Կարմիր ժենշենի սապոնին Rg3 Ginsenoside RG3 փոշի կանխարգելիչ ազդեցություն բենզոպիրենով առաջացած թոքերի ուռուցքների վրա

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն արդյունքների համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ձեր բրաուզերի ավելի նոր տարբերակը (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճավորման կամ JavaScript-ի:
Կարմիր ժենշենը հարյուրավոր տարիներ շարունակ օգտագործվում է ավանդական ասիական բժշկության մեջ:Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք գնահատեցինք տարբեր շրջաններում աճեցված կարմիր ժենշենի չորս տեսակի (չինական կարմիր ժենշեն, կորեական կարմիր ժենշեն A, կորեական կարմիր ժենշեն B և կորեական կարմիր ժենշեն C) կարողությունը՝ արգելակելու քաղցկեղածին թոքերի ձևավորումն ու աճը: ուռուցքներ.Բենզո(ա)պիրենի (B(a)P) թեստն անցկացվել է A/J մկների վրա, և կորեական կարմիր ժենշեն B-ն ամենաարդյունավետն է կարմիր ժենշենի չորս տեսակների մեջ ուռուցքային բեռը նվազեցնելու համար:Բացի այդ, մենք վերլուծել ենք տարբեր գինսենոզիդների (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 և Rg5) պարունակությունը չորս կարմիր ժենշենի էքստրակտներում և պարզել, որ կորեական կարմիր ժենշեն B-ն ուներ ginsenoside Rg3 (G-Rg3) ամենաբարձր մակարդակը, ինչը ենթադրում է, որ G-Rg3-ը կարող է կարևոր դեր խաղալ դրա բուժական արդյունավետության մեջ:Այս աշխատանքը ցույց է տալիս, որ G-Rg3-ն ունի համեմատաբար ցածր կենսամատչելիություն:Այնուամենայնիվ, երբ G-Rg3-ը կիրառվել է P-gp ինհիբիտոր verapamil-ի հետ, G-Rg3-ի արտահոսքը դեպի Caco-2 բջիջներ նվազել է, G-Rg3-ի աղիքային կլանման արագությունը մեծացել է առնետի մոդելում, իսկ G-Rg3-ը: ավելացել է.Caco-2 բջիջներում Rg3-ի արտահոսքը նվազում է, իսկ Rg3-ի կոնցենտրացիայի մակարդակը՝ նվազում։G-Rg3-ն ավելանում է աղիքներում և պլազմայում, և ուռուցքները կանխելու նրա կարողությունը նույնպես մեծանում է B(a)P-ով պայմանավորված ուռուցքի գենեզի առնետների մոդելում:Մենք նաև պարզեցինք, որ G-Rg3-ը նվազեցնում է B(a)P-ով առաջացած ցիտոտոքսիկությունը և ԴՆԹ հավելումների ձևավորումը մարդու թոքերի բջիջներում, և վերականգնում է II փուլի ֆերմենտների արտահայտումն ու ակտիվությունը Nrf2 ուղու միջոցով, ինչը կարող է կապված լինել գործողության հնարավոր մեխանիզմի հետ: G-ի արգելակումը -Rg3..Թոքերի ուռուցքների առաջացման մասին.Մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս G-Rg3-ի պոտենցիալ կարևոր դերը մկների մոդելներում թոքերի ուռուցքների թիրախավորման գործում:Այս ginsenoside-ի բանավոր կենսահասանելիությունը մեծանում է՝ թիրախավորելով P-glycoprotein-ը, ինչը թույլ է տալիս մոլեկուլին գործադրել հակաքաղցկեղային ազդեցություն:
Թոքերի քաղցկեղի ամենատարածված տեսակը թոքերի ոչ մանր բջջային քաղցկեղն է (NSCLC), որը Չինաստանում և Հյուսիսային Ամերիկայում քաղցկեղից մահացության գլխավոր պատճառներից մեկն է1,2:Հիմնական գործոնը, որը մեծացնում է թոքերի ոչ մանր բջջային քաղցկեղի առաջացման վտանգը, ծխելն է։Ծխախոտի ծուխը պարունակում է ավելի քան 60 քաղցկեղածին նյութեր, այդ թվում՝ բենզո(ա)պիրեն (B(a)P), նիտրոզամիններ և ռադիոակտիվ իզոտոպներ ռադոնի քայքայման արդյունքում: ծուխը.B(a)P-ի ազդեցության դեպքում ցիտոքրոմ P450-ը այն փոխակերպում է B(a)P-7,8-դիհիդրոդիոլ-9,10-էպօքսիդի (BPDE), որը փոխազդում է ԴՆԹ-ի հետ՝ ձևավորելով BPDE-DNA հավելում 4: Բացի այդ, սրանք Ադուկտիվները հրահրում են թոքերի ուռուցքի առաջացում մկների մոտ ուռուցքային փուլով և հիստոպաթոլոգիայով, որը նման է մարդու թոքերի ուռուցքներին5:Այս հատկանիշը B(a)P-ով պայմանավորված թոքերի քաղցկեղի մոդելը դարձնում է համապատասխան համակարգ՝ հնարավոր հակաքաղցկեղային հատկություններով միացությունների գնահատման համար:
Բարձր ռիսկային խմբերում, հատկապես ծխողների մոտ թոքերի քաղցկեղի զարգացումը կանխելու հնարավոր ռազմավարություններից մեկը քիմիկանխարգելիչ միջոցների օգտագործումն է՝ ճնշելու ներէպիթելային նորագոյացությունների զարգացումը և դրանով իսկ կանխելու դրանց հետագա առաջընթացը դեպի չարորակ նորագոյացություն:Կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ տարբեր քիմիկանխարգելիչ միջոցներ արդյունավետ են6:Մեր նախորդ զեկույցը7 ընդգծեց կարմիր ժենշենի լավ կանխարգելիչ ազդեցությունը թոքերի քաղցկեղի վրա:Այս խոտը դարեր շարունակ օգտագործվել է ավանդական ասիական բժշկության մեջ՝ երկարացնելու կյանքը և առողջությունը, և փաստագրված է, որ ունի հակաուռուցքային ազդեցություն8:
Ժենշենի ակտիվ գործոնը գինսենոզիդն է, որն օգտագործվում է որպես կոմպոզիտային մարկեր՝ ժենշենի քաղվածքների որակը գնահատելու համար:Հում ժենշենի քաղվածքների քանակական վերլուծությունը սովորաբար ներառում է մի քանի գինսենոզիդների օգտագործում, ներառյալ RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 և Rc9,10:Գինսենոզիդները քիչ կլինիկական կիրառություն ունեն՝ պայմանավորված նրանց շատ վատ բանավոր կենսահասանելիությամբ11:Չնայած այս վատ կենսահասանելիության մեխանիզմը պարզ չէ, պատճառ կարող է լինել P-glycoprotein (P-gp)12-ով առաջացած գինսենոզիդների արտահոսքը:P-gp-ն ամենակարևոր արտահոսքի փոխադրիչներից մեկն է ATP-կապող կասետային փոխադրողների գերընտանիքում, որն օգտագործում է ATP հիդրոլիզի էներգիան ներբջջային նյութերը արտաքին միջավայր արտանետելու համար:P-gp փոխադրողները սովորաբար լայնորեն տարածված են աղիքներում, երիկամներում, լյարդում և արյունաուղեղային պատնեշում13:P-gp-ն կարևոր դեր է խաղում աղիքային կլանման մեջ, և P-gp-ի արգելակումը մեծացնում է որոշ հակաքաղցկեղային դեղամիջոցների բանավոր կլանումը և հասանելիությունը12,14:Գրականության մեջ նախկինում օգտագործված ինհիբիտորների օրինակներ են վերապամիլը և ցիկլոսպորին A15-ը:Այս աշխատանքը ներառում է մկնիկի համակարգի ստեղծում՝ B(a)P-ով առաջացած թոքերի քաղցկեղն ուսումնասիրելու համար՝ գնահատելու Չինաստանից և Կորեայից տարբեր կարմիր ժենշենի քաղվածքների՝ չարորակ ուռուցքների վրա ազդելու կարողությունը:Քաղվածքները անհատապես վերլուծվել են՝ բացահայտելու հատուկ գինսենոզիդներ, որոնք կարող են ազդել քաղցկեղի վրա:Վերապամիլն այնուհետև օգտագործվել է P-gp-ին թիրախավորելու և քաղցկեղի դեմ ուղղված ginsenosides-ի բերանի խոռոչի կենսամատչելիությունը և բուժական արդյունավետությունը բարելավելու համար:
