Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk hasil terbaik, sebaiknya gunakan versi browser Anda yang lebih baru (atau nonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Ginseng merah telah digunakan dalam pengobatan tradisional Asia selama ratusan tahun.Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi kemampuan empat jenis ginseng merah (ginseng merah Cina, ginseng merah Korea A, ginseng merah Korea B, dan ginseng merah Korea C) yang ditanam di berbagai daerah dalam menghambat pembentukan dan pertumbuhan paru-paru yang diinduksi karsinogen. tumor.Tes benzo(a)pyrene (B(a)P) dilakukan pada tikus A/J, dan ginseng merah Korea B ditemukan paling efektif dalam mengurangi beban tumor di antara empat varietas ginseng merah.Selain itu, kami menganalisis kandungan berbagai ginsenosides (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 dan Rg5) dalam empat ekstrak ginseng merah dan menemukan bahwa ginseng merah B Korea memiliki kadar ginsenoside Rg3 (G-Rg3) yang paling tinggi, menunjukkan bahwa G-Rg3 mungkin memainkan peran penting dalam kemanjuran terapeutiknya.Penelitian ini menunjukkan bahwa G-Rg3 memiliki bioavailabilitas yang relatif rendah.Namun, ketika G-Rg3 diberikan bersamaan dengan inhibitor P-gp verapamil, penghabisan G-Rg3 ke dalam sel Caco-2 menurun, laju penyerapan G-Rg3 di usus meningkat pada model tikus, dan G-Rg3 meningkat.Dalam sel Caco-2, aliran keluar Rg3 menurun, dan tingkat konsentrasi Rg3 menurun.G-Rg3 meningkat di usus dan plasma, dan kemampuannya untuk mencegah tumor juga ditingkatkan pada model tikus tumorigenesis yang diinduksi B(a)P.Kami juga menemukan bahwa G-Rg3 mengurangi sitotoksisitas yang diinduksi B(a)P dan pembentukan adisi DNA dalam sel paru-paru manusia, dan memulihkan ekspresi dan aktivitas enzim fase II melalui jalur Nrf2, yang mungkin terkait dengan mekanisme aksi potensial. penghambatan G -Rg3..Tentang terjadinya tumor paru-paru.Studi kami menunjukkan peran penting G-Rg3 dalam menargetkan tumor paru-paru pada model tikus.Ketersediaan hayati oral ginsenoside ini ditingkatkan dengan menargetkan P-glikoprotein, memungkinkan molekul tersebut memberikan efek antikanker.
Jenis kanker paru-paru yang paling umum adalah kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC), yang merupakan salah satu penyebab utama kematian akibat kanker di Tiongkok dan Amerika Utara1,2.Faktor utama yang meningkatkan risiko terkena kanker paru-paru non-sel kecil adalah merokok.Asap rokok mengandung lebih dari 60 zat karsinogen, termasuk benzo(a)pyrene (B(a)P), nitrosamin, dan isotop radioaktif hasil peluruhan radon.3 Hidrokarbon aromatik polisiklik B(a)P merupakan penyebab utama toksisitas pada rokok. merokok.Setelah terpapar B(a)P, sitokrom P450 mengubahnya menjadi B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE), yang bereaksi dengan DNA untuk membentuk hasil tambahan BPDE-DNA 4. Selain itu, ini hasil tambahan menginduksi tumorigenesis paru pada tikus dengan stadium tumor dan histopatologi yang mirip dengan tumor paru manusia5.Fitur ini menjadikan model kanker paru-paru yang diinduksi B(a)P sebagai sistem yang cocok untuk mengevaluasi senyawa dengan kemungkinan sifat antikanker.
Salah satu strategi yang mungkin dilakukan untuk mencegah perkembangan kanker paru-paru pada kelompok risiko tinggi, terutama perokok, adalah penggunaan agen kemopreventif untuk menekan perkembangan lesi neoplastik intraepitel dan dengan demikian mencegah perkembangan selanjutnya menjadi keganasan.Penelitian pada hewan menunjukkan bahwa berbagai agen kemopreventif efektif6.Laporan kami sebelumnya7 menyoroti efek pencegahan yang baik dari ginseng merah terhadap kanker paru-paru.Ramuan ini telah digunakan selama berabad-abad dalam pengobatan tradisional Asia untuk memperpanjang hidup dan kesehatan, dan telah didokumentasikan memiliki efek antitumor8.
Faktor aktif ginseng adalah ginsenoside yang digunakan sebagai penanda komposit untuk mengevaluasi kualitas ekstrak ginseng.Analisis kuantitatif ekstrak ginseng mentah biasanya melibatkan penggunaan beberapa ginsenosides, termasuk RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5, dan Rc9,10.Ginsenosides memiliki sedikit kegunaan klinis karena bioavailabilitas oralnya yang sangat buruk11.Meskipun mekanisme bioavailabilitas yang buruk ini tidak jelas, penghabisan ginsenosides yang disebabkan oleh P-glikoprotein (P-gp)12 mungkin menjadi penyebabnya.P-gp adalah salah satu pengangkut penghabisan terpenting dalam superfamili pengangkut kaset pengikat ATP, yang menggunakan energi hidrolisis ATP untuk melepaskan zat intraseluler ke lingkungan eksternal.Transporter P-gp biasanya didistribusikan secara luas di usus, ginjal, hati dan sawar darah-otak13.P-gp memainkan peran penting dalam penyerapan usus, dan penghambatan P-gp meningkatkan penyerapan oral dan ketersediaan beberapa obat antikanker12,14.Contoh inhibitor yang sebelumnya digunakan dalam literatur adalah verapamil dan siklosporin A15.Pekerjaan ini melibatkan pembuatan sistem tikus untuk mempelajari kanker paru-paru yang diinduksi B(a)P untuk mengevaluasi kemampuan berbagai ekstrak ginseng merah dari Tiongkok dan Korea dalam mempengaruhi kanker.Ekstrak dianalisis secara individual untuk mengidentifikasi ginsenosida spesifik yang dapat mempengaruhi karsinogenesis.Verapamil kemudian digunakan untuk menargetkan P-gp dan meningkatkan bioavailabilitas oral dan kemanjuran terapeutik ginsenosides yang menargetkan kanker.
Mekanisme dimana saponin ginseng memberikan efek terapeutik pada karsinogenesis masih belum jelas.Penelitian menunjukkan bahwa berbagai ginsenosides dapat mengurangi kerusakan DNA akibat karsinogen dengan mengurangi stres oksidatif dan mengaktifkan enzim detoksifikasi fase II, sehingga mencegah kerusakan sel.Glutathione S-transferase (GST) adalah enzim fase II khas yang diperlukan untuk mengurangi kerusakan DNA yang disebabkan oleh karsinogen17.Faktor terkait eritroid 2 nuklir 2 (Nrf2) adalah faktor transkripsi penting yang mengatur homeostasis redoks dan mengaktifkan ekspresi enzim fase II dan respons antioksidan sitoprotektif18.Penelitian kami juga menguji efek ginsenosida yang teridentifikasi terhadap pengurangan sitotoksisitas yang diinduksi B(a)P dan pembentukan hasil adisi BPDE-DNA, serta menginduksi enzim fase II dengan memodulasi jalur Nrf2 dalam sel paru-paru normal.
Pembentukan model kanker yang diinduksi B(a)P pada tikus konsisten dengan penelitian sebelumnya5.Gambar 1A menunjukkan desain eksperimental pengobatan model kanker tikus selama 20 minggu yang diinduksi oleh B(a)P, air (kontrol), ekstrak ginseng merah Cina (CRG), ekstrak ginseng merah Korea A (KRGA), dan merah Korea. ginseng.Ekstrak B (KRGB) dan Ekstrak Ginseng Merah Korea C (KRGC).Setelah 20 minggu pengobatan ginseng merah, tikus dikorbankan karena sesak napas CO2.Gambar 1B menunjukkan tumor paru-paru makroskopis pada hewan yang diobati dengan berbagai jenis ginseng merah, dan Gambar 1C menunjukkan mikrograf cahaya yang mewakili sampel tumor.Beban tumor pada hewan yang diobati dengan KRGB (1,5 ± 0,35) lebih rendah dibandingkan hewan kontrol (0,82 ± 0,2, P <0,05), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1D.Tingkat rata-rata penghambatan beban tumor adalah 45%.Ekstrak ginseng merah lainnya yang diuji tidak menunjukkan perubahan signifikan pada beban tumor (P > 0,05).Tidak ada efek samping nyata yang diamati pada model tikus selama 20 minggu pengobatan ginseng merah, termasuk tidak ada perubahan berat badan (data tidak ditampilkan) dan tidak ada toksisitas hati atau ginjal (Gambar 1E,F).
Ekstrak ginseng merah mengobati perkembangan tumor paru-paru pada tikus A/J.(A) Desain eksperimental.(B) Tumor paru-paru besar pada model tikus.Tumor ditandai dengan panah.a: kelompok ginseng merah Cina.b: grup A ginseng merah Korea.c: Kelompok ginseng merah Korea B. d: Kelompok ginseng merah Korea C. d: Kelompok kontrol.(C) Mikrograf cahaya menunjukkan tumor paru-paru.Pembesaran : 100. b : 400. (D) Beban tumor pada kelompok ekstrak ginseng merah.(E) Kadar plasma enzim hati ALT.(F) Kadar plasma enzim ginjal Cr.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi.*P <0,05.
Ekstrak ginseng merah yang diidentifikasi dalam penelitian ini dianalisis dengan spektrometri massa tandem kromatografi cair kinerja ultra (UPLC-MS/MS) untuk mengukur ginsenosida berikut: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3 , Rh2, F1, Rk1 dan Rg5.Kondisi UPLC dan MS yang digunakan untuk mengukur analit telah dijelaskan dalam laporan sebelumnya19.Kromatogram UPLC-MS/MS dari empat ekstrak ginseng merah ditunjukkan pada Gambar 2A.Terdapat perbedaan yang signifikan pada kandungan total ginsenoside, dengan kandungan total ginsenoside tertinggi pada CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Gambar 2B).Saat mengevaluasi ginsenosides individu (Gambar 2C), KRGB menunjukkan tingkat G-Rg3 tertinggi dibandingkan dengan ginsenosides lainnya (58,33 ± 3,81 μmol/L untuk G-Rg3s dan 41,56 ± 2,88 μmol/L untuk G -Rg3r).L).jenis ginseng merah (P <0,001).G-Rg3 muncul sebagai pasangan stereoisomer G-Rg3r dan G-Rg3s, yang berbeda pada posisi gugus hidroksil pada karbon 20 (Gbr. 2D).Hasilnya menunjukkan bahwa G-Rg3r atau G-Rg3 mungkin memiliki potensi antikanker yang penting dalam model tikus kanker yang diinduksi B(a)P.
Kandungan ginsenosides pada berbagai ekstrak ginseng merah.(A) Kromatogram UPLC-MS/MS dari empat ekstrak ginseng merah.(B) Estimasi kandungan total ginsenoside dalam ekstrak terindikasi.(C) Deteksi ginsenosida individu dalam ekstrak berlabel.(D) Struktur stereoisomer ginsenoside G-Rg3r dan G-Rg3s.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari penentuan rangkap tiga.***P <0,001.
Studi UPLC-MS/MS memerlukan kuantifikasi ginsenosides dalam sampel usus dan darah setelah 20 minggu pengobatan.Pengobatan dengan KRGB menunjukkan adanya hanya 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 dalam darah.Tidak ada ginsenosides tersisa yang terdeteksi, menunjukkan bioavailabilitas oral yang buruk dan oleh karena itu mengurangi paparan terhadap ginsenosides ini.
Garis sel adenokarsinoma usus besar Caco-2 secara morfologis dan biokimia mirip dengan sel epitel usus manusia, menunjukkan kegunaannya dalam menilai transportasi enterosit melintasi penghalang epitel usus.Analisis ini didasarkan pada penelitian sebelumnya 20 .Gambar 3A,B,C,D,E,F menunjukkan gambar representatif transpor transelular G-Rg3r dan G-Rg3 menggunakan model monolayer Caco-2.Transportasi transeluler G-Rg3r atau G-Rg3 melintasi monolayer Caco-2 dari sisi basolateral ke apikal (Pb-a) secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dari sisi apikal ke basolateral (Pa-b).Untuk G-Rg3r, nilai rata-rata Pa-b adalah 0,38 ± 0,06, yang meningkat menjadi 0,73 ± 0,06 setelah pengobatan dengan 50 mol/L verapamil dan menjadi 1,14 ± 0,09 setelah pengobatan dengan 100 mol/L verapamil (p <0,01 dan 0,001, masing-masing;3A).Pengamatan untuk G-Rg3 mengikuti pola yang sama (Gambar 3B), dan hasilnya menunjukkan bahwa pengobatan verapamil meningkatkan pengangkutan G-Rg3r dan G-Rg3.Pengobatan verapamil juga menghasilkan penurunan yang signifikan pada rata-rata rasio penghabisan Pb-a dan G-Rg3r dan G-Rg3s (Gambar 3C,D,E,F), yang menunjukkan bahwa pengobatan verapamil mengurangi kandungan ginsenoside dalam sel penghabisan Caco-2..
Transportasi transeluler G-Rg3 dalam lapisan tunggal Caco-2 dan penyerapan usus dalam uji perfusi tikus.(A) Nilai Pa-b grup G-Rg3r pada monolayer Caco-2.(B) Nilai Pa-b gugus G-Rg3s pada monolayer Caco-2.(C) Nilai Pb gugus G-Rg3r pada monolayer Caco-2.(D) Nilai Pb gugus G-Rg3s pada monolayer Caco-2.(E) Rasio hasil kelompok G-Rg3r dalam lapisan tunggal Caco-2.(F) Rasio hasil kelompok G-Rg3 dalam lapisan tunggal Caco-2.(G) Persentase penyerapan G-Rg3r di usus dalam uji perfusi pada tikus.(H) Persentase penyerapan G-Rg3 di usus dalam uji perfusi pada tikus.Permeabilitas dan penyerapan dibandingkan tanpa penambahan verapamil.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari lima percobaan independen.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Konsisten dengan penelitian sebelumnya20, perfusi usus ortotopik tikus dilakukan untuk menentukan apakah penyerapan G-Rg3 di usus meningkat setelah pengobatan verapamil.Gambar 3G,H menunjukkan uji perfusi yang representatif untuk mengevaluasi persentase penyerapan G-Rg3r dan G-Rg3 di usus pada tikus model kanker selama periode waktu di atas.Persentase awal serapan G-Rg3r yang lemah sekitar 10% meningkat menjadi lebih dari 20% setelah pengobatan dengan verapamil 50 μM dan lebih dari 25% setelah pengobatan dengan verapamil 100 μM.Demikian pula, G-Rg3, yang memiliki penyerapan awal sebesar 10%, juga menunjukkan puncak lebih dari 20% setelah pengobatan dengan verapamil 50 μM dan hampir 30% setelah pengobatan dengan verapamil 100 μM, menunjukkan bahwa penghambatan P-gp oleh verapamil meningkatkan Rg3 penyerapan G usus pada model tikus kanker paru-paru.
Berdasarkan metode di atas, tikus model kanker yang diinduksi B(a)P dibagi secara acak menjadi enam kelompok, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A.Tidak ada penurunan berat badan yang signifikan atau tanda-tanda klinis toksisitas yang diamati pada kelompok perlakuan G-Rg3 dibandingkan dengan kelompok kontrol (data tidak ditampilkan).Setelah 20 minggu pengobatan, paru-paru setiap tikus dikumpulkan.Gambar 4B menunjukkan tumor paru-paru makroskopis pada tikus dalam kelompok perlakuan di atas, dan Gambar 4C menunjukkan mikrograf cahaya yang mewakili tumor yang mewakili.Mengenai beban tumor pada masing-masing kelompok (Gambar 4D), nilai untuk tikus yang diobati dