Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb eredmény érdekében javasoljuk, hogy használja a böngésző újabb verzióját (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében az oldalt stílus vagy JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A vörös ginzenget több száz éve használják a hagyományos ázsiai gyógyászatban.Ebben a tanulmányban négyféle vörös ginzeng (kínai vörös ginzeng, koreai vörös ginzeng A, koreai vörös ginzeng B és koreai vörös ginzeng C) különböző régiókban termesztett képességét értékeltük a rákkeltő tüdő kialakulásának és növekedésének gátlásában. daganatok.A benzo(a)pirén (B(a)P) tesztet A/J egereken végezték, és a koreai vörös ginzeng B bizonyult a leghatékonyabbnak a daganatterhelés csökkentésében a négy vörös ginzeng fajta közül.Ezenkívül elemeztük a különböző ginzenozidok (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 és Rg5) tartalmát négy vörös ginzeng kivonatban, és megállapítottuk, hogy a koreai vörös ginseng B a ginzenozid Rg3 (G-Rg3) legmagasabb szintje, ami arra utal, hogy a G-Rg3 fontos szerepet játszhat terápiás hatékonyságában.Ez a munka azt mutatja, hogy a G-Rg3 biológiai hozzáférhetősége viszonylag alacsony.Ha azonban a G-Rg3-at a P-gp inhibitor verapamillal együtt adták be, a G-Rg3 kiáramlása a Caco-2 sejtekbe csökkent, a G-Rg3 bélből történő felszívódásának sebessége megnőtt patkánymodellben, és a G-Rg3. növelték.A Caco-2 sejtekben az Rg3 kiáramlása csökken, az Rg3 koncentráció szintje csökken.A G-Rg3 megnövekedett a bélben és a plazmában, és tumormegelőző képessége is fokozódik a B(a)P-indukált tumorigenezis patkánymodelljében.Azt is megállapítottuk, hogy a G-Rg3 csökkentette a B(a)P által kiváltott citotoxicitást és a DNS-adduktok képződését humán tüdősejtekben, valamint helyreállította a fázis II enzimek expresszióját és aktivitását az Nrf2 útvonalon keresztül, ami összefüggésben állhat a lehetséges hatásmechanizmussal. a G-gátlás -Rg3..A tüdődaganatok előfordulásáról.Vizsgálatunk kimutatja, hogy a G-Rg3 potenciálisan fontos szerepet játszik a tüdődaganatok megcélzásában egérmodellekben.Ennek a ginsenozidnak az orális biohasznosulását fokozza a P-glikoprotein megcélzása, lehetővé téve a molekula rákellenes hatását.
A tüdőrák leggyakoribb típusa a nem-kissejtes tüdőrák (NSCLC), amely Kínában és Észak-Amerikában a rákos halálozások egyik vezető oka1,2.A nem kissejtes tüdőrák kialakulásának kockázatát növelő fő tényező a dohányzás.A cigarettafüst több mint 60 rákkeltő anyagot tartalmaz, beleértve a benzo(a)pirént (B(a)P), a nitrozaminokat és a radon bomlásából származó radioaktív izotópokat.3 A policiklusos aromás szénhidrogének B(a)P a cigaretták mérgezésének fő okai. füst.B(a)P-vel való érintkezés után a citokróm P450 B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoxiddá (BPDE) alakítja át, amely reakcióba lép a DNS-sel, és így 4-es BPDE-DNS adduktot képez. az adduktok tüdődaganatképződést indukálnak olyan egerekben, amelyek tumorstádiuma és kórszövettani állapota hasonló a humán tüdődaganatokhoz5.Ez a tulajdonság a B(a)P-indukált tüdőrák modellt megfelelő rendszerré teszi a lehetséges rákellenes tulajdonságokkal rendelkező vegyületek értékelésére.
A tüdőrák kialakulásának megelőzésének egyik lehetséges stratégiája a magas kockázatú csoportokban, különösen a dohányzókban, a kemopreventív szerek alkalmazása az intraepiteliális daganatos elváltozások kialakulásának visszaszorítására, és ezáltal a későbbi rosszindulatú daganatos elváltozások megelőzésére.Az állatkísérletek azt mutatják, hogy a különböző kemopreventív szerek hatékonyak6.Előző jelentésünk7 kiemelte a vörös ginzeng jó megelőző hatásait a tüdőrákra.Ezt a gyógynövényt évszázadok óta használják a hagyományos ázsiai gyógyászatban az élet és az egészség meghosszabbítására, és kimutatták, hogy daganatellenes hatása van8.
A ginzeng aktív faktora a ginzenozid, amelyet összetett markerként használnak a ginseng kivonatok minőségének értékelésére.A nyers ginzeng kivonatok mennyiségi elemzése jellemzően számos ginzenozid használatát foglalja magában, beleértve az RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 és Rc9,10 vegyületet.A ginzenozidok klinikailag kevéssé használhatók, mivel nagyon rossz orális biológiai hozzáférhetőségük11.Bár ennek a rossz biológiai hozzáférhetőségnek a mechanizmusa nem világos, a ginzenozidok P-glikoprotein (P-gp)12 által okozott kiáramlása lehet az oka.A P-gp az egyik legfontosabb efflux transzporter az ATP-kötő kazettás transzporter szupercsaládban, amely az ATP hidrolízis energiáját használja fel az intracelluláris anyagok külső környezetbe történő kibocsátására.A P-gp transzporterek jellemzően széles körben elterjedtek a bélben, a vesében, a májban és a vér-agy gáton13.A P-gp kritikus szerepet játszik a bélrendszeri felszívódásban, és a P-gp gátlása növeli egyes rákellenes gyógyszerek orális felszívódását és elérhetőségét12,14.Az irodalomban korábban használt inhibitorok példái a verapamil és a ciklosporin A15.Ez a munka magában foglalja egy egérrendszer létrehozását a B(a)P által kiváltott tüdőrák tanulmányozására, hogy értékeljük a Kínából és Koreából származó különböző vörös ginzeng kivonatok rosszindulatú daganatokra gyakorolt hatását.A kivonatokat egyenként elemezték, hogy azonosítsák azokat a specifikus ginsenozidokat, amelyek befolyásolhatják a karcinogenezist.Ezután a verapamilt használták a P-gp megcélzására, valamint a rákot célzó ginzenozidok orális biológiai hozzáférhetőségének és terápiás hatékonyságának javítására.
Továbbra sem tisztázott, hogy a ginzeng szaponinok milyen terápiás hatást fejtenek ki a karcinogenezisre.A kutatások kimutatták, hogy a különböző ginzenozidok csökkenthetik a rákkeltő anyagok által okozott DNS-károsodást az oxidatív stressz csökkentésével és a II. fázisú méregtelenítő enzimek aktiválásával, ezáltal megelőzve a sejtkárosodást.A glutation-S-transzferáz (GST) egy tipikus II. fázisú enzim, amely a rákkeltő anyagok által okozott DNS-károsodás csökkentésére szükséges17.A nukleáris eritroid 2-vel kapcsolatos 2. faktor (Nrf2) egy fontos transzkripciós faktor, amely szabályozza a redox homeosztázist, és aktiválja a fázis II enzimek expresszióját és a citoprotektív antioxidáns válaszokat18.Vizsgálatunkban megvizsgáltuk az azonosított ginzenozidok B(a)P által kiváltott citotoxicitás csökkentésére és a BPDE-DNS adduktum képződésre gyakorolt hatását, valamint a II. fázisú enzimek indukálását azáltal, hogy módosítják az Nrf2 útvonalat normál tüdősejtekben.
A B(a)P-indukált rák egérmodelljének létrehozása összhangban van a korábbi munkákkal5.Az 1A. ábra egy egérrákmodell 20 hetes kezelésének kísérleti tervét mutatja, amelyet B(a)P, víz (kontroll), kínai vörös ginzeng kivonat (CRG), koreai vörös ginzeng kivonat A (KRGA) és koreai vörös indukált. ginzeng.B kivonat (KRGB) és koreai vörös ginzeng C kivonat (KRGC).20 hetes vörös ginzeng kezelés után az egereket CO2 fulladással leölték.Az 1B. ábra makroszkopikus tüdődaganatokat mutat be különböző típusú vörös ginzenggel kezelt állatokban, az 1C. ábra pedig egy tumorminta reprezentatív fénymikroszkópos felvételét mutatja.A KRGB-vel kezelt állatok daganatterhelése (1,5 ± 0,35) alacsonyabb volt, mint a kontroll állatoké (0,82 ± 0,2, P < 0,05), amint az 1D. ábrán látható.A tumorterhelés gátlás átlagos mértéke 45% volt.A többi vizsgált vörös ginzeng kivonat nem mutatott ilyen szignifikáns változást a tumorterhelésben (P > 0,05).Az egérmodellben nem figyeltek meg nyilvánvaló mellékhatásokat a 20 hetes vörös ginzeng kezelés alatt, beleértve a testtömeg változását (az adatokat nem mutatjuk be), és nem volt máj- vagy vesetoxicitás (1E, F ábra).
A vörös ginzeng kivonat kezeli a tüdődaganat kialakulását A/J egerekben.(A) Kísérleti tervezés.(B) Nagy tüdődaganatok egérmodellben.A daganatokat nyilak jelzik.a: Kínai vörös ginzeng csoport.b: A koreai vörös ginzeng A csoportja.c: koreai vörös ginseng B csoport. d: koreai vörös ginzeng C csoport. d: Kontroll csoport.(C) Fénymikroszkópos felvétel, amely tüdődaganatot mutat.Nagyítás: 100. b: 400. (D) Tumorterhelés a vörös ginzeng kivonat csoportjában.(E) Az ALT májenzim plazmaszintje.(F) A Cr vese enzim plazmaszintje.Az adatokat átlag ± standard deviációban fejezzük ki.*P <0,05.
A tanulmányban azonosított vörös ginzeng kivonatokat ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriával (UPLC-MS/MS) elemeztük a következő ginzenozidok mennyiségi meghatározására: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 és Rg5.Az analitok mérésére használt UPLC és MS körülményeket egy korábbi jelentésben19 írták le.Négy vörös ginzeng kivonat UPLC-MS/MS kromatogramja látható a 2A. ábrán.Szignifikáns különbségek voltak a teljes ginzenozid-tartalomban, a legmagasabb teljes ginzenozid-tartalommal a CRG-ben (590,27 ± 41,28 μmol/L) (2B. ábra).Az egyes ginzenozidok értékelésekor (2C. ábra) a KRGB mutatta a legmagasabb G-Rg3 szintet a többi ginzenozidhoz képest (58,33 ± 3,81 μmol/L a G-Rg3 és 41,56 ± 2,88 μmol/L a G -Rg3r esetében).vörös ginseng típusú (P < 0,001).A G-Rg3 a G-Rg3r és G-Rg3s sztereoizomerek párjaként fordul elő, amelyek a 20. szénatomon lévő hidroxilcsoport helyzetében különböznek (2D. ábra).Az eredmények azt mutatják, hogy a G-Rg3r vagy G-Rg3 fontos rákellenes potenciállal rendelkezhet egy B(a)P-indukált rákos egérmodellben.
Ginzenozidok tartalma különböző vörös ginzeng kivonatokban.(A) Négy vörös ginzeng kivonat UPLC-MS/MS kromatogramja.(B) A feltüntetett kivonatok teljes ginzenozid-tartalmának becslése.(C) Egyedi ginzenozidok kimutatása jelölt kivonatokban.(D) A G-Rg3r és G-Rg3s ginzenozid sztereoizomerek szerkezete.Az adatokat a három párhuzamos meghatározás átlaga ± szórásaként fejezzük ki.***P <0,001.
Az UPLC-MS/MS vizsgálat 20 hetes kezelés után megkövetelte a ginzenozidok mennyiségi meghatározását a bél- és vérmintákban.A KRGB-kezelés csak 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 jelenlétét mutatta a vérben.Nem észleltek megmaradt ginzenozidokat, ami rossz orális biohasznosulást jelez, és ezért csökkent ezeknek a ginzenozidoknak való kitettséget.
A vastagbél-adenokarcinóma Caco-2 sejtvonal morfológiailag és biokémiailag hasonló az emberi bélhámsejtekhez, bizonyítva, hogy hasznos az enterocita transzport vizsgálatában a bélhám gáton keresztül.Ez az elemzés egy korábbi tanulmányon 20 alapult.A 3A, B, C, D, E, F ábrák a G-Rg3r és G-Rg3 transzcelluláris transzportjának reprezentatív képeit mutatják be Caco-2 egyrétegű modell alkalmazásával.A G-Rg3r vagy G-Rg3 transzcelluláris transzportja a Caco-2 monorétegeken keresztül a bazolaterális oldalról az apikális oldalra (Pb-a) szignifikánsan magasabb volt, mint az apikálisról a bazolaterális oldalra (Pa-b).A G-Rg3r esetében az átlagos Pa-b érték 0,38 ± 0,06 volt, ami 0,73 ± 0,06-ra nőtt 50 μmol/L verapamil kezelés után és 1,14 ± 0,09-re 100 μmol/L verapamil kezelés után (p < 0,001 és 0,01 p < 0,01). 2. ábra).3A).A G-Rg3 megfigyelései hasonló mintát követtek (3B. ábra), és az eredmények azt mutatták, hogy a verapamil-kezelés fokozta a G-Rg3r és G-Rg3 transzportját.A verapamil kezelés az átlagos Pb-a és G-Rg3r és G-Rg3s kiáramlási arányok szignifikáns csökkenését is eredményezte (3C, D, E, F ábra), ami azt jelzi, hogy a verapamil kezelés csökkenti a ginsenozid tartalmát a Caco-2 efflux sejtekben..
A G-Rg3 transzcelluláris transzportja Caco-2 egyrétegű rétegekben és bélrendszeri felszívódás patkány perfúziós vizsgálatban.(A) A G-Rg3r csoport Pa-b értéke Caco-2 egyrétegű rétegben.(B) A G-Rg3s csoportok Pa-b értéke Caco-2 egyrétegű rétegben.(C) A G-Rg3r csoport Pb értéke a Caco-2 egyrétegű rétegben.(D) A G-Rg3s csoportok Pb értéke a Caco-2 egyrétegű rétegben.(E) G-Rg3r csoportok hozamaránya Caco-2 egyrétegű rétegben.(F) G-Rg3 csoportok hozamaránya Caco-2 egyrétegű rétegben.(G) A G-Rg3r bélrendszeri felszívódásának százalékos aránya patkányokon végzett perfúziós vizsgálatban.(H) A G-Rg3 bélrendszeri felszívódásának százalékos aránya patkányokon végzett perfúziós vizsgálatban.A permeabilitást és a felszívódást verapamil hozzáadása nélkül hasonlították össze.Az adatokat öt független kísérlet átlaga ± standard deviációjaként fejezzük ki.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
A korábbi munkákkal20 összhangban patkányokon ortotopikus bélperfúziót végeztek annak meghatározására, hogy a G-Rg3 felszívódása a bélben nő-e a verapamil kezelés után.A 3G, H ábrák reprezentatív perfúziós vizsgálatokat mutatnak be a G-Rg3r és G-Rg3 bélben történő felszívódásának százalékos értékelésére rákos modellpatkányokban a fenti időszakokban.A kezdeti, körülbelül 10%-os gyenge G-Rg3r felvétel százalékos aránya több mint 20%-ra nőtt 50 μM verapamil kezelés után és több mint 25%-ra 100 μM verapamil kezelés után.Hasonlóképpen, a G-Rg3, amelynek kezdeti felvétele 10%, szintén 20% feletti csúcsot mutatott 50 μM verapamil kezelés után és közel 30% 100 μM verapamil kezelés után, ami arra utal, hogy a P-gp verapamil általi gátlása fokozza. bél G-abszorpciós Rg3 tüdőrák egérmodelljében.