Մեխանիզմը, որով ժենշենի սապոնինները թերապևտիկ ազդեցություն են ունենում քաղցկեղի առաջացման վրա, մնում է անհասկանալի:Հետազոտությունները ցույց են տվել, որ տարբեր ginsenosides կարող են նվազեցնել ԴՆԹ-ի վնասը քաղցկեղածինների կողմից՝ նվազեցնելով օքսիդատիվ սթրեսը և ակտիվացնելով II փուլի դետոքսիկացման ֆերմենտները՝ դրանով իսկ կանխելով բջիջների վնասումը:Գլուտատիոն S-տրանսֆերազը (GST) II փուլի բնորոշ ֆերմենտ է, որն անհրաժեշտ է քաղցկեղածինների պատճառով ԴՆԹ-ի վնասը նվազեցնելու համար17:Միջուկային էրիթրոիդ 2-ի հետ կապված գործոն 2-ը (Nrf2) տրանսկրիպցիոն կարևոր գործոն է, որը կարգավորում է ռեդոքս հոմեոստազը և ակտիվացնում է II փուլի ֆերմենտների և ցիտոպրոտեկտիվ հակաօքսիդանտների արտահայտումը18:Մեր ուսումնասիրությունը նաև ուսումնասիրել է հայտնաբերված ginsenosides-ի ազդեցությունը B(a)P-ի ազդեցությամբ ցիտոտոքսիկության և BPDE-DNA հավելումների ձևավորման վրա, ինչպես նաև II փուլի ֆերմենտների առաջացման վրա՝ նորմալ թոքերի բջիջներում Nrf2 ուղին մոդուլավորելով:
B(a)P-ով առաջացած քաղցկեղի մկնիկի մոդելի ստեղծումը համահունչ է նախորդ աշխատանքին5:Նկար 1Ա-ն ցույց է տալիս մկան քաղցկեղի մոդելի 20-շաբաթյա բուժման փորձարարական ձևավորումը, որը առաջացել է B(a)P-ով, ջրով (հսկողությամբ), չինական կարմիր ժենշենի էքստրակտով (CRG), կորեական կարմիր ժենշենի էքստրակտով A (KRGA) և կորեական կարմիրով: ժենշենգ.Էքստրակտ B (KRGB) և կորեական կարմիր ժենշենի էքստրակտ C (KRGC):Կարմիր ժենշենի բուժումից 20 շաբաթ հետո մկները զոհաբերվեցին CO2 շնչահեղձության միջոցով:Նկար 1B-ում պատկերված են թոքերի մակրոսկոպիկ ուռուցքները կենդանիների մոտ, որոնք բուժվել են կարմիր ժենշենի տարբեր տեսակներով, իսկ Նկար 1C-ում ներկայացված է ուռուցքային նմուշի ներկայացուցչական լուսային միկրոգրաֆիա:KRGB-ով բուժվող կենդանիների ուռուցքային ծանրաբեռնվածությունը (1,5 ± 0,35) ավելի ցածր էր, քան հսկիչ կենդանիներինը (0,82 ± 0,2, P <0,05), ինչպես ցույց է տրված Նկար 1D-ում:Ուռուցքային բեռի արգելակման միջին աստիճանը կազմել է 45%:Փորձարկված կարմիր ժենշենի այլ քաղվածքները չեն ցույց տվել ուռուցքային ծանրաբեռնվածության նման զգալի փոփոխություններ (P > 0.05):Կարմիր ժենշենի բուժման 20 շաբաթվա ընթացքում մկնիկի մոդելում ակնհայտ կողմնակի ազդեցություններ չեն նկատվել, ներառյալ մարմնի քաշի փոփոխություն (տվյալները ցույց չեն տալիս) և լյարդի կամ երիկամների թունավորության բացակայություն (Նկար 1E,F):
Կարմիր ժենշենի էքստրակտը բուժում է թոքերի ուռուցքի զարգացումը A/J մկների մոտ:(Ա) Փորձարարական ձևավորում.(B) Թոքերի մեծ ուռուցքները մկան մոդելում:Ուռուցքները նշվում են սլաքներով:ա. Չինական կարմիր ժենշենի խումբ:բ՝ կորեական կարմիր ժենշենի A խումբ:գ. կորեական կարմիր ժենշենի խումբ B. դ. կորեական կարմիր ժենշենի խումբ C. դ. վերահսկիչ խումբ:(C) Թեթև միկրոգրաֆիա, որը ցույց է տալիս թոքերի ուռուցքը:Խոշորացում՝ 100. բ՝ 400. (D) Ուռուցքային բեռը կարմիր ժենշենի էքստրակտի խմբում։(E) Լյարդի ALT ֆերմենտի պլազմային մակարդակները:(F) Երիկամային ֆերմենտի պլազմայում Cr.Տվյալներն արտահայտվում են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05.
Այս ուսումնասիրության մեջ հայտնաբերված կարմիր ժենշենի քաղվածքները վերլուծվել են գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով (UPLC-MS/MS)՝ քանակականացնելու հետևյալ գինսենոզիդները՝ Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 և Rg5:Անալիտիկները չափելու համար օգտագործվող UPLC և MS պայմանները նկարագրված են նախորդ զեկույցում19:Չորս կարմիր ժենշենի քաղվածքների UPLC-MS/MS քրոմատոգրամները ներկայացված են Նկար 2Ա-ում:Գինսենոզիդի ընդհանուր պարունակության մեջ զգալի տարբերություններ կային, ընդ որում CRG-ում ամենաբարձր ընդհանուր ginsenoside պարունակությամբ (590.27 ± 41.28 μmol/L) (Նկար 2B):Առանձին գինսենոզիդների գնահատման ժամանակ (Նկար 2C), KRGB-ն ցույց է տվել G-Rg3-ի ամենաբարձր մակարդակը մյուս գինսենոզիդների համեմատ (58,33 ± 3,81 մկմոլ/լ G-Rg3s-ի համար և 41,56 ± 2,88 մկմոլ/լ G-Rg3r):L):կարմիր ժենշենի տեսակ (P <0,001):G-Rg3-ը առաջանում է որպես G-Rg3r և G-Rg3s զույգ ստերեոիզոմերներ, որոնք տարբերվում են հիդրօքսիլ խմբի դիրքով ածխածնի 20-ում (նկ. 2D):Արդյունքները ցույց են տալիս, որ G-Rg3r-ը կամ G-Rg3-ը կարող են ունենալ կարևոր հակաքաղցկեղային ներուժ B(a)P-ով առաջացած քաղցկեղային մկան մոդելում:
Գինսենոզիդների պարունակությունը կարմիր ժենշենի տարբեր քաղվածքներում:(A) UPLC-MS/MS չորս կարմիր ժենշենի քաղվածքների քրոմատոգրամներ:(B) Գինսենոզիդի ընդհանուր պարունակության գնահատում նշված էքստրակտներում:(C) Առանձին գինսենոզիդների հայտնաբերում պիտակավորված քաղվածքներում:(D) G-Rg3r և G-Rg3s ginsenoside ստերեոիզոմերների կառուցվածքները:Տվյալներն արտահայտվում են որպես եռակի որոշումների միջին ± ստանդարտ շեղում:***P <0,001.
UPLC-MS/MS ուսումնասիրությունը պահանջում էր գինսենոզիդների քանակական չափում աղիների և արյան նմուշներում 20 շաբաթ բուժումից հետո:KRGB-ով բուժումը ցույց է տվել արյան մեջ ընդամենը 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5-ի առկայություն:Գինսենոզիդների մնացորդներ չեն հայտնաբերվել, ինչը վկայում է բերանի խոռոչի անբավարար կենսամատչելիության մասին և, հետևաբար, այս գինսենոզիդների ազդեցության նվազեցմանը:
Հաստ աղիքի ադենոկարցինոմայի Caco-2 բջջային գիծը մորֆոլոգիապես և կենսաքիմիապես նման է մարդու աղիքային էպիթելի բջիջներին՝ ցույց տալով դրա օգտակարությունը աղիքային էպիթելի պատնեշով էնտերոցիտների տեղափոխումը գնահատելու համար:Այս վերլուծությունը հիմնված էր ավելի վաղ կատարված ուսումնասիրության վրա 20:Նկարներ 3A,B,C,D,E,F ցույց են տալիս G-Rg3r-ի և G-Rg3-ի միջբջջային փոխադրման ներկայացուցչական պատկերները՝ օգտագործելով Caco-2 միաշերտ մոդելը:G-Rg3r-ի կամ G-Rg3-ի տրանսբջջային փոխադրումը Caco-2-ի միաշերտերով բազալերայինից դեպի գագաթային կողմ (Pb-a) զգալիորեն ավելի բարձր է եղել, քան գագաթայինից բազոկողային (Pa-b):G-Rg3r-ի համար Pa-b-ի միջին արժեքը եղել է 0,38 ± 0,06, որը աճել է մինչև 0,73 ± 0,06 50 մկմոլ/լ վերապամիլով բուժումից հետո և մինչև 1,14 ± 0,09՝ 100 մկմոլ/լ վերապամիլով բուժումից հետո (p < 0,01 և 0,01 p<0,01): համապատասխանաբար Նկար 2):3Ա):G-Rg3-ի դիտարկումները հետևել են նմանատիպ օրինակին (նկ. 3B), և արդյունքները ցույց են տվել, որ վերապամիլով բուժումը ուժեղացրել է G-Rg3r-ի և G-Rg3-ի փոխադրումը:Վերապամիլով բուժումը նաև հանգեցրել է Pb-a և G-Rg3r և G-Rg3s արտահոսքի միջին գործակիցների զգալի նվազմանը (Նկար 3C,D,E,F), ինչը ցույց է տալիս, որ վերապամիլով բուժումը նվազեցնում է ginsenoside պարունակությունը Caco-2 արտահոսքի բջիջներում:.
G-Rg3-ի տրանսբջջային փոխադրումը Caco-2 մենաշերտներում և աղիքային կլանումը առնետների պերֆուզիայի վերլուծության մեջ:(A) G-Rg3r խմբի Pa-b արժեքը Caco-2 միաշերտում:(B) G-Rg3s խմբերի Pa-b արժեքը Caco-2 միաշերտում:(C) G-Rg3r խմբի Pb արժեքը Caco-2 միաշերտում:(D) G-Rg3s խմբերի Pb արժեքը Caco-2 միաշերտում:(E) G-Rg3r խմբերի ելքի հարաբերակցությունը Caco-2 միաշերտում:(F) G-Rg3 խմբերի ելքի հարաբերակցությունը Caco-2 միաշերտում:(G) G-Rg3r-ի աղիքային կլանման տոկոսը առնետների պերֆուզիայի վերլուծության ժամանակ:(H) G-Rg3-ի աղիքային կլանման տոկոսը առնետների պերֆուզիայի վերլուծության ժամանակ:Անթափանցելիությունը և կլանումը համեմատվել են առանց վերապամիլի ավելացման:Տվյալներն արտահայտվում են որպես հինգ անկախ փորձերի միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001:
Նախկին աշխատանքին համապատասխան20, առնետների օրթոտոպիկ աղիքային պերֆուզիա է իրականացվել՝ որոշելու, թե արդյոք G-Rg3-ի կլանումը աղիներում ավելանում է վերապամիլով բուժումից հետո:Նկարներ 3G,H ցույց են տալիս ներկայացուցչական պերֆուզիայի անալիզները՝ գնահատելու G-Rg3r-ի և G-Rg3-ի աղիքային կլանման տոկոսը քաղցկեղի մոդելային առնետների մոտ վերը նշված ժամանակահատվածներում:Մոտավորապես 10% թույլ G-Rg3r-ի կլանման սկզբնական տոկոսը 50 մկմ վերապամիլով բուժումից հետո աճել է մինչև ավելի քան 20%, իսկ 100 մկմ վերապամիլով բուժումից հետո՝ ավելի քան 25%:Նմանապես, G-Rg3-ը, որն ուներ նախնական կլանումը 10%, նույնպես ցույց տվեց գագաթնակետը ավելի քան 20% 50 μM verapamil-ով բուժումից հետո և գրեթե 30% հետո 100 μM verapamil, ինչը ենթադրում է, որ P-gp-ի արգելակումը verapamil-ով ուժեղացնում է: աղիքային G-կլանումը Rg3 մկնիկի թոքերի քաղցկեղի մոդելում:
Համաձայն վերը նշված մեթոդի, B(a)P-ով առաջացած քաղցկեղի մոդելային մկները պատահականորեն բաժանվել են վեց խմբերի, ինչպես ցույց է տրված Նկար 4Ա-ում:Քաշի զգալի կորուստ կամ թունավորության կլինիկական նշաններ չեն նկատվել G-Rg3 բուժման խմբում՝ համեմատած հսկիչ խմբի հետ (տվյալները ցույց չեն տրված):Բուժումից 20 շաբաթ հետո հավաքվել են յուրաքանչյուր մկան թոքերը:Նկար 4B-ում ներկայացված են թոքերի մակրոսկոպիկ ուռուցքները մկների մոտ վերը նշված բուժման խմբերում, իսկ Նկար 4C-ում ներկայացված է ներկայացուցչական ուռուցքի ներկայացուցչական լուսային միկրոգրաֆը:Ինչ վերաբերում է ուռուցքի ծանրաբեռնվածությանը յուրաքանչյուր խմբում (նկ. 4D), G-Rg3r և G-Rg3s-ով բուժված մկների արժեքները համապատասխանաբար եղել են 0,75 ± 0,29 մմ3 և 0,81 ± 0,30 մմ3, մինչդեռ G- մկների համար բուժված արժեքները -Rg3-ով համապատասխանաբար 1,63 ±0,40 մմ3 էին:հսկիչ մկներ (p <0,001), ինչը ցույց է տալիս, որ G-Rg3 բուժումը նվազեցնում է ուռուցքային բեռը մկների մոտ:Verapamil-ի օգտագործումը հետագայում մեծացրեց այս կրճատումը. verapamil+ G-Rg3r մկների արժեքները 0,75 ± 0,29 մմ3-ից նվազել են մինչև 0,33 ± 0,25 մմ3 (p <0,01), իսկ verapamil+-ի արժեքները 0,81 ± 0,30 մմ3 նվազել են մինչև 0,81 ± 0,30 մմ3: mm3 G. -Rg3s-ով բուժված մկների մոտ (p <0.05), ինչը ցույց է տալիս, որ verapamil-ը կարող է ուժեղացնել G-Rg3-ի արգելակող ազդեցությունը ուռուցքի առաջացման վրա:Ուռուցքի ծանրաբեռնվածությունը զգալի տարբերություններ չցուցաբերեց հսկիչ խմբի և verapamil խմբի, G-Rg3r խմբի և G-Rg3s խմբի և verapamil+G-Rg3r խմբի և verapamil+G-Rg3s խմբի միջև:Ավելին, գնահատված բուժման հետ կապված լյարդի կամ երիկամների զգալի թունավորումներ չեն եղել (Նկար 4E, F):
Ուռուցքի ծանրաբեռնվածությունը G-Rg3 բուժումից հետո և պլազմային կամ աղիքային G-Rg3r և G-Rg3 մակարդակները նշված խմբերում:(Ա) Փորձարարական ձևավորում.(B) Մակրոսկոպիկ ուռուցքներ մկնիկի մոդելում:Ուռուցքները նշվում են սլաքներով:ա՝ G-Rg3r.բ՝ G-Rg3s.գ՝ G-Rg3r՝ վերապամիլի հետ համակցված:դ՝ G-Rg3՝ վերապամիլի հետ համատեղ:դ. Վերապամիլ:ե. վերահսկողություն.(C) Ուռուցքի օպտիկական միկրոգրաֆիա խոշորացումով:Պատասխան՝ 100x.b: 400X.(D) G-Rg3 + verapamil բուժման ազդեցությունը ուռուցքային բեռի վրա A/J մկների մոտ:(E) Լյարդի ALT ֆերմենտի պլազմային մակարդակները:(F) Երիկամային ֆերմենտի պլազմայում Cr.(G) Նշված խմբերի G-Rg3r կամ G-Rg3 մակարդակները պլազմայում:(H) G-Rg3r կամ G-Rg3s մակարդակները նշված խմբերի աղիքներում:Տվյալներն արտահայտվում են որպես եռակի որոշումների միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001:
G-Rg3 մակարդակները B(a)P-ով առաջացած քաղցկեղի մոդելային մկների մոտ գնահատվել են UPLC-MS/MS-ով 20-շաբաթյա բուժման ժամանակահատվածից հետո՝ համաձայն Մեթոդներ բաժնում նկարագրված մեթոդի:4G և H նկարները ցույց են տալիս համապատասխանաբար պլազմային և աղիքային G-Rg3 մակարդակները:Պլազմայում G-Rg3r-ի մակարդակը եղել է 0,44 ± 0,32 մկմոլ/լ և ավելացել է մինչև 1,17 ± 0,47 մկմոլ/լ՝ վերապամիլի միաժամանակյա ընդունմամբ (p <0,001), մինչդեռ աղիքային G-Rg3r մակարդակը եղել է 0,53 ± 0,08 մկգ/լ։Վերապամիլի հետ զուգակցվելիս գ-ն ավելացել է մինչև 1,35 ± 0,13 մկգ/գ (p <0,001):G-Rg3-ի համար արդյունքները հետևեցին նմանատիպ օրինակին, ինչը ցույց է տալիս, որ verapamil-ով բուժումը բարձրացրել է G-Rg3-ի բանավոր կենսամատչելիությունը A/J մկների մոտ:
Բջիջների կենսունակության վերլուծությունը օգտագործվել է B(a)P-ի և G-Rg3-ի ցիտոտոքսիկությունը գնահատելու համար hEL բջիջների վրա:hEL բջիջներում B(a)P-ով առաջացած ցիտոտոքսիկությունը ցույց է տրված Նկար 5Ա-ում, մինչդեռ G-Rg3r-ի և G-Rg3-ի ոչ թունավոր հատկությունները ներկայացված են 5A և 5B նկարներում:5B, C. G-Rg3-ի ցիտոպրոտեկտիվ ազդեցությունը գնահատելու համար B(a)P-ը G-Rg3r-ի կամ G-Rg3-ի տարբեր կոնցենտրացիաների հետ միաժամանակ ներդրվել է hEL բջիջներում:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 5D-ում, G-Rg3r-ը 5 μM, 10 μM և 20 μM կոնցենտրացիաների դեպքում վերականգնեց բջիջների կենսունակությունը համապատասխանաբար մինչև 58.3%, 79.3% և 77.3%:Նմանատիպ արդյունքներ կարելի է տեսնել նաև G-Rg3s խմբում:Երբ G-Rg3-ի կոնցենտրացիաները եղել են 5 մկՄ, 10 մկՄ և 20 մկՄ, բջիջների կենսունակությունը վերականգնվել է համապատասխանաբար մինչև 58,3%, 72,7% և 76,7% (Նկար 5E):):BPDE-DNA հավելումների առկայությունը չափվել է ELISA հավաքածուի միջոցով:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ BPDE-DNA հավելումների մակարդակն ավելացել է B(a)P-ով բուժված խմբում` համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, բայց համեմատած G-Rg3 համատեղ բուժման հետ, BPDE-DNA հավելումների մակարդակները B(a)P խմբում: Բ բուժվող խմբում ԴՆԹ-ի հավելումների մակարդակը զգալիորեն նվազել է:Միայն B(a)P-ով բուժման արդյունքները ներկայացված են Նկար 5F-ում (1,87 ± 0,33 ընդդեմ 3,77 ± 0,42 G-Rg3r-ի համար, 1,93 ± 0,48 ընդդեմ 3,77 ± 0,42 G-Rg3s-ի համար, p <0,0):
Բջջի կենսունակությունը և BPDE-DNA հավելումների ձևավորումը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են G-Rg3 և B(a)P-ով:(Ա) B(a)P-ով մշակված hEL բջիջների կենսունակություն:(Բ) G-Rg3r-ով մշակված hEL բջիջների կենսունակություն:(C) G-Rg3-ով մշակված hEL բջիջների կենսունակություն:(D) B(a)P և G-Rg3r-ով մշակված hEL բջիջների կենսունակություն:(E) B(a)P և G-Rg3-ով մշակված hEL բջիջների կենսունակություն:(F) BPDE-DNA հավելումների մակարդակները hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P և G-Rg3-ով:Տվյալներն արտահայտվում են որպես եռակի որոշումների միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001:
GST ֆերմենտի արտահայտությունը հայտնաբերվել է 10 μM B(a)P և 10 μM G-Rg3r կամ G-Rg3s համատեղ բուժումից հետո:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ B(a)P-ն ճնշում է GST-ի արտահայտվածությունը (59,7 ± 8,2% G-Rg3r խմբում և 39 ± 4,5% G-Rg3s խմբում), իսկ B(a)P-ն կապված է կամ G-Rg3r-ի հետ: , կամ G-Rg3r-ով, կամ G-Rg3r-ով:G-Rg3s-ի հետ համատեղ բուժումը վերականգնեց GST արտահայտությունը:GST արտահայտությունը (103.7 ± 15.5% G-Rg3r խմբում և 110 ± 11.1% G-Rg3s խմբում, p <0.05 և p <0.001, համապատասխանաբար, նկ. 6A, B և C):GST-ի ակտիվությունը գնահատվել է ակտիվության վերլուծության հավաքածուի միջոցով:Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ համակցված բուժման խումբն ուներ GST-ի ավելի բարձր ակտիվություն՝ համեմատած միայն B(a)P խմբի հետ (96.3 ± 6.6% ընդդեմ 35.7 ± 7.8% G-Rg3r խմբում ընդդեմ 92.3 ± 6.5 G-Rg3r խմբում: ):% ընդդեմ 35,7 ± 7,8% G-Rg3s խմբում, p <0,001, Նկար 6D):
GST-ի և Nrf2-ի արտահայտումը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P-ով և G-Rg3-ով:(Ա) GST արտահայտության հայտնաբերում Western blotting-ով:(B) GST-ի քանակական արտահայտությունը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P-ով և G-Rg3r-ով:(C) GST-ի քանակական արտահայտությունը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P և G-Rg3s-ով:(D) GST ակտիվությունը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P-ով և G-Rg3-ով:(E) Nrf2 արտահայտության հայտնաբերում Western blotting-ով:(F) Nrf2-ի քանակական արտահայտությունը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P-ով և G-Rg3r-ով:(G) Nrf2-ի քանակական արտահայտությունը hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P և G-Rg3s-ով:Տվյալներն արտահայտվում են որպես եռակի որոշումների միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001:
B(a)P-ի պատճառած ուռուցքի առաջացման G-Rg3-ով պայմանավորված ճնշելու ուղիները պարզաբանելու համար Nrf2-ի էքսպրեսիան գնահատվել է Western blotting-ով:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 6E,F,G-ում, համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, B(a)P բուժման խմբում միայն Nrf2-ի մակարդակը նվազել է.սակայն, համեմատած B(a)P բուժման խմբի հետ, B(a) Nrf2 մակարդակները PG-Rg3 խմբում ավելացել են (106 ± 9,5% G-Rg3r-ի համար՝ ընդդեմ 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2%՝ G-Rg3r ընդդեմ 41 ± 9.8% G-Rg3s-ի համար, p <0.01):
Մենք հաստատեցինք Nrf2-ի կանխարգելիչ դերը՝ ճնշելով Nrf2 արտահայտությունը, օգտագործելով հատուկ փոքր միջամտող ՌՆԹ (siRNA):Nrf2 նոկդաունը հաստատվել է Western blotting-ով (Նկար 7A,B):Ինչպես ցույց է տրված Նկար 7C,D-ում, hEL բջիջների համատեղ բուժումը B(a)P-ով և G-Rg3-ով հանգեցրել է BPDE-DNA հավելումների քանակի նվազմանը (1.47 ± 0.21)՝ համեմատած B(a)P-ով բուժման հետ: միայն վերահսկիչ siRNA խմբում:) G-Rg3r-ը 4,13 ± 0,49 էր, G-Rg3s-ը 1,8 ± 0,32 և 4,1 ± 0,57, p <0,01):Այնուամենայնիվ, G-Rg3-ի արգելակող ազդեցությունը BPDE-DNA-ի ձևավորման վրա վերացվել է Nrf2 նոկդաունի միջոցով:siNrf2 խմբում էական տարբերություն չկար BPDE-DNA հավելումների ձևավորման մեջ B(a)P և G-Rg3 համատեղ բուժման և միայն B(a)P բուժման միջև (3.0 ± 0.21 G-Rg3r-ի համար ընդդեմ 3.56 ± 0.32-ի: ):G-Rg3r-ի համար՝ ընդդեմ 3.6-ի՝ G-Rg3s-ի՝ ±0.45-ի դիմաց՝ 4.0±0.37-ի դիմաց, p > 0.05):
Nrf2 նոկդաունի ազդեցությունը hEL բջիջներում BPDE-DNA հավելումների ձևավորման վրա:(A) Nrf2 նոկդաունը հաստատվել է Western blotting-ով:(B) Nrf2 գոտու ինտենսիվության քանակականացում:(C) Nrf2 նոկդաունի ազդեցությունը BPDE-DNA հավելումների մակարդակների վրա hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P և G-Rg3r-ով:(D) Nrf2 նոկդաունի ազդեցությունը BPDE-DNA հավելումների մակարդակների վրա hEL բջիջներում, որոնք մշակվել են B(a)P և G-Rg3-ով:Տվյալներն արտահայտվում են որպես եռակի որոշումների միջին ± ստանդարտ շեղում:*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001:
Այս ուսումնասիրությունը գնահատել է տարբեր կարմիր ժենշենի էքստրակտների կանխարգելիչ ազդեցությունները B(a)P-ով առաջացած թոքերի քաղցկեղի մկան մոդելի վրա, իսկ KRGB բուժումը զգալիորեն նվազեցրել է ուռուցքի ծանրաբեռնվածությունը:Հաշվի առնելով, որ G-Rg3-ն ունի ամենաբարձր պարունակությունը այս ժենշենի էքստրակտում, ուսումնասիրվել է այս ginsenoside-ի կարևոր դերը ուռուցքի առաջացման արգելակման գործում:Թե՛ G-Rg3r-ը, և թե՛ G-Rg3-ը (G-Rg3-ի երկու էպիմերներ) զգալիորեն նվազեցրին ուռուցքի ծանրաբեռնվածությունը B(a)P-ով առաջացած քաղցկեղի մկնիկի մոդելում:G-Rg3r-ը և G-Rg3-ն ունեն հակաքաղցկեղային ազդեցություն՝ հրահրելով ուռուցքային բջիջների ապոպտոզ21, արգելակելով ուռուցքի աճը22, կասեցնելով բջջային ցիկլը23 և ազդելով անգիոգենեզի վրա24:Ապացուցված է, որ G-Rg3-ը նաև արգելակում է բջջային մետաստազները25, և G-Rg3-ի կարողությունը ուժեղացնելու քիմիաթերապիայի և ռադիոթերապիայի ազդեցությունը փաստագրված է26,27:Պունը և ուրիշները ցույց են տվել, որ G-Rg3 բուժումը կարող է նվազեցնել B(a)P28-ի գենոտոքսիկ ազդեցությունները:Այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս G-Rg3-ի թերապևտիկ ներուժը շրջակա միջավայրի քաղցկեղածին մոլեկուլների թիրախավորման և քաղցկեղի կանխարգելման գործում:
Չնայած նրանց լավ պրոֆիլակտիկ ներուժին, ginsenosides-ի վատ բանավոր կենսահասանելիությունը մարտահրավեր է այս մոլեկուլների կլինիկական օգտագործման համար:Առնետների մեջ գինսենոզիդների բանավոր ընդունման ֆարմակոկինետիկ վերլուծությունը ցույց է տվել, որ դրա կենսամատչելիությունը դեռևս 5%-ից պակաս է29:Այս թեստերը ցույց են տվել, որ 20-շաբաթյա բուժման ժամանակահատվածից հետո արյան մեջ միայն Rg5-ի մակարդակը նվազել է:Թեև վատ կենսահասանելիության հիմքում ընկած մեխանիզմը դեռևս պետք է պարզվի, ենթադրվում է, որ P-gp-ն ներգրավված է գինսենոզիդների արտահոսքի մեջ:Այս աշխատանքը առաջին անգամ ցույց տվեց, որ վերապամիլի՝ P-gp-արգելափակիչի օգտագործումը մեծացնում է G-Rg3r-ի և G-Rg3s-ի բանավոր կենսահասանելիությունը:Այսպիսով, այս բացահայտումը ենթադրում է, որ G-Rg3r-ը և G-Rg3-ը գործում են որպես P-gp-ի ենթաշերտեր՝ կարգավորելու դրա արտահոսքը:
Այս աշխատանքը ցույց է տալիս, որ վերապամիլով համակցված բուժումը մեծացնում է G-Rg3-ի բերանի խոռոչի կենսահասանելիությունը թոքերի քաղցկեղի մկան մոդելում:Այս բացահայտումը հաստատվում է P-gp-ի շրջափակման ժամանակ G-Rg3-ի աղիքային միջբջջային փոխադրման ավելացմամբ՝ դրանով իսկ մեծացնելով դրա կլանումը:Caco2 բջիջների վերլուծությունները ցույց են տվել, որ վերապամիլով բուժումը նվազեցնում է G-Rg3r և G-Rg3s արտահոսքը՝ միաժամանակ բարելավելով թաղանթների թափանցելիությունը:Yang et al.Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ցիկլոսպորին A-ով (մեկ այլ P-gp-արգելափակիչ) բուժումը մեծացնում է գինսենոզիդ Rh2-ի կենսամատչելիությունը 1%20-ից մինչև 30%:Նմանատիպ արդյունքներ են ցույց տվել նաև գինսենոզիդների K և Rg1 միացությունները30,31:Երբ verapamil-ը և cyclosporin A-ն միաժամանակ կիրառվել են, միացության K-ի արտահոսքը Caco-2 բջիջներում զգալիորեն կրճատվել է 26.6-ից մինչև 3-ից պակաս, մինչդեռ դրա ներբջջային մակարդակն աճել է 40 անգամ30:Վերապամիլի առկայության դեպքում Rg1-ի մակարդակն ավելացել է առնետի թոքերի էպիթելային բջիջներում, ինչը ենթադրում է P-gp-ի դերը գինսենոզիդային արտահոսքի մեջ, ինչպես ցույց է տվել Meng et al.31-ը:Այնուամենայնիվ, verapamil-ը նույն ազդեցությունը չուներ որոշ գինսենոզիդների (օրինակ՝ Rg1, F1, Rh1 և Re) արտահոսքի վրա, ինչը ցույց է տալիս, որ դրանք չեն ազդում P-gp սուբստրատների վրա, ինչպես ցույց է տրված Liang et al.32 .Այս դիտարկումը կարող է կապված լինել այլ փոխադրողների և այլընտրանքային ginsenoside կառույցների ներգրավման հետ:
Քաղցկեղի վրա G-Rg3-ի կանխարգելիչ ազդեցության մեխանիզմը պարզ չէ:Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ G-Rg3-ը կանխում է ԴՆԹ-ի վնասը և ապոպտոզը՝ նվազեցնելով օքսիդատիվ սթրեսը և բորբոքումը16,33, որը կարող է լինել B(a)P-ով պայմանավորված ուռուցքի առաջացման հիմքում ընկած մեխանիզմը:Որոշ զեկույցներ ցույց են տալիս, որ B(a)P-ով առաջացած գենոտոքսիկությունը կարող է կրճատվել II փուլի ֆերմենտների մոդուլյացիայի միջոցով՝ ձևավորելով BPDE-DNA34:GST-ը II փուլի տիպիկ ֆերմենտ է, որն արգելակում է BPDE-DNA հավելումների ձևավորումը՝ խթանելով GSH-ի միացումը BPDE-ին, դրանով իսկ նվազեցնելով B(a)P35-ով առաջացած ԴՆԹ-ի վնասը:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ G-Rg3 բուժումը նվազեցնում է B(a)P-ի պատճառած ցիտոտոքսիկությունը և BPDE-DNA հավելումների ձևավորումը hEL բջիջներում և վերականգնում է GST-ի արտահայտությունն ու ակտիվությունը in vitro:Այնուամենայնիվ, այս ազդեցությունները բացակայում էին Nrf2-ի բացակայության դեպքում՝ ենթադրելով, որ G-Rg3-ն առաջացնում է ցիտոպրոտեկտիվ ազդեցություն Nrf2 ուղու միջոցով:Nrf2-ը II փուլի դետոքսիկացման ֆերմենտների տրանսկրիպցիոն հիմնական գործոնն է, որը նպաստում է քսենոբիոտիկների մաքրմանը36:Nrf2 ուղու ակտիվացումը առաջացնում է ցիտոպաշտպանություն և նվազեցնում հյուսվածքների վնասը37:Ավելին, մի քանի զեկույցներ հաստատել են Nrf2-ի դերը որպես ուռուցքային ճնշող քաղցկեղի առաջացման գործում38:Մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ G-Rg3-ով Nrf2 ուղու ինդուկցիան կարևոր կարգավորիչ դեր է խաղում B(a)P-ի գենոտոքսիկության մեջ՝ առաջացնելով B(a)P դետոքսիկացիա՝ ակտիվացնելով II փուլի ֆերմենտները՝ դրանով իսկ արգելելով ուռուցքի առաջացման գործընթացը:
Մեր աշխատանքը բացահայտում է կարմիր ժենշենի ներուժը մկների մոտ B(a)P-ի պատճառած թոքերի քաղցկեղի կանխարգելման գործում՝ ginsenoside G-Rg3-ի կարևոր ներգրավման միջոցով:Այս մոլեկուլի բերանի խոռոչի վատ կենսահասանելիությունը խոչընդոտում է դրա կլինիկական կիրառմանը:Այնուամենայնիվ, այս ուսումնասիրությունն առաջին անգամ ցույց է տալիս, որ G-Rg3-ը P-gp-ի սուբստրատ է, և P-gp ինհիբիտորի ընդունումը մեծացնում է G-Rg3-ի կենսամատչելիությունը in vitro և in vivo:G-Rg3-ը նվազեցնում է B(a)P-ով առաջացած ցիտոտոքսիկությունը՝ կարգավորելով Nrf2 ուղին, որը կարող է լինել դրա կանխարգելիչ ֆունկցիայի պոտենցիալ մեխանիզմ:Մեր ուսումնասիրությունը հաստատում է ginsenoside G-Rg3-ի ներուժը թոքերի քաղցկեղի կանխարգելման և բուժման համար:
Վեց շաբաթական էգ A/J մկներ (20 ± 1 գ) և 7 շաբաթական արու Wistar առնետներ (250 ± 20 գ) ստացվել են Ջեքսոնի լաբորատորիայից (Բար Հարբոր, ԱՄՆ) և Ուհանի կենդանաբանության ինստիտուտից:Համալսարան (Ուհան, Չինաստան).Չինական Type Culture Collection Center-ը (Ուհան, Չինաստան) մեզ տրամադրեց Caco-2 և hEL բջիջներ:Սիգմա-Օլդրիխը (Սենթ Լուիս, ԱՄՆ) B(a)P-ի և տրիապրինի աղբյուր է։Մաքրված ginsenosides G-Rg3r և G-Rg3s, dimethyl sulfoxide (DMSO), CellTiter-96 proliferation assay kit (MTS), verapamil, նվազագույն էական միջավայր (MEM) և պտղի խոզի շիճուկ (FBS) գնվել են Chengdu Must Bio-Technology-ից: .Co., Ltd.(Չենդու, Չինաստան):QIAamp DNA մինի հավաքածուն և BPDE-DNA հավելումների ELISA հավաքածուն գնվել են Qiagen-ից (Սթենֆորդ, Կալիֆորնիա, ԱՄՆ) և Cell Biolabs-ից (Սան Դիեգո, Կալիֆորնիա, ԱՄՆ):GST-ի ակտիվության վերլուծության հավաքածուն և ընդհանուր սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուն (ստանդարտ BCA մեթոդ) գնվել են Solarbio-ից (Պեկին, Չինաստան):Բոլոր կարմիր ժենշենի քաղվածքները պահվում են Mingyu Laboratory 7-ում: Հոնկոնգի բապտիստական ​​համալսարանը (Հոնկոնգ, Չինաստան) և Կորեայի քաղցկեղի կենտրոնը (Սեուլ, Կորեա) CRG-ի էքստրակտի և տարբեր կորեական ծագման կարմիր ժենշենի (ներառյալ KRGA, KRGB) առևտրային աղբյուրներն են: և KRGC):Կարմիր ժենշենը պատրաստվում է 6-ամյա թարմ ժենշենի արմատներից։Կարմիր ժենշենի էքստրակտը ստացվում է ժենշենը երեք անգամ ջրով լվանալով, այնուհետև խտացնելով ջրային էքստրակտը և վերջապես չորացնելով ցածր ջերմաստիճանում՝ ստանալով ժենշենի էքստրակտի փոշի։Հակամարմիններ (հակամարմիններ (հակա-Nrf2, հակա-GST և β-ակտին), ծովաբողկի պերօքսիդազով կոնյուգացված հակաճագարային իմունոգոլոբուլին G (IgG), տրանսֆեկցիոն ռեագենտ, վերահսկիչ siRNA և Nrf2 siRNA գնվել են Santa Cruz Biotechnology-ից (Santa Cruz, CA) .), ԱՄՆ).
Caco2-ի և hEL-ի բջիջները մշակվել են 100 մմ2 բջիջների կուլտուրայի անոթներում MEM-ով, որը պարունակում է 10% FBS 37 °C ջերմաստիճանում 5% CO2 խոնավացված մթնոլորտում:Բուժման պայմանների ազդեցությունը որոշելու համար hEL բջիջները ինկուբացվել են B(a)P-ի և G-Rg3-ի տարբեր կոնցենտրացիաներով MEM-ում 48 ժամ:Բջիջները կարող են հետագայում վերլուծվել կամ հավաքվել՝ առանց բջիջների քաղվածքներ պատրաստելու համար:
Բոլոր փորձերը հաստատվել են Տոնջի բժշկական քոլեջի Հուազոնգ գիտության և տեխնոլոգիայի համալսարանի Փորձարարական կենդանիների էթիկայի հանձնաժողովի կողմից (Հաստատում թիվ 2019; գրանցման թիվ 4587TH):Բոլոր փորձարկումներն իրականացվել են համապատասխան ուղեցույցների և կանոնակարգերի համաձայն, և ուսումնասիրությունն իրականացվել է Կենդանիների հետազոտություն. Հաշվետվություն In Vivo Experiments (ARRIVE) ուղեցույցների համաձայն:Ութ շաբաթական A/J մկներին նախ ներարկվել են B(a)P տրիապրին լուծույթով (100 մգ/կգ, 0,2 մլ):Մեկ շաբաթ անց մկներին պատահականորեն բաժանել են հսկիչ խմբերի և բուժման տարբեր խմբերի, յուրաքանչյուր խմբում 15 մկ, և օրական մեկ անգամ գավաթ են արել:20 շաբաթ բուժումից հետո կենդանիները զոհաբերվել են CO2 ասֆիքսիայի պատճառով:Թոքերը հավաքել և ֆիքսել են 24 ժամ։Մակերեսային ուռուցքների քանակը և ուռուցքի առանձին չափերը քանակականացվել են յուրաքանչյուր թոքի համար դիսեկցիոն մանրադիտակի տակ:Ուռուցքի ծավալի գնահատումները (V) հաշվարկվել են՝ օգտագործելով հետևյալ արտահայտությունը՝ V (mm3) = 4/3πr3, որտեղ r-ը ուռուցքի տրամագիծն է:Մկների թոքերի ուռուցքի բոլոր ծավալների զուտ գումարը ներկայացնում էր ուռուցքի ընդհանուր ծավալը, իսկ միջին ընդհանուր ուռուցքի ծավալը յուրաքանչյուր խմբում ներկայացնում էր ուռուցքի բեռը:Ամբողջ արյան և աղիքների նմուշները հավաքվել և պահվել են -80°C ջերմաստիճանում՝ UPLC-MS/MS որոշման համար:Շիճուկը հավաքվեց և ավտոմատացված քիմիական անալիզատոր օգտագործվեց ալանին ամինոտրանսֆերազի (ALT) և շիճուկի կրեատինինի (Cr) մակարդակները վերլուծելու համար՝ լյարդի և երիկամների գործառույթը գնահատելու համար:
Հավաքված նմուշները հանվել են սառը պահեստից, հալվել, կշռվել և տեղադրվել խողովակների մեջ, ինչպես նկարագրված է վերևում:Դրան ավելացվել է 0,5 մկմ ֆլորիզին (ներքին ստանդարտ) 0,8 մլ մեթանոլի լուծույթում:Այնուհետև հյուսվածքը համասեռացվեց Tissue-Tearor-ի միջոցով և համասեռ նյութը այնուհետև տեղափոխվեց 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակ:Խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 15500 պտ/րոպե արագությամբ 15 րոպե:1,0 մլ գերնոր հեղուկը հեռացնելուց հետո չորացնել ազոտով։Վերականգնման համար օգտագործվել է երկու հարյուր միկրոլիտր մեթանոլ։Արյունը հավաքվում և մշակվում է մեկ տողով և օգտագործվում է որպես հղում բոլոր չափումների համար:
24 ջրհորի Transwell թիթեղները սերմանվել են 1,0 × 105 Caco-2 բջիջներով մեկ ջրհորի համար՝ գնահատելու համար G-Rg3 փոխադրման հնարավոր ուժեղացումը վերապամիլի ավելացման միջոցով:3 շաբաթ մշակույթից հետո բջիջները լվացվեցին HBSS-ով և նախաինկուբացվեցին 37°C-ում:400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s կամ խառնուրդ 50 կամ 100 μM վերապամիլով) ներարկվել է միաշերտի բազալերային կամ գագաթային կողմի վրա, իսկ մյուսին ավելացվել է 600 μL HBSS լուծույթ: կողմը.Հավաքեք 100 մկլ կուլտուրայի միջավայր նշանակված ժամերին (0, 15, 30, 45, 60, 90 և 120 րոպե) և ավելացրեք 100 մկլ HBSS՝ այս ծավալը կազմելու համար:Նմուշները պահվել են -4 °C ջերմաստիճանում մինչև UPLC-MS/MS հայտնաբերումը:Papp = dQ/(dT × A × C0) արտահայտությունն օգտագործվում է թվացյալ միակողմանի գագաթային և բազալերային թափանցելիությունը քանակականացնելու համար և հակառակը (համապատասխանաբար Pa-b և Pb-a);dQ/dT-ը կոնցենտրացիայի փոփոխությունն է, A-ն (0,6 սմ2) միաշերտի մակերեսն է, իսկ C0-ը դոնորի նախնական կոնցենտրացիան է:Արտահոսքի հարաբերակցությունը հաշվարկվում է որպես Pb-a/Pa-b, որը ներկայացնում է հետազոտվող դեղամիջոցի արտահոսքի արագությունը:
Արու Wistar առնետներին ծոմ պահեցին 24 ժամ, խմեցին միայն ջուր և անզգայացրին պենտոբարբիտալի 3,5% լուծույթի ներերակային ներարկումով:Ինտուբացված սիլիկոնե խողովակն ունի տասներկումատնյա աղիքի ծայրը որպես մուտք և իլեումի վերջը որպես ելք:Օգտագործեք պերիստալտիկ պոմպ՝ մուտքը 10 μM G-Rg3r կամ G-Rg3s-ով մղելու համար իզոտոնիկ HBSS-ում 0,1 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ:Վերապամիլի ազդեցությունը գնահատվել է 10 մկՄ G-Rg3r կամ G-Rg3s-ին ավելացնելով 50 μM կամ 100 μM միացություն:UPLC-MS/MS իրականացվել է պերֆուզիայի էքստրակտների վրա, որոնք հավաքվել են պերֆուզիայի մեկնարկից 60, 90, 120 և 150 րոպե անց:Կլանման տոկոսը քանակականացվում է % կլանման բանաձևով = (1 – Cout/Cin) × 100%;G-Rg3-ի կոնցենտրացիան ելքի և մուտքի մոտ արտահայտվում է համապատասխանաբար Cout-ով և Cin-ով:
hEL բջիջները ցանվել են 96 ջրհորի թիթեղներում՝ 1 × 104 բջիջ մեկ ջրհորի խտությամբ և մշակվել B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) կամ DMSO-ում լուծարված G-Rg3-ով: .Այնուհետև դեղամիջոցները 48 ժամվա ընթացքում նոսրացրել են կուլտուրայի միջավայրով տարբեր կոնցենտրացիաների (0, 1, 2, 5, 10, 20 մկմ):Օգտագործելով առևտրային հասանելի MTS վերլուծության հավաքածուն, բջիջները ենթարկվել են ստանդարտ արձանագրության, այնուհետև չափվել են միկրոպլատների ընթերցողի միջոցով 490 նմ-ով:B(a)P (10 μM) և G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 մկՄ) համատեղ բուժման խմբերի բջիջների կենսունակության մակարդակը գնահատվել է վերը նշված մեթոդի համաձայն և համեմատվել չմշակված խմբի հետ:
hEL բջիջները ցանվել են 6 ջրհորի թիթեղներում՝ 1 × 105 բջիջ/հոր խտությամբ և մշակվել 10 μMB(a)P-ով 10 μM G-Rg3-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում:48 ժամ բուժումից հետո ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է hEL բջիջներից՝ օգտագործելով QIAamp DNA Mini Kit՝ արտադրողի արձանագրության համաձայն:BPDE-DNA հավելումների ձևավորումը հայտնաբերվել է BPDE-DNA հավելումների ELISA հավաքածուի միջոցով:BPDE-DNA հավելումների հարաբերական մակարդակները չափվել են միկրոպլատների ընթերցողի միջոցով՝ չափելով կլանումը 450 նմ-ում:
hEL բջիջները ցանվել են 96 ջրհորի թիթեղներում՝ 1 × 104 բջիջ մեկ ջրհորի խտությամբ և մշակվել 10 μMB(a)P 48 ժամվա ընթացքում 10 μM G-Rg3-ի բացակայության կամ առկայության դեպքում:GST-ի ակտիվությունը չափվել է GST-ի գործունեության վերլուծության կոմերցիոն հավաքածուի միջոցով՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:GST-ի հարաբերական ակտիվացումը չափվել է ներծծման միջոցով 450 նմ-ում՝ օգտագործելով միկրոափսե ընթերցող:
hEL բջիջները լվացվեցին սառցե PBS-ով և այնուհետև լիզվեցին՝ օգտագործելով ռադիոիմունային նստվածքային վերլուծության բուֆեր, որը պարունակում է պրոտեազի ինհիբիտորներ և ֆոսֆատազի ինհիբիտորներ:Սպիտակուցի քանակականացումից հետո՝ օգտագործելով ընդհանուր սպիտակուցի վերլուծության հավաքածուն, յուրաքանչյուր նմուշի 30 մկգ սպիտակուցն առանձնացվել է 12% SDS-PAGE-ով և էլեկտրոֆորեզով տեղափոխվել PVDF թաղանթ:Թաղանթները արգելափակվել են 5% յուղազերծված կաթով և ինկուբացվել են առաջնային հակամարմիններով գիշերվա ընթացքում 4°C-ում:Ծովաբողկի պերօքսիդազով կոնյուգացված երկրորդական հակամարմիններով ինկուբացիայից հետո ավելացվել են ուժեղացված քիմլյումինեսցենտային ռեագենտներ՝ կապող ազդանշանը պատկերացնելու համար:Յուրաքանչյուր սպիտակուցային խմբի ինտենսիվությունը քանակականացվել է ImageJ ծրագրաշարի միջոցով:
GraphPad Prism 7.0 ծրագրակազմն օգտագործվել է բոլոր տվյալները վերլուծելու համար՝ արտահայտված որպես միջին ± ստանդարտ շեղում:Բուժման խմբերի միջև տատանումները գնահատվել են Student's t թեստի կամ շեղումների միակողմանի վերլուծության միջոցով՝ P արժեքը <0,05, որը ցույց է տալիս վիճակագրական նշանակությունը:
Այս ուսումնասիրության ընթացքում ձեռք բերված կամ վերլուծված բոլոր տվյալները ներառված են այս հրապարակված հոդվածում և լրացուցիչ տեղեկատվական ֆայլերում:
Torre, LA, Siegel, RL and Jemal, A. Թոքերի քաղցկեղի վիճակագրություն:մակբայ.Ժամկետանց.դեղ.Կենսաբանություն.893, 1–19 (2016):
Hecht, S. Ծխախոտի քաղցկեղածինները, դրանց բիոմարկերները և ծխախոտից առաջացած քաղցկեղը:Նաթ.Քաղցկեղի քահանա.3, 733–744 (2003):
Phillips, DH and Venitt, S. ԴՆԹ և սպիտակուցային հավելումներ մարդու հյուսվածքներում, որոնք առաջանում են ծխախոտի ծխի ազդեցության հետևանքով:միջազգայնությունը։J. Քաղցկեղ.131, 2733–2753 (2012):
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA և Yu M. Houttuynia cordata-ի և silibinin-ի ազդեցությունը բենզո(ա)պիրենով առաջացած թոքերի ուռուցքի առաջացման վրա A/J մկների մոտ:Քաղցկեղ 7, 1053–1057 (2005):
Tang, W. et al.Չինական բժշկական նյութերից մեկուսացված հակաքաղցկեղային բնական արտադրանք.ծնոտը.դեղ.6, 27 (2011):
Yang, Y. et al.Պոլիֆենոն E-ի, կարմիր ժենշենի և ռապամիցինի արդյունավետությունը բենզո(ա)պիրենով առաջացած թոքերի ուռուցքի առաջացման վրա A/J մկների մոտ:Քաղցկեղ 8, 52–58 (2006):
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS and Yuan, KS Red, ներգրավվածություն քաղցկեղի թերապիայի մեջ:ծնոտը.J. Nutt.դեղ.14, 7–16 (2016):
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS and Gao, L. Ginsenosides ամերիկյան ժենշենի արմատներում և տերևներում:Ջ.Ագրիկ.Սննդի քիմիա.44, 717–720 (1996):
Attele AS, Wu JA և Yuan KS Ժենշենի ֆարմակոլոգիա. բազմաթիվ բաղադրիչներ և բազմաթիվ ազդեցություններ:կենսաքիմիա։դեղաբանություն.58, 1685–1693 (1999):