanu B(a)P i stvaranje adukta DNA u stanicama ljudskih pluća, te obnavlja ekspresiju i aktivnost enzima faze II putem Nrf2 puta, što može biti povezano s potencijalnim mehanizmom djelovanja G inhibicije -Rg3..O nastanku tumora pluća.Naša studija pokazuje potencijalno važnu ulogu G-Rg3 u ciljanju tumora pluća u modelima miševa.Oralna bioraspoloživost ovog ginsenosida je poboljšana ciljanjem na P-glikoprotein, omogućujući molekuli da ispoljava antikancerogene učinke.
Najčešći tip raka pluća je rak pluća nemalih stanica (NSCLC), koji je jedan od vodećih uzroka smrti od raka u Kini i Sjevernoj Americi1,2.Glavni čimbenik koji povećava rizik od razvoja raka pluća nemalih stanica je pušenje.Cigaretni dim sadrži više od 60 kancerogenih tvari, uključujući benzo(a)piren (B(a)P), nitrozamine i radioaktivne izotope od raspadanja radona.3 Policiklički aromatski ugljikovodici B(a)P glavni su uzrok toksičnosti u cigaretama dim.Nakon izlaganja B(a)P, citokrom P450 ga pretvara u B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid (BPDE), koji reagira s DNK i tvori adukt BPDE-DNA 4. Dodatno, ovi adukti induciraju tumorigenezu pluća u miševa sa stadijem tumora i histopatologijom sličnom ljudskim tumorima pluća5.Ova značajka čini B(a)P-inducirani model raka pluća prikladnim sustavom za procjenu spojeva s mogućim antikancerogenim svojstvima.
Jedna od mogućih strategija za sprječavanje razvoja raka pluća u visokorizičnim skupinama, posebice pušačima, je uporaba kemopreventivnih sredstava za suzbijanje razvoja intraepitelnih neoplastičnih lezija i time sprječavanje njihove naknadne progresije u malignu bolest.Studije na životinjama pokazuju da su različiti kemopreventivni agensi učinkoviti6.Naše prethodno izvješće7 istaknulo je dobre preventivne učinke crvenog ginsenga na rak pluća.Ova se biljka stoljećima koristila u tradicionalnoj azijskoj medicini za produljenje života i zdravlja, a dokumentirano je i njezino antitumorsko djelovanje8.
Aktivni faktor ginsenga je ginsenozid, koji se koristi kao kompozitni marker za ocjenu kvalitete ekstrakata ginsenga.Kvantitativna analiza sirovih ekstrakata ginsenga obično uključuje upotrebu nekoliko ginsenozida, uključujući RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 i Rc9,10.Ginsenozidi imaju malu kliničku primjenu zbog svoje vrlo niske oralne bioraspoloživosti11.Iako mehanizam ove slabe bioraspoloživosti nije jasan, uzrok može biti istjecanje ginsenozida uzrokovano P-glikoproteinom (P-gp)12.P-gp je jedan od najvažnijih efluksnih prijenosnika u superporodici prijenosnika kazete koja veže ATP, koja koristi energiju hidrolize ATP-a za otpuštanje unutarstaničnih tvari u vanjski okoliš.P-gp prijenosnici obično su široko rasprostranjeni u crijevima, bubrezima, jetri i krvno-moždanoj barijeri13.P-gp igra ključnu ulogu u crijevnoj apsorpciji, a inhibicija P-gp povećava oralnu apsorpciju i dostupnost nekih lijekova protiv raka12,14.Primjeri inhibitora prethodno korištenih u literaturi su verapamil i ciklosporin A15.Ovaj rad uključuje uspostavljanje mišjeg sustava za proučavanje B(a)P-induciranog raka pluća kako bi se procijenila sposobnost različitih ekstrakata crvenog ginsenga iz Kine i Koreje da utječu na zloćudne bolesti.Ekstrakti su pojedinačno analizirani kako bi se identificirali specifični ginsenozidi koji mogu utjecati na karcinogenezu.Verapamil je zatim korišten za ciljanje P-gp-a i poboljšanje oralne bioraspoloživosti i terapeutske učinkovitosti ginsenozida koji ciljaju na rak.
Mehanizam kojim saponini ginsenga ostvaruju terapeutske učinke na karcinogenezu ostaje nejasan.Istraživanja su pokazala da različiti ginsenozidi mogu smanjiti oštećenje DNK uzrokovano karcinogenima smanjujući oksidativni stres i aktivirajući enzime detoksikacije faze II, čime se sprječava oštećenje stanica.Glutation S-transferaza (GST) tipičan je enzim faze II koji je potreban za smanjenje oštećenja DNA uzrokovanog karcinogenima17.Nuklearni eritroidni 2-srodni faktor 2 (Nrf2) važan je faktor transkripcije koji regulira redoks homeostazu i aktivira ekspresiju enzima faze II i citoprotektivne antioksidativne odgovore18.Naša studija također je ispitivala učinke identificiranih ginsenozida na smanjenje citotoksičnosti izazvane B(a)P i stvaranje adukta BPDE-DNA, kao i induciranje enzima faze II moduliranjem puta Nrf2 u normalnim stanicama pluća.