A fenti módszer szerint a B(a)P-indukált rákmodell egereket véletlenszerűen hat csoportra osztották, amint az a 4A. ábrán látható.A G-Rg3-mal kezelt csoportban nem figyeltek meg jelentős súlycsökkenést vagy toxicitás klinikai tüneteit a kontrollcsoporthoz képest (az adatokat nem mutatjuk be).20 hetes kezelés után minden egér tüdejét összegyűjtöttük.A 4B. ábra a fenti kezelési csoportokban lévő egerek makroszkopikus tüdődaganatait mutatja, a 4C. ábra pedig egy reprezentatív tumor reprezentatív fénymikroszkópos képét mutatja.Ami a tumorterhelést illeti az egyes csoportokban (4D. ábra), a G-Rg3r-rel és G-Rg3-mal kezelt egerek értéke 0,75 ± 0,29 mm3, illetve 0,81 ± 0,30 mm3 volt, míg a G-egereknél a kezelt értékek. -Rg3-mal 1,63, illetve ±0,40 mm3 volt.kontroll egerek (p < 0,001), ami azt jelzi, hogy a G-Rg3 kezelés csökkentette a tumorterhelést az egerekben.A verapamil beadása tovább fokozta ezt a csökkenést: a verapamil+ G-Rg3r egerekben az értékek 0,75 ± 0,29 mm3-ről 0,33 ± 0,25 mm3-re (p < 0,01), a verapamil+ értékei 0,81 ± 0,30 mm2-ről 0,9-re ± 0,30 mm2-re csökkentek. mm3 G. -Rg3s-kezelt egerekben (p < 0,05), ami azt jelzi, hogy a verapamil fokozhatja a G-Rg3 gátló hatását a tumorigenezisre.A tumorterhelés nem mutatott szignifikáns különbséget a kontrollcsoport és a verapamil csoport, a G-Rg3r csoport és a G-Rg3s csoport, valamint a verapamil+G-Rg3r és a verapamil+G-Rg3s csoport között.Ezenkívül az értékelt kezelésekhez nem társult jelentős máj- vagy vesetoxicitás (4E, F ábra).
Tumorterhelés G-Rg3 kezelés után és plazma vagy bél G-Rg3r és G-Rg3 szintje a jelzett csoportokban.(A) Kísérleti tervezés.(B) Makroszkópos daganatok egérmodellben.A daganatokat nyilak jelzik.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r verapamillal kombinálva.d: G-Rg3 verapamillal kombinálva.d: Verapamil.e: vezérlés.(C) A daganat optikai mikroképe nagyítással.Válasz: 100x.b: 400X.(D) A G-Rg3 + verapamil kezelés hatása a tumorterhelésre A/J egerekben.(E) Az ALT májenzim plazmaszintje.(F) A Cr vese enzim plazmaszintje.(G) A jelzett csoportok G-Rg3r vagy G-Rg3 plazmaszintjei.(H) A G-Rg3r vagy G-Rg3s szintje a jelzett csoportok beleiben.Az adatokat a három párhuzamos meghatározás átlaga ± szórásaként fejezzük ki.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
A B(a)P-indukált rákmodell egerekben a G-Rg3 szinteket UPLC-MS/MS-sel határoztuk meg 20 hetes kezelési periódus után a Módszerek részben leírt módszer szerint.A 4G és H ábra a plazma és a bélrendszer G-Rg3 szintjét mutatja.A plazma G-Rg3r szintje 0,44 ± 0,32 μmol/l volt, és 1,17 ± 0,47 μmol/L-re nőtt verapamil egyidejű adásával (p < 0,001), míg a bél G-Rg3r szintje 0,53 ± 0,08 µg/l volt.Verapamillal kombinálva a g 1,35 ± 0,13 μg/g-ra nőtt (p < 0,001).A G-Rg3 esetében az eredmények hasonló mintát követtek, ami azt jelzi, hogy a verapamil-kezelés növelte a G-Rg3 orális biohasznosulását A/J egerekben.
A sejtek életképességi vizsgálatát a B(a)P és a G-Rg3 citotoxicitásának értékelésére hEL sejteken alkalmaztuk.A B(a)P által a hEL sejtekben kiváltott citotoxicitást az 5A. ábra mutatja, míg a G-Rg3r és G-Rg3 nem toxikus tulajdonságait az 5A. és 5B. ábra mutatja.5B, C. A G-Rg3 citoprotektív hatásának értékelésére B(a)P-t különböző koncentrációjú G-Rg3r-rel vagy G-Rg3-mal együtt adtunk be hEL-sejtekbe.Amint az 5D. ábrán látható, a G-Rg3r 5 μM, 10 μM és 20 μM koncentrációban 58,3%-ra, 79,3%-ra, illetve 77,3%-ra állította vissza a sejtek életképességét.Hasonló eredmények láthatók a G-Rg3s csoportban is.Amikor a G-Rg3-ok koncentrációja 5 µM, 10 µM és 20 µM volt, a sejtek életképessége rendre 58,3%-ra, 72,7%-ra és 76,7%-ra állt vissza (5E. ábra).).A BPDE-DNS adduktok jelenlétét ELISA készlettel mértük.Eredményeink azt mutatták, hogy a B(a)P-vel kezelt csoportban megemelkedett a BPDE-DNS addukt szintje a kontroll csoporthoz képest, de a G-Rg3 együttes kezeléssel összehasonlítva a B(a)P csoportban a BPDE-DNS adduktum szintje. A B kezelt csoportban a DNS-adduktum szintje jelentősen csökkent.Az egyedül B(a)P-vel végzett kezelés eredményeit az 5F. ábra mutatja (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 G-Rg3r esetén, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 G-Rg3s esetén, p < 0,001).
A sejtek életképessége és BPDE-DNS addukt képződése G-Rg3-mal és B(a)P-vel kezelt hEL sejtekben.(A) A B(a)P-vel kezelt hEL sejtek életképessége.(B) G-Rg3r-rel kezelt hEL sejtek életképessége.(C) G-Rg3-mal kezelt hEL sejtek életképessége.(D) B(a)P-vel és G-Rg3r-rel kezelt hEL-sejtek életképessége.(E) B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL-sejtek életképessége.(F) A BPDE-DNS addukt szintjei a B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.Az adatokat a három párhuzamos meghatározás átlaga ± szórásaként fejezzük ki.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
A GST enzim expresszióját 10 μM B(a)P és 10 μM G-Rg3r vagy G-Rg3s együttes kezelés után mutattuk ki.Eredményeink azt mutatták, hogy a B(a)P elnyomta a GST expressziót (59,7 ± 8,2% a G-Rg3r csoportban és 39 ± 4,5% a G-Rg3s csoportban), és a B(a)P a G-Rg3r bármelyikéhez társult. , vagy G-Rg3r-rel vagy G-Rg3r-rel.A G-Rg3-as együttes kezelés helyreállította a GST expressziót.GST expresszió (103,7 ± 15,5% a G-Rg3r csoportban és 110 ± 11,1% a G-Rg3s csoportban, p < 0,05 és p < 0,001, 6A, B és C ábra).A GST aktivitást aktivitási vizsgálati készlettel értékeltük.Eredményeink azt mutatták, hogy a kombinált kezelési csoport magasabb GST-aktivitást mutatott a csak B(a)P csoporthoz képest (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% a G-Rg3r csoportban, illetve 92,3 ± 6,5 a G-Rg3r csoportban ).% vs 35,7 ± 7,8% a G-Rg3s csoportban, p < 0,001, 6D. ábra).
GST és Nrf2 expressziója B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.(A) A GST expresszió kimutatása Western blottal.(B) A GST kvantitatív expressziója B(a)P-vel és G-Rg3r-vel kezelt hEL sejtekben.(C) A GST kvantitatív expressziója B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.(D) GST aktivitás B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.(E) A Nrf2 expresszió kimutatása Western-blottal.(F) Nrf2 kvantitatív expressziója B(a)P-vel és G-Rg3r-rel kezelt hEL sejtekben.(G) Nrf2 kvantitatív expressziója B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.Az adatokat a három párhuzamos meghatározás átlaga ± szórásaként fejezzük ki.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
A B(a)P-indukált tumorigenezis G-Rg3 által közvetített szuppressziójában szerepet játszó útvonalak tisztázása érdekében az Nrf2 expresszióját Western blottal értékeltük.Amint a 6E, F, G ábrákon látható, a kontrollcsoporthoz képest csak az Nrf2 szintje csökkent a B(a)P kezelési csoportban;azonban a B(a)P kezelt csoporthoz képest a B(a) Nrf2 szint a PG-Rg3 csoportban megemelkedett (106 ± 9,5% a G-Rg3r esetében, vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2% a PG-Rg3 csoportban). G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% G-Rg3s esetén, p < 0,01).
Megerősítettük az Nrf2 preventív szerepét az Nrf2 expresszió elnyomásával specifikus kis interferáló RNS (siRNS) segítségével.A Nrf2 knockdownt Western-blot vizsgálattal igazoltuk (7A, B ábra).A 7C. és D. ábrákon látható, hogy a hEL-sejtek B(a)P-vel és G-Rg3-mal történő együttes kezelése a BPDE-DNS-adduktumok számának csökkenését (1,47 ± 0,21) eredményezte a B(a)P-vel végzett kezeléshez képest. egyedül a kontroll siRNS csoportban.) G-Rg3r 4,13 ± 0,49, G-Rg3s 1,8 ± 0,32 és 4,1 ± 0,57, p < 0,01).A G-Rg3 BPDE-DNS képződést gátló hatását azonban az Nrf2 knockdown megszüntette.Az siNrf2 csoportban nem volt szignifikáns különbség a BPDE-DNS adduktum képződésében a B(a)P és G-Rg3 együttes kezelés, valamint a B(a)P önmagában végzett kezelés között (3,0 ± 0,21 a G-Rg3r-re vs. 3,56 ± 0,32). ).G-Rg3r esetén 3,6 G-Rg3 esetén versus ±0,45 versus 4,0 ± 0,37, p > 0,05).
A Nrf2 knockdown hatása a BPDE-DNS addukt képződésére a hEL sejtekben.(A) Az Nrf2 leütését Western blottolással igazoltuk.(B) A Nrf2 sáv intenzitásának számszerűsítése.(C) A Nrf2 knockdown hatása a BPDE-DNS adduktum szintjére B(a)P-vel és G-Rg3r-rel kezelt hEL sejtekben.(D) A Nrf2 knockdown hatása a BPDE-DNS adduktum szintjére B(a)P-vel és G-Rg3-mal kezelt hEL sejtekben.Az adatokat a három párhuzamos meghatározás átlaga ± szórásaként fejezzük ki.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ez a tanulmány értékelte a különböző vörös ginzeng kivonatok megelőző hatásait a B(a)P által kiváltott tüdőrák egérmodelljén, és a KRGB-kezelés jelentősen csökkentette a tumorterhelést.Tekintettel arra, hogy ebben a ginzeng kivonatban a G-Rg3 a legmagasabb, tanulmányozták ennek a ginsenozidnak a daganatképződés gátlásában betöltött fontos szerepét.Mind a G-Rg3r, mind a G-Rg3 (a G-Rg3 két epimerje) szignifikánsan csökkentette a tumorterhelést a B(a)P által kiváltott rák egérmodelljében.A G-Rg3r és a G-Rg3 rákellenes hatást fejt ki a tumorsejtek apoptózisának indukálásával21, gátolja a tumor növekedését22, leállítja a sejtciklust23 és befolyásolja az angiogenezist24.A G-Rg3-ról kimutatták, hogy gátolja a sejtes metasztázisokat25, és dokumentálták a G-Rg3 azon képességét, hogy fokozza a kemoterápia és a sugárterápia hatását26, 27.Poon és munkatársai kimutatták, hogy a G-Rg3 kezelés csökkentheti a B(a)P28 genotoxikus hatásait.Ez a tanulmány bemutatja a G-Rg3 terápiás potenciálját a környezeti rákkeltő molekulák megcélzásában és a rák megelőzésében.
Jó profilaktikus potenciáljuk ellenére a ginzenozidok rossz orális biohasznosulása kihívást jelent e molekulák klinikai alkalmazása szempontjából.A ginzenozidok patkányokban történő orális adagolásának farmakokinetikai elemzése azt mutatta, hogy biológiai hozzáférhetősége még mindig kevesebb, mint 5%29.Ezek a tesztek azt mutatták, hogy a 20 hetes kezelési időszak után csak az Rg5 vérszintje csökkent.Bár a rossz biológiai hozzáférhetőség mögött meghúzódó mechanizmust még tisztázni kell, úgy gondolják, hogy a P-gp részt vesz a ginzenozidok kiáramlásában.Ez a munka először mutatta be, hogy a verapamil, egy P-gp-blokkoló beadása növeli a G-Rg3r és G-Rg3s orális biohasznosulását.Így ez a megállapítás arra utal, hogy a G-Rg3r és a G-Rg3 a P-gp szubsztrátjaként működnek, hogy szabályozzák annak kiáramlását.
Ez a munka azt mutatja, hogy a verapamillal végzett kombinált kezelés növeli a G-Rg3 orális biológiai hozzáférhetőségét a tüdőrák egérmodelljében.Ezt a megállapítást támasztja alá a G-Rg3 megnövekedett intestinalis transzcelluláris transzportja a P-gp blokád során, ezáltal fokozva a felszívódását.A Caco2 sejtekben végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a verapamil kezelés csökkentette a G-Rg3r és G-Rg3s kiáramlását, miközben javította a membrán permeabilitását.Yang et al.Tanulmányok kimutatták, hogy a ciklosporin A-val (egy másik P-gp-blokkoló) végzett kezelés a ginsenozid Rh2 biohasznosulását az 1%-ról20 több mint 30%-ra növeli.A K és Rg1 ginzenozid vegyületek is hasonló eredményeket mutattak30,31.Verapamil és ciklosporin A együttadásakor a K vegyület kiáramlása a Caco-2 sejtekben szignifikánsan csökkent, 26,6-ról 3 alá, míg intracelluláris szintje 40-szeresére nőtt30.Verapamil jelenlétében az Rg1 szintje megemelkedett patkány tüdőhámsejtekben, ami arra utal, hogy a P-gp szerepet játszik a ginzenozid kiáramlásában, amint azt Meng és mtsai31.A verapamil azonban nem gyakorolt ugyanolyan hatást egyes ginsenozidok (például Rg1, F1, Rh1 és Re) kiáramlására, ami azt jelzi, hogy a P-gp szubsztrátok nem befolyásolják őket, amint azt Liang és mtsai.32 .Ez a megfigyelés más transzporterek és alternatív ginzenozid struktúrák bevonásával hozható összefüggésbe.
A G-Rg3 rákra kifejtett megelőző hatásának mechanizmusa nem tisztázott.Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a G-Rg3 megakadályozza a DNS-károsodást és az apoptózist az oxidatív stressz és a gyulladás csökkentésével16, 33, amelyek a B(a)P által kiváltott tumorigenezis megelőzésének mögöttes mechanizmusa lehet.Egyes jelentések azt mutatják, hogy a B(a)P által kiváltott genotoxicitás csökkenthető a II. fázisú enzimek BPDE-DNS34 képzésére való modulálásával.A GST egy tipikus II. fázisú enzim, amely gátolja a BPDE-DNS addukt képződését azáltal, hogy elősegíti a GSH BPDE-hez való kötődését, ezáltal csökkenti a B(a)P35 által kiváltott DNS-károsodást.Eredményeink azt mutatják, hogy a G-Rg3 kezelés csökkenti a B(a)P által kiváltott citotoxicitást és a BPDE-DNS adduktum képződést a hEL sejtekben, és helyreállítja a GST expressziót és aktivitást in vitro.Ezek a hatások azonban hiányoztak Nrf2 hiányában, ami arra utal, hogy a G-Rg3 citoprotektív hatást vált ki az Nrf2 útvonalon keresztül.Az Nrf2 a II. fázisú méregtelenítő enzimek fő transzkripciós faktora, amely elősegíti a xenobiotikumok kiürülését36.Az Nrf2 útvonal aktiválása citovédelmet indukál és csökkenti a szövetkárosodást37.Ezen túlmenően számos jelentés alátámasztotta az Nrf2 szerepét, mint tumorszuppresszor a karcinogenezisben38.Vizsgálataink azt mutatják, hogy a Nrf2 útvonal G-Rg3 általi indukálása fontos szabályozó szerepet játszik a B(a)P által kiváltott genotoxicitásban, mivel a II. fázisú enzimek aktiválásával B(a)P méregtelenítést idéz elő, ezáltal gátolja a tumorigenezis folyamatát.
Munkánk feltárja a vörös ginzeng potenciálját a B(a)P által kiváltott tüdőrák megelőzésében egerekben a ginsenozid G-Rg3 fontos szerepvállalása révén.Ennek a molekulának a rossz orális biohasznosulása akadályozza klinikai alkalmazását.Ez a tanulmány azonban először mutatja meg, hogy a G-Rg3 a P-gp szubsztrátja, és egy P-gp inhibitor beadása növeli a G-Rg3 biológiai hozzáférhetőségét in vitro és in vivo.A G-Rg3 csökkenti a B(a)P által kiváltott citotoxicitást az Nrf2 útvonal szabályozásával, amely potenciális mechanizmusa lehet a megelőző funkciójának.Tanulmányunk megerősíti a ginsenozid G-Rg3 potenciálját a tüdőrák megelőzésében és kezelésében.
A hathetes nőstény A/J egereket (20 ± 1 g) és a 7 hetes hím Wistar patkányokat (250 ± 20 g) a The Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, USA) és a Wuhan Institute of Zoology-tól szereztük be.Egyetem (Wuhan, Kína).A Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, Kína) biztosított számunkra Caco-2 és hEL sejteket.A Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) a B(a)P és a trikaprin forrása.A tisztított G-Rg3r és G-Rg3s ginzenozidokat, a dimetil-szulfoxidot (DMSO), a CellTiter-96 proliferációs vizsgálati készletet (MTS), a verapamil, a minimális esszenciális táptalajt (MEM) és a magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a Chengdu Must Bio-Technology cégtől vásároltuk. .Vállalat, KFT.(Chengdu, Kína).A QIAamp DNS mini kit és a BPDE-DNS addukt ELISA kit a Qiagentől (Stanford, CA, USA) és a Cell Biolabstól (San Diego, CA, USA) vásárolt.A GST-aktivitás-vizsgálati készletet és az összfehérje-vizsgálati készletet (standard BCA-módszer) a Solarbio-tól (Peking, Kína) vásároltuk.Az összes vörös ginzeng kivonatot a Mingyu Laboratory 7-ben tárolják. A Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Kína) és a Korea Cancer Center (Szöul, Korea) a CRG kivonat és a különböző koreai eredetű vörös ginzeng kivonatok kereskedelmi forrásai (beleértve a KRGA-t, KRGB-t is). és KRGC).A vörös ginzeng 6 éves friss ginzeng gyökereiből készül.A vörös ginzeng kivonatot úgy nyerik, hogy a ginzenget háromszor vízzel mossák, majd a vizes kivonatot besűrítik, végül alacsony hőmérsékleten szárítják, így ginzengkivonatport kapnak.Az antitesteket (anti-Nrf2, anti-GST és β-aktin), torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl immunglobulin G-t (IgG), transzfekciós reagenst, kontroll siRNS-t és Nrf2 siRNS-t a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, CA) vásároltuk. .), USA).
A Caco2 és a hEL sejteket 100 mm2-es sejttenyésztő edényekben tenyésztettük 10% FBS-t tartalmazó MEM-mel 37 °C-on, 5% CO2-tartalmú párásított atmoszférában.A kezelési körülmények hatásának meghatározására hEL sejteket különböző koncentrációjú B(a)P és G-Rg3 MEM-ben inkubáltunk 48 órán keresztül.A sejteket tovább elemezhetjük vagy összegyűjthetjük sejtmentes kivonatok készítéséhez.
Minden kísérletet jóváhagyott a Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem Tongji Medical College Kísérleti Állat-etikai Bizottsága (jóváhagyási szám: 2019; regisztrációs szám: 4587TH).Minden kísérletet a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően végeztünk, és a vizsgálatot az Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) irányelveinek megfelelően végeztük.Nyolc hetes A/J egereket először intraperitoneálisan injektáltunk B(a)P-vel tricaprine oldatban (100 mg/kg, 0,2 ml).Egy hét elteltével az egereket véletlenszerűen kontrollcsoportokra és különböző kezelési csoportokra osztották, mindegyik csoportban 15 egér volt, és naponta egyszer szondát vettek be.20 hetes kezelés után az állatokat CO2-fulladás miatt leöltük.A tüdőt összegyűjtöttük, és 24 órán keresztül rögzítettük.A felszíni daganatok számát és az egyes daganatok méretét minden tüdő esetében boncoló mikroszkóp alatt számszerűsítettük.A tumor térfogatbecslését (V) a következő kifejezéssel számítottuk ki: V (mm3) = 4/3πr3, ahol r a tumor átmérője.Az egerek tüdejében lévő összes tumortérfogat nettó összege a teljes tumortérfogatot, az egyes csoportok átlagos teljes tumortérfogata pedig a tumorterhelést jelentette.Teljes vér- és bélmintákat gyűjtöttünk, és -80 °C-on tároltuk az UPLC-MS/MS meghatározáshoz.Szérumot gyűjtöttünk, és egy automata kémiai analizátort használtunk az alanin-aminotranszferáz (ALT) és a szérum kreatinin (Cr) szintjének elemzésére a máj- és vesefunkció értékelésére.
Az összegyűjtött mintákat kivettük a hűtőtárolóból, felengedtük, lemértük és csövekbe helyeztük a fent leírtak szerint.Ehhez 0,5 μM phlorizint (belső standard) adtunk 0,8 ml metanolos oldatban.A szövetet ezután Tissue-Tearor segítségével homogenizáltuk, majd a homogenizátumot egy 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe vittük át.Az elegyet 15 500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig.1,0 ml felülúszó eltávolítása után nitrogénnel szárítjuk.A kinyeréshez kétszáz mikroliter metanolt használtunk fel.A vér összegyűjtése és feldolgozása egy vonalon történik, és referenciaként szolgál minden méréshez.
A 24 lyukú Transwell lemezekre lyukanként 1,0 × 105 Caco-2 sejtet oltottunk be, hogy értékeljük a G-Rg3 transzport potenciális fokozódását verapamil hozzáadásával.3 hét tenyésztés után a sejteket HBSS-sel mostuk, és 37 °C-on előinkubáltuk.400 μl 10 μM G-Rg3-at (G-Rg3r, G-Rg3s, vagy 50 vagy 100 μM verapamil keveréke) fecskendeztek az egyrétegű réteg bazolaterális vagy apikális oldalára, a másikhoz pedig 600 μl HBSS oldatot adtak. oldal.Gyűjts össze 100 µl táptalajt a megadott időpontokban (0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 perc), és adjunk hozzá 100 µl HBSS-t a térfogat kiegészítéséhez.A mintákat –4 °C-on tároltuk az UPLC-MS/MS vizsgálatig.A Papp = dQ/(dT × A × C0) kifejezés a látszólagos egyirányú apikális és bazolaterális permeabilitás számszerűsítésére szolgál, és fordítva (Pa-b és Pb-a);dQ/dT a koncentráció változása, A (0,6 cm2) az egyrétegű réteg felülete, C0 pedig a kezdeti donorkoncentráció.Az efflux arányt Pb-a/Pa-b-ként számítjuk ki, amely a vizsgált gyógyszer kiáramlási sebességét jelenti.
A hím Wistar patkányokat 24 órán át éheztették, csak vizet ittak, és 3,5%-os pentobarbitál oldat intravénás injekciójával érzéstelenítették.Az intubált szilikoncső bejárata a duodenum vége, kijárata pedig az ileum vége.Használjon perisztaltikus pumpát a bemeneti nyílásba 10 µM G-Rg3r vagy G-Rg3s izotóniás HBSS-ben történő pumpálásához 0,1 ml/perc áramlási sebességgel.A verapamil hatását úgy értékelték, hogy 50 μM vagy 100 μM vegyületet adtak 10 μM G-Rg3r-hoz vagy G-Rg3s-hoz.Az UPLC-MS/MS vizsgálatot a perfúzió kezdete után 60, 90, 120 és 150 perccel gyűjtött perfúziós kivonatokon végeztük.Az abszorpció százalékos arányát a következő képlet adja meg: % abszorpció = (1 – Cout/Cin) × 100%;a G-Rg3 koncentrációját a kimenetnél és a bemenetnél Cout, illetve Cin fejezi ki.
A hEL sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk lyukanként 1 × 104 sejt sűrűséggel, és DMSO-ban oldott B(a)P-vel (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) vagy G-Rg3-mal kezeltük. .A gyógyszereket ezután tenyésztőközeggel hígítottuk különböző koncentrációkra (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) 48 óra alatt.A kereskedelemben kapható MTS vizsgálati készletet használva a sejteket standard protokollnak vetettük alá, majd mikrolemez-leolvasóval 490 nm-en mértük.A B(a)P-vel (10 μM) és G-Rg3-mal (0, 1, 5, 10, 20 μM) együtt kezelt csoportok sejtéletképességi szintjét a fenti módszer szerint értékeltük, és összehasonlítottuk a kezeletlen csoporttal.
A hEL sejteket 6 lyukú lemezekre oltottuk 1 × 105 sejt/lyuk sűrűséggel, és 10 μMB(a)P-vel kezeltük 10 µM G-Rg3 jelenlétében vagy hiányában.48 órás kezelés után a DNS-t extraháltuk a hEL sejtekből a QIAamp DNA Mini Kit segítségével a gyártó protokollja szerint.A BPDE-DNS adduktok képződését BPDE-DNS addukt ELISA kit segítségével detektáltuk.A BPDE-DNS addukt relatív szintjét mikrolemez-leolvasóval mértük, 450 nm-en mérve az abszorbanciát.
A hEL sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk lyukanként 1 × 104 sejt sűrűséggel, és 10 μMB(a)P-vel kezeltük 10 µM G-Rg3 nélkül vagy jelenlétében 48 órán át.A GST-aktivitást egy kereskedelmi forgalomban lévő GST-aktivitás-vizsgálati készlettel mértük a gyártó protokollja szerint.A relatív GST aktivációt 450 nm-en mért abszorbanciával, mikrolemez-leolvasóval mértük.
A hEL sejteket jéghideg PBS-sel mostuk, majd proteáz inhibitorokat és foszfatáz inhibitorokat tartalmazó radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferrel lizáltuk.A fehérje mennyiségi meghatározását összfehérje assay kit segítségével minden mintában 30 μg fehérjét választottunk el 12%-os SDS-PAGE-val, és elektroforézissel PVDF membránra vittük át.A membránokat 5%-os sovány tejjel blokkoltuk, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk elsődleges antitestekkel.Torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel végzett inkubálás után fokozott kemilumineszcenciás reagenseket adtunk hozzá a kötési jel megjelenítéséhez.Az egyes fehérjesávok intenzitását ImageJ szoftverrel határoztuk meg.
GraphPad Prism 7.0 szoftvert használtunk az összes adat elemzésére, átlag ± standard deviációban kifejezve.A kezelési csoportok közötti eltéréseket Student-féle t-próbával vagy egytényezős varianciaanalízissel értékelték, ahol a P érték <0,05 a statisztikai szignifikanciát jelzi.
A tanulmány során nyert vagy elemzett összes adat megtalálható ebben a publikált cikkben és a kiegészítő információs fájlokban.
Torre, LA, Siegel, RL és Jemal, A. Tüdőrák statisztikák.határozószó.Lejárt.gyógyszer.biológia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Dohánykarcinogének, biomarkereik és a dohányzás által kiváltott rák.Nat.Rák káplán.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH és Venitt, S. Dohányfüstnek való kitettségből származó DNS- és fehérjeadduktok emberi szövetekben.nemzetköziség.J. Rák.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA és Yu M. A Houttuynia cordata és a szilibinin hatása a benzo(a)pirén által kiváltott tüdőtumorogenezisre A/J egerekben.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Kínai gyógyászati anyagokból izolált rákellenes természetes termék.állkapocs.gyógyszer.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.A polifenon E, a vörös ginzeng és a rapamicin hatékonysága a benzo(a) pirénnel kiváltott tüdőtumorogenezisben A/J egerekben.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS és Yuan, KS Red, részvétel a rákterápiában.állkapocs.J. Nutt.gyógyszer.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS és Gao, L. Ginsenosides az amerikai ginzeng gyökereiben és leveleiben.J. Agric.Élelmiszer kémia.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA és Yuan KS A ginzeng farmakológiája: sok összetevő és sok hatás.biokémia.gyógyszertan.58, 1685–1693 (1999).
Feladás időpontja: 2023.09.17