Uspostavljanje mišjeg modela raka izazvanog B(a)P u skladu je s prethodnim radom5.Slika 1A prikazuje eksperimentalni dizajn 20-tjednog liječenja mišjeg modela raka izazvanog B(a)P, vodom (kontrola), ekstraktom kineskog crvenog ginsenga (CRG), ekstraktom korejskog crvenog ginsenga A (KRGA) i korejskim crvenim ginseng.Ekstrakt B (KRGB) i ekstrakt korejskog crvenog ginsenga C (KRGC).Nakon 20 tjedana liječenja crvenim ginsengom, miševi su žrtvovani gušenjem CO2.Slika 1B prikazuje makroskopske tumore pluća kod životinja liječenih različitim vrstama crvenog ginsenga, a slika 1C prikazuje reprezentativnu svjetlosnu mikrografiju uzorka tumora.Opterećenje tumorom kod životinja liječenih KRGB-om (1,5 ± 0,35) bilo je niže nego kod kontrolnih životinja (0,82 ± 0,2, P < 0,05), kao što je prikazano na slici 1D.Prosječni stupanj inhibicije tumorskog opterećenja bio je 45%.Drugi ispitani ekstrakti crvenog ginsenga nisu pokazali tako značajne promjene u opterećenju tumorom (P > 0,05).Nisu primijećene očite nuspojave u mišjem modelu tijekom 20 tjedana liječenja crvenim ginsengom, uključujući nikakvu promjenu tjelesne težine (podaci nisu prikazani) i nikakvu toksičnost za jetru ili bubrege (Slika 1E,F).
Ekstrakt crvenog ginsenga liječi razvoj tumora pluća kod A/J miševa.(A) Eksperimentalni dizajn.(B) Veliki tumori pluća u mišjem modelu.Tumori su označeni strelicama.a: skupina kineskog crvenog ginsenga.b: grupa A korejskog crvenog ginsenga.c: Korejski crveni ginseng skupina B. d: Korejski crveni ginseng skupina C. d: Kontrolna skupina.(C) Svjetlosni mikrograf koji prikazuje tumor pluća.Povećanje: 100. b: 400. (D) Opterećenje tumora u skupini ekstrakta crvenog ginsenga.(E) Razine jetrenog enzima ALT u plazmi.(F) Razine bubrežnog enzima Cr u plazmi.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.*P <0,05.
Ekstrakti crvenog ginsenga identificirani u ovoj studiji analizirani su ultraučinkovitom tekućinskom kromatografijom tandem masene spektrometrije (UPLC-MS/MS) kako bi se kvantificirali sljedeći ginsenozidi: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5.Uvjeti UPLC i MS korišteni za mjerenje analita opisani su u prethodnom izvješću19.UPLC-MS/MS kromatogrami četiriju ekstrakta crvenog ginsenga prikazani su na slici 2A.Postojale su značajne razlike u ukupnom sadržaju ginsenozida, s najvećim ukupnim sadržajem ginsenozida u CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Slika 2B).Pri procjeni pojedinačnih ginsenozida (Slika 2C), KRGB je pokazao najvišu razinu G-Rg3 u usporedbi s drugim ginsenozidima (58,33 ± 3,81 μmol/L za G-Rg3s i 41,56 ± 2,88 μmol/L za G -Rg3r).L).tip crvenog ginsenga (P < 0,001).G-Rg3 pojavljuje se kao par stereoizomera G-Rg3r i G-Rg3s, koji se razlikuju po položaju hidroksilne skupine na ugljiku 20 (slika 2D).Rezultati pokazuju da G-Rg3r ili G-Rg3 mogu imati važan antikancerogeni potencijal u mišjem modelu raka izazvanom B(a)P.
Sadržaj ginsenozida u raznim ekstraktima crvenog ginsenga.(A) UPLC-MS/MS kromatogrami četiri ekstrakta crvenog ginsenga.(B) Procjena ukupnog sadržaja ginsenozida u navedenim ekstraktima.(C) Detekcija pojedinačnih ginsenozida u označenim ekstraktima.(D) Strukture stereoizomera ginsenosida G-Rg3r i G-Rg3s.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.***P <0,001.
Studija UPLC-MS/MS zahtijevala je kvantifikaciju ginsenozida u uzorcima crijeva i krvi nakon 20 tjedana liječenja.Tretman KRGB-om pokazao je prisutnost samo 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 u krvi.Nisu otkriveni nikakvi preostali ginsenozidi, što ukazuje na slabu oralnu bioraspoloživost i stoga smanjenu izloženost tim ginsenozidima.
Stanična linija adenokarcinoma debelog crijeva Caco-2 morfološki je i biokemijski slična ljudskim crijevnim epitelnim stanicama, pokazujući svoju korisnost u procjeni transporta enterocita kroz intestinalnu epitelnu barijeru.Ova se analiza temeljila na ranijoj studiji 20 .Slike 3A, B, C, D, E, F prikazuju reprezentativne slike transcelularnog transporta G-Rg3r i G-Rg3 korištenjem Caco-2 monoslojnog modela.Transcelularni transport G-Rg3r ili G-Rg3 preko monoslojeva Caco-2 od bazolateralne do apikalne strane (Pb-a) bio je značajno veći nego od apikalne do bazolateralne strane (Pa-b).Za G-Rg3r, srednja vrijednost Pa-b bila je 0,38 ± 0,06, koja se povećala na 0,73 ± 0,06 nakon tretmana s 50 μmol/L verapamila i na 1,14 ± 0,09 nakon tretmana s 100 μmol/L verapamila (p < 0,01 i 0,001, redom; Slika 2).3A).Promatranja za G-Rg3 slijedila su sličan obrazac (slika 3B), a rezultati su pokazali da je liječenje verapamilom poboljšalo transport G-Rg3r i G-Rg3.Liječenje verapamilom također je rezultiralo značajnim smanjenjem srednjih omjera efluksa Pb-a i G-Rg3r i G-Rg3s (Slika 3C, D, E, F), što ukazuje da liječenje verapamilom smanjuje sadržaj ginsenozida u Caco-2 efluksnim stanicama..
Transcelularni transport G-Rg3 u monoslojevima Caco-2 i intestinalna apsorpcija u testu perfuzije štakora.(A) Pa-b vrijednost skupine G-Rg3r u monosloju Caco-2.(B) Pa-b vrijednost G-Rg3s skupina u Caco-2 monosloju.(C) Pb vrijednost skupine G-Rg3r u monosloju Caco-2.(D) Pb vrijednost G-Rg3s skupina u Caco-2 monosloju.(E) Omjer prinosa G-Rg3r skupina u Caco-2 monosloju.(F) Omjer prinosa G-Rg3 skupina u Caco-2 monosloju.(G) Postotak intestinalne apsorpcije G-Rg3r u perfuzijskom testu u štakora.(H) Postotak intestinalne apsorpcije G-Rg3 u perfuzijskom testu kod štakora.Propusnost i apsorpcija uspoređivani su bez dodatka verapamila.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija pet neovisnih eksperimenata.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
U skladu s ranijim radom20, izvedena je ortotopna intestinalna perfuzija štakora kako bi se utvrdilo povećava li se apsorpcija G-Rg3 u crijevima nakon liječenja verapamilom.Slike 3G,H prikazuju reprezentativne testove perfuzije za procjenu postotka intestinalne apsorpcije G-Rg3r i G-Rg3 kod štakora modela raka tijekom gore navedenih vremenskih razdoblja.Početni postotak slabog unosa G-Rg3r od približno 10% porastao je na više od 20% nakon tretmana s 50 µM verapamila i na više od 25% nakon tretmana sa 100 µM verapamila.Slično, G-Rg3, koji je imao početni unos od 10%, također je pokazao vrhunac od preko 20% nakon tretmana s 50 µM verapamila i gotovo 30% nakon tretmana sa 100 µM verapamila, što sugerira da inhibicija P-gp-a verapamilom pojačava intestinalna G-apsorpcija Rg3 u mišjem modelu raka pluća.
Prema gornjoj metodi, B(a)P-inducirani model miševa raka nasumično je podijeljen u šest skupina, kao što je prikazano na slici 4A.U skupini koja je primala G-Rg3 u usporedbi s kontrolnom skupinom (podaci nisu prikazani) nije primijećen značajan gubitak težine ili klinički znakovi toksičnosti.Nakon 20 tjedana tretmana, sakupljena su pluća svakog miša.Slika 4B prikazuje makroskopske tumore pluća kod miševa u gornjim skupinama za liječenje, a Slika 4C prikazuje reprezentativnu svjetlosnu mikrografiju reprezentativnog tumora.Što se tiče tumorskog opterećenja u svakoj skupini (slika 4D), vrijednosti za miševe tretirane s G-Rg3r i G-Rg3s bile su 0,75 ± 0,29 mm3 odnosno 0,81 ± 0,30 mm3, dok su vrijednosti za G miševe tretirane s -Rg3s bili su 1,63 odnosno ±0,40 mm3.kontrolnih miševa (p < 0,001), što ukazuje da je liječenje G-Rg3 smanjilo opterećenje tumorom kod miševa.Primjena verapamila dodatno je pojačala ovo smanjenje: vrijednosti u verapamil+ G-Rg3r miševa smanjile su se s 0,75 ± 0,29 mm3 na 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), a vrijednosti za verapamil+ s 0,81 ± 0,30 mm3 smanjile su se na 0,29 ± 0,21 mm3 u miševa tretiranih G. -Rg3s (p < 0,05), što ukazuje da verapamil može pojačati inhibicijski učinak G-Rg3 na tumorigenezu.Opterećenje tumorom nije pokazalo značajne razlike između kontrolne skupine i skupine koja je primala verapamil, skupine koja je primala G-Rg3r i skupine koja je primala G-Rg3s, te skupine koja je primala verapamil+G-Rg3r i skupine koja je primala verapamil+G-Rg3s.Štoviše, nije bilo značajnih toksičnih učinaka na jetru ili bubrege povezanih s procijenjenim tretmanima (Slika 4E, F).
Opterećenje tumorom nakon liječenja G-Rg3 i razine G-Rg3r i G-Rg3 u plazmi ili crijevu u navedenim skupinama.(A) Eksperimentalni dizajn.(B) Makroskopski tumori u modelu miša.Tumori su označeni strelicama.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r u kombinaciji s verapamilom.d: G-Rg3 u kombinaciji s verapamilom.d: Verapamil.e: kontrola.(C) Optička mikrografija tumora pri povećanju.Odgovor: 100x.b: 400X.(D) Učinak liječenja G-Rg3 + verapamilom na opterećenje tumorom u A/J miševa.(E) Razine jetrenog enzima ALT u plazmi.(F) Razine bubrežnog enzima Cr u plazmi.(G) Razine G-Rg3r ili G-Rg3 navedenih skupina u plazmi.(H) Razine G-Rg3r ili G-Rg3s u crijevima naznačenih skupina.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Razine G-Rg3 u modelu miševa s B(a)P-induciranim karcinomom procijenjene su pomoću UPLC-MS/MS nakon 20-tjednog perioda liječenja u skladu s metodom opisanom u odjeljku Metode.Slike 4G i H prikazuju razine G-Rg3 u plazmi i crijevu.Razine G-Rg3r u plazmi iznosile su 0,44 ± 0,32 μmol/L i porasle su na 1,17 ± 0,47 μmol/L uz istodobnu primjenu verapamila (p < 0,001), dok su razine G-Rg3r u crijevu bile 0,53 ± 0,08 µg/l.U kombinaciji s verapamilom, g se povećao na 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Za G-Rg3, rezultati su slijedili sličan obrazac, što ukazuje da je liječenje verapamilom povećalo oralnu bioraspoloživost G-Rg3 u A/J miševa.
Test vijabilnosti stanica korišten je za procjenu citotoksičnosti B(a)P i G-Rg3 na hEL stanicama.Citotoksičnost izazvana B(a)P u hEL stanicama prikazana je na slici 5A, dok su netoksična svojstva G-Rg3r i G-Rg3 prikazana na slikama 5A i 5B.5B, C. Za procjenu citoprotektivnog učinka G-Rg3, B(a)P je primijenjen zajedno s različitim koncentracijama G-Rg3r ili G-Rg3 u hEL stanice.Kao što je prikazano na slici 5D, G-Rg3r u koncentracijama od 5 µM, 10 µM i 20 µM vratio je vitalnost stanica na 58,3%, 79,3%, odnosno 77,3%.Slični se rezultati također mogu vidjeti u skupini G-Rg3s.Kada su koncentracije G-Rg3s bile 5 µM, 10 µM i 20 µM, vitalnost stanica je vraćena na 58,3%, 72,7% i 76,7%, respektivno (Slika 5E).).Prisutnost adukata BPDE-DNA mjerena je pomoću ELISA kita.Naši rezultati su pokazali da su razine BPDE-DNA adukta povećane u skupini liječenoj B(a)P u usporedbi s kontrolnom skupinom, ali u usporedbi s G-Rg3 kotretmanom, razine BPDE-DNA adukta u B(a)P skupini B u liječenoj skupini, razine DNA adukata bile su značajno smanjene.Rezultati liječenja samim B(a)P prikazani su na slici 5F (1,87 ± 0,33 naspram 3,77 ± 0,42 za G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 naspram 3,77 ± 0,42 za G -Rg3s, p < 0,001).
Preživljavanje stanica i stvaranje adukta BPDE-DNA u hEL stanicama tretiranim s G-Rg3 i B(a)P.(A) Viabilnost hEL stanica tretiranih s B(a)P.(B) Viabilnost hEL stanica tretiranih s G-Rg3r.(C) Viabilnost hEL stanica tretiranih s G-Rg3.(D) Preživljavanje hEL stanica tretiranih s B(a)P i G-Rg3r.(E) Viabilnost hEL stanica tretiranih s B(a)P i G-Rg3.(F) Razine BPDE-DNA adukta u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ekspresija enzima GST otkrivena je nakon zajedničkog liječenja s 10 μM B(a)P i 10 μM G-Rg3r ili G-Rg3s.Naši rezultati su pokazali da B(a)P potiskuje ekspresiju GST (59,7 ± 8,2% u skupini G-Rg3r i 39 ± 4,5% u skupini G-Rg3s), a B(a)P je bio povezan ili s G-Rg3r , ili s G-Rg3r, ili s G-Rg3r.Zajednički tretman s G-Rg3s vratio je ekspresiju GST-a.Ekspresija GST (103,7 ± 15,5% u skupini G-Rg3r i 110 ± 11,1% u skupini G-Rg3s, p < 0,05 i p < 0,001, redom, sl. 6A, B i C).Aktivnost GST-a procijenjena je pomoću pribora za ispitivanje aktivnosti.Naši rezultati su pokazali da je skupina koja je primala kombinirano liječenje imala veću GST aktivnost u usporedbi sa skupinom koja je primala samo B(a)P (96,3 ± 6,6% naspram 35,7 ± 7,8% u skupini koja je primala G-Rg3r naspram 92,3 ± 6,5 u skupini koja je primala G-Rg3r ).% naspram 35,7 ± 7,8 % u skupini G-Rg3s, p < 0,001, Slika 6D).
Ekspresija GST i Nrf2 u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3.(A) Detekcija GST ekspresije Western blotom.(B) Kvantitativna ekspresija GST u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3r.(C) Kvantitativna ekspresija GST u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3s.(D) GST aktivnost u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3.(E) Detekcija ekspresije Nrf2 Western blotom.(F) Kvantitativna ekspresija Nrf2 u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3r.(G) Kvantitativna ekspresija Nrf2 u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3s.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Kako bi se razjasnili putovi uključeni u G-Rg3-posredovanu supresiju B(a)P-inducirane tumorigeneze, ekspresija Nrf2 procijenjena je Western blottingom.Kao što je prikazano na slikama 6E, F, G, u usporedbi s kontrolnom skupinom, smanjena je samo razina Nrf2 u skupini koja je primala B(a)P;međutim, u usporedbi sa skupinom liječenom B(a)P, razine B(a) Nrf2 u skupini PG-Rg3 bile su povećane (106 ± 9,5% za G-Rg3r u odnosu na 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% za G-Rg3r u odnosu na 41 ± 9,8% za G-Rg3s, p < 0,01).
Potvrdili smo preventivnu ulogu Nrf2 suzbijanjem ekspresije Nrf2 pomoću specifične male interferirajuće RNA (siRNA).Nokdaun Nrf2 potvrđen je Western blotom (Slika 7A,B).Kao što je prikazano na slikama 7C,D, zajednički tretman hEL stanica s B(a)P i G-Rg3 rezultirao je smanjenjem broja BPDE-DNA adukata (1,47 ± 0,21) u usporedbi s tretmanom s B(a)P sam u kontrolnoj skupini siRNA.) G-Rg3r bio je 4,13 ± 0,49, G-Rg3s bio je 1,8 ± 0,32 i 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Međutim, inhibicijski učinak G-Rg3 na stvaranje BPDE-DNA ukinut je nokdaunom Nrf2.U skupini siNrf2 nije bilo značajne razlike u stvaranju adukta BPDE-DNA između zajedničkog liječenja B(a)P i G-Rg3 i samog liječenja B(a)P (3,0 ± 0,21 za G-Rg3r naspram 3,56 ± 0,32 ).za G-Rg3r u odnosu na 3,6 za G-Rg3s u odnosu na ±0,45 u odnosu na 4,0±0,37, p > 0,05).
Učinak nokdauna Nrf2 na stvaranje adukta BPDE-DNA u hEL stanicama.(A) Nokdaun Nrf2 potvrđen je Western blotom.(B) Kvantifikacija intenziteta trake Nrf2.(C) Učinak nokdauna Nrf2 na razine adukta BPDE-DNA u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3r.(D) Učinak nokdauna Nrf2 na razine adukta BPDE-DNA u hEL stanicama tretiranim s B(a)P i G-Rg3.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija trostrukih određivanja.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ova studija procijenila je preventivne učinke različitih ekstrakata crvenog ginsenga na mišjem modelu raka pluća izazvanog B(a)P, a liječenje KRGB-om značajno je smanjilo opterećenje tumorom.S obzirom da G-Rg3 ima najveći sadržaj u ovom ekstraktu ginsenga, proučavana je važna uloga ovog ginsenosida u inhibiciji tumorigeneze.I G-Rg3r i G-Rg3 (dva epimera G-Rg3) značajno su smanjili opterećenje tumorom u mišjem modelu raka izazvanog B(a)P.G-Rg3r i G-Rg3 imaju antikancerogene učinke induciranjem apoptoze tumorskih stanica21, inhibicijom rasta tumora22, zaustavljanjem staničnog ciklusa23 i utjecajem na angiogenezu24.Također se pokazalo da G-Rg3 inhibira stanične metastaze25, a sposobnost G-Rg3 da pojačava učinke kemoterapije i radioterapije je dokumentirana26,27.Poon i suradnici pokazali su da liječenje G-Rg3 može smanjiti genotoksične učinke B(a)P28.Ova studija pokazuje terapeutski potencijal G-Rg3 u ciljanju karcinogenih molekula iz okoliša i prevenciji raka.
Unatoč njihovom dobrom profilaktičkom potencijalu, slaba oralna bioraspoloživost ginsenozida predstavlja izazov za kliničku upotrebu ovih molekula.Farmakokinetička analiza oralne primjene ginsenozida u štakora pokazala je da je njegova bioraspoloživost još uvijek manja od 5%29.Ovi testovi su pokazali da su se nakon 20-tjednog perioda liječenja smanjile samo razine Rg5 u krvi.Iako temeljni mehanizam slabe bioraspoloživosti tek treba razjasniti, smatra se da je P-gp uključen u efluks ginsenozida.Ovaj je rad po prvi put pokazao da primjena verapamila, blokatora P-gp-a, povećava oralnu bioraspoloživost G-Rg3r i G-Rg3s.Stoga ovo otkriće sugerira da G-Rg3r i G-Rg3s djeluju kao supstrati P-gp-a za regulaciju njegovog efluksa.
Ovaj rad pokazuje da kombinirano liječenje verapamilom povećava oralnu bioraspoloživost G-Rg3 u mišjem modelu raka pluća.Ovo otkriće podupire povećani intestinalni transcelularni transport G-Rg3 nakon blokade P-gp, čime se povećava njegova apsorpcija.Ispitivanja u stanicama Caco2 pokazala su da je liječenje verapamilom smanjilo efluks G-Rg3r i G-Rg3s dok je poboljšavala propusnost membrane.Studija koju su proveli Yang i sur.Studije su pokazale da liječenje ciklosporinom A (još jedan blokator P-gp) povećava bioraspoloživost ginsenosida Rh2 s početne vrijednosti od 1%20 na više od 30%.Ginsenozidni spojevi K i Rg1 također su pokazali slične rezultate30,31.Kada su verapamil i ciklosporin A primijenjeni zajedno, efluks spoja K u stanicama Caco-2 bio je značajno smanjen sa 26,6 na manje od 3, dok su se njegove unutarstanične razine povećale 40 puta30.U prisutnosti verapamila, razine Rg1 porasle su u epitelnim stanicama pluća štakora, što ukazuje na ulogu P-gp-a u efluksu ginsenozida, kao što su pokazali Meng i sur.31.Međutim, verapamil nije imao isti učinak na efluks nekih ginsenozida (kao što su Rg1, F1, Rh1 i Re), što ukazuje da na njih ne utječu supstrati P-gp, kao što su pokazali Liang i sur.32 .Ovo zapažanje može biti povezano s uključenošću drugih prijenosnika i alternativnih struktura ginsenozida.
Mehanizam preventivnog učinka G-Rg3 na rak nije jasan.Prethodne studije su pokazale da G-Rg3 sprječava oštećenje DNK i apoptozu smanjenjem oksidativnog stresa i upale16,33, što može biti temeljni mehanizam za sprječavanje tumorigeneze izazvane B(a)P.Neka izvješća pokazuju da se genotoksičnost izazvana B(a)P može smanjiti moduliranjem enzima faze II da se formira BPDE-DNA34.GST je tipični enzim faze II koji inhibira stvaranje adukta BPDE-DNA promicanjem vezanja GSH na BPDE, čime se smanjuje oštećenje DNA izazvano B(a)P35.Naši rezultati pokazuju da liječenje G-Rg3 smanjuje citotoksičnost izazvanu B(a)P i stvaranje adukta BPDE-DNA u hEL stanicama i obnavlja ekspresiju i aktivnost GST in vitro.Međutim, ti su učinci izostali u odsutnosti Nrf2, što sugerira da G-Rg3 izaziva citoprotektivne učinke putem Nrf2 puta.Nrf2 je glavni faktor transkripcije za enzime detoksikacije faze II koji potiče uklanjanje ksenobiotika36.Aktivacija puta Nrf2 inducira citoprotekciju i smanjuje oštećenje tkiva37.Štoviše, nekoliko je izvješća poduprlo ulogu Nrf2 kao supresora tumora u karcinogenezi38.Naša studija pokazuje da indukcija puta Nrf2 putem G-Rg3 igra važnu regulatornu ulogu u genotoksičnosti izazvanoj B(a)P izazivajući detoksikaciju B(a)P aktiviranjem enzima faze II, čime se inhibira proces tumorigeneze.
Naš rad otkriva potencijal crvenog ginsenga u prevenciji raka pluća izazvanog B(a)P-om kod miševa kroz važnu uključenost ginsenozida G-Rg3.Slaba oralna bioraspoloživost ove molekule otežava njezinu kliničku primjenu.Međutim, ova studija po prvi put pokazuje da je G-Rg3 supstrat P-gp-a, a primjena inhibitora P-gp-a povećava bioraspoloživost G-Rg3 in vitro i in vivo.G-Rg3 smanjuje citotoksičnost izazvanu B(a)P reguliranjem puta Nrf2, što može biti potencijalni mehanizam njegove preventivne funkcije.Naša studija potvrđuje potencijal ginsenozida G-Rg3 za prevenciju i liječenje raka pluća.
Šest tjedana stare ženke A/J miševa (20 ± 1 g) i 7 tjedana stari mužjaci Wistar štakora (250 ± 20 g) dobiveni su iz Laboratorija Jackson (Bar Harbor, SAD) i Instituta za zoologiju Wuhan.Sveučilište (Wuhan, Kina).Kineski centar za prikupljanje tipskih kultura (Wuhan, Kina) dao nam je Caco-2 i hEL stanice.Sigma-Aldrich (St. Louis, SAD) je izvor B(a)P i trikaprina.Pročišćeni ginsenozidi G-Rg3r i G-Rg3s, dimetil sulfoksid (DMSO), komplet za ispitivanje proliferacije CellTiter-96 (MTS), verapamil, minimalni esencijalni medij (MEM) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Chengdu Must Bio-Technology .Co, Ltd.(Chengdu, Kina).QIAamp DNA mini kit i BPDE-DNA adukt ELISA kit kupljeni su od Qiagena (Stanford, CA, SAD) i Cell Biolabs (San Diego, CA, SAD).Komplet za analizu GST aktivnosti i komplet za analizu ukupnog proteina (standardna BCA metoda) kupljeni su od Solarbio (Peking, Kina).Svi ekstrakti crvenog ginsenga pohranjeni su u Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Kina) i Korea Cancer Center (Seul, Koreja) komercijalni su izvori CRG ekstrakta i raznih ekstrakata crvenog ginsenga različitog korejskog podrijetla (uključujući KRGA, KRGB i KRGC).Crveni ginseng se pravi od korijena 6 godina starog svježeg ginsenga.Ekstrakt crvenog ginsenga dobiva se ispiranjem ginsenga vodom tri puta, zatim koncentriranjem vodenog ekstrakta, te na kraju sušenjem na niskoj temperaturi kako bi se dobio prah ekstrakta ginsenga.Protutijela (anti-Nrf2, anti-GST i β-aktin), anti-zečji imunoglobulin G (IgG) konjugiran s peroksidazom hrena, reagens za transfekciju, kontrolna siRNA i Nrf2 siRNA kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), SAD).
Stanice Caco2 i hEL uzgajane su u posudama za kulturu stanica od 100 mm2 s MEM-om koji sadrži 10% FBS na 37 °C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2.Kako bi se odredio učinak uvjeta liječenja, hEL stanice su inkubirane s različitim koncentracijama B(a)P i G-Rg3 u MEM-u tijekom 48 sati.Stanice se mogu dalje analizirati ili sakupiti za pripremu ekstrakata bez stanica.
Sve pokuse odobrilo je Povjerenstvo za etiku eksperimentalnih životinja Medicinskog fakulteta Tongji, Sveučilište znanosti i tehnologije Huazhong (br. odobrenja 2019; br. registracije 4587TH).Svi pokusi provedeni su u skladu s relevantnim smjernicama i propisima, a studija je provedena u skladu sa smjernicama Istraživanje na životinjama: Izvještavanje o pokusima in vivo (ARRIVE).Osmotjednim A/J miševima prvo je intraperitonealno ubrizgan B(a)P u otopini trikaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Nakon tjedan dana, miševi su nasumično podijeljeni u kontrolne skupine i različite skupine za liječenje, po 15 miševa u svakoj skupini, te im je davana sonda jednom dnevno.Nakon 20 tjedana tretmana, životinje su žrtvovane CO2 asfiksijom.Pluća su sakupljena i fiksirana 24 sata.Broj površinskih tumora i pojedinačne veličine tumora kvantificirani su za svako pluće pod disekcijskim mikroskopom.Procjene volumena tumora (V) izračunate su pomoću sljedećeg izraza: V (mm3) = 4/3πr3, gdje je r promjer tumora.Neto zbroj svih volumena tumora u plućima miševa predstavljao je ukupni volumen tumora, a prosječni ukupni volumen tumora u svakoj skupini predstavljao je opterećenje tumorom.Uzorci cijele krvi i crijeva prikupljeni su i pohranjeni na -80°C za UPLC-MS/MS određivanje.Prikupljen je serum i korišten je automatizirani kemijski analizator za analizu razina alanin aminotransferaze (ALT) i serumskog kreatinina (Cr) za procjenu funkcije jetre i bubrega.
Sakupljeni uzorci su izvađeni iz hladnog skladišta, odmrznuti, izvagani i stavljeni u epruvete kako je gore opisano.Tome je dodano 0,5 μM florizina (interni standard) u 0,8 ml otopine metanola.Tkivo je zatim homogenizirano pomoću Tissue-Tearor i homogenat je zatim prebačen u mikrocentrifugiranu epruvetu od 1,5 ml.Smjesa je centrifugirana na 15500 okretaja u minuti 15 minuta.Nakon uklanjanja 1,0 ml supernatanta, osušiti dušikom.Dvije stotine mikrolitara metanola korišteno je za obnavljanje.Krv se prikuplja i obrađuje na jednoj liniji i koristi se kao referenca za sva mjerenja.
Transwell ploče s 24 jažice zasijane su s 1,0 × 105 Caco-2 stanica po jažici kako bi se procijenilo potencijalno poboljšanje transporta G-Rg3 dodatkom verapamila.Nakon 3 tjedna kulture, stanice su isprane s HBSS i prethodno inkubirane na 37°C.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s ili mješavina s 50 ili 100 μM verapamila) ubrizgano je na bazolateralnu ili apikalnu stranu monosloja, a 600 μL HBSS otopine dodano je u drugu strana.Prikupite 100 µl medija kulture u naznačeno vrijeme (0, 15, 30, 45, 60, 90 i 120 minuta) i dodajte 100 µl HBSS-a kako biste nadoknadili ovaj volumen.Uzorci su pohranjeni na -4 °C do detekcije pomoću UPLC-MS/MS.Izraz Papp = dQ/(dT × A × C0) koristi se za kvantificiranje prividne jednosmjerne apikalne i bazolateralne propusnosti i obrnuto (Pa-b odnosno Pb-a);dQ/dT je promjena koncentracije, A (0,6 cm2) je površina monosloja, a C0 je početna koncentracija donora.Omjer efluksa izračunava se kao Pb-a/Pa-b, što predstavlja brzinu efluksa ispitivanog lijeka.
Muški štakori Wistar gladovani su 24 sata, pili su samo vodu i anestezirani intravenskom injekcijom 3,5% otopine pentobarbitala.Intubirana silikonska cijev ima kraj duodenuma kao ulaz i kraj ileuma kao izlaz.Upotrijebite peristaltičku pumpu za pumpanje ulaza s 10 µM G-Rg3r ili G-Rg3s u izotoničnom HBSS-u pri brzini protoka od 0,1 ml/min.Učinak verapamila procijenjen je dodavanjem 50 μM ili 100 μM spoja u 10 μM G-Rg3r ili G-Rg3s.UPLC-MS/MS provedena je na perfuzijskim ekstraktima prikupljenim u vremenskim točkama 60, 90, 120 i 150 minuta nakon početka perfuzije.Postotak apsorpcije kvantificira se formulom % apsorpcije = (1 – Cout/Cin) × 100%;koncentracija G-Rg3 na izlazu i ulazu izražena je s Cout odnosno Cin.
hEL stanice su nasađene u ploče s 96 jažica u gustoći od 1 × 104 stanica po jažici i tretirane s B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ili G-Rg3 otopljenim u DMSO .Lijekovi su zatim razrijeđeni s medijem kulture do različitih koncentracija (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) tijekom 48 sati.Korištenjem komercijalno dostupnog kompleta MTS testa, stanice su podvrgnute standardnom protokolu i zatim izmjerene pomoću čitača mikropločica na 490 nm.Razina održivosti stanica skupina koje su zajedno tretirane s B(a)P (10 μM) i G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) procijenjena je u skladu s gornjom metodom i uspoređena s netretiranom skupinom.
hEL stanice su nasađene u ploče sa 6 jažica u gustoći od 1 × 105 stanica/jažici i tretirane s 10 μMB(a)P u prisutnosti ili odsutnosti 10 μM G-Rg3.Nakon 48 sati tretmana, DNK je ekstrahirana iz hEL stanica pomoću QIAamp DNA Mini Kit-a prema protokolu proizvođača.Formiranje BPDE-DNA adukata detektirano je pomoću ELISA kompleta BPDE-DNA adukata.Relativne razine adukta BPDE-DNA izmjerene su pomoću čitača mikropločica mjerenjem apsorbancije na 450 nm.
hEL stanice su nasađene u ploče s 96 jažica pri gustoći od 1 × 104 stanica po jažici i tretirane s 10 μMB(a)P u odsutnosti ili prisutnosti 10 μM G-Rg3 tijekom 48 h.GST aktivnost je mjerena korištenjem komercijalnog pribora za ispitivanje GST aktivnosti prema protokolu proizvođača.Relativna GST aktivacija mjerena je apsorbancijom na 450 nm pomoću čitača mikropločica.
hEL stanice su isprane s ledeno hladnim PBS-om i zatim lizirane upotrebom pufera za ispitivanje radioimunoprecipitacije koji sadrži inhibitore proteaze i inhibitore fosfataze.Nakon kvantifikacije proteina korištenjem kompleta za analizu ukupnog proteina, 30 μg proteina u svakom uzorku je odvojeno pomoću 12% SDS-PAGE i prebačeno na PVDF membranu elektroforezom.Membrane su blokirane s 5% obranim mlijekom i inkubirane s primarnim antitijelima preko noći na 4°C.Nakon inkubacije sa sekundarnim protutijelima konjugiranim s peroksidazom hrena, dodani su reagensi za pojačanu kemiluminiscenciju kako bi se vizualizirao signal vezivanja.Intenzitet svake proteinske trake kvantificiran je pomoću softvera ImageJ.
Softver GraphPad Prism 7.0 korišten je za analizu svih podataka, izraženih kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.Varijacija između liječenih skupina procijenjena je pomoću Studentovog t testa ili jednosmjerne analize varijance, s P vrijednošću <0,05 koja ukazuje na statističku značajnost.
Svi podaci dobiveni ili analizirani tijekom ove studije uključeni su u ovaj objavljeni članak i datoteke s dodatnim informacijama.
Torre, LA, Siegel, RL i Jemal, A. Statistika raka pluća.prilog.Istekao.lijek.biologija.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Duhanski karcinogeni, njihovi biomarkeri i rak izazvan duhanom.Nat.Rak kapelan.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH i Venitt, S. DNK i proteinski adukti u ljudskim tkivima koji su rezultat izlaganja duhanskom dimu.internacionalnost.J. Rak.131, 2733-2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA i Yu M. Učinak Houttuynia cordata i silibinina na tumorigenezu pluća izazvanu benzo(a)pirenom u A/J miševa.Rak 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. i sur.Prirodni proizvod protiv raka izoliran iz kineskih medicinskih materijala.čeljust.lijek.6, 27 (2011).
Yang, Y. i sur.Učinkovitost polifenona E, crvenog ginsenga i rapamicina na tumorigenezu pluća izazvanu benzo(a)pirenom u A/J miševa.Rak 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS i Yuan, KS Red, uključenost u terapiju raka.čeljust.J. Nutt.lijek.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS i Gao, L. Ginsenosides u korijenu i lišću američkog ginsenga.J. Agric.Kemija hrane.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA i Yuan KS Farmakologija ginsenga: mnoge komponente i mnogi učinci.biokemija.farmakologija.58, 1685-1693 (1999).
Vrijeme objave: 17. rujna 2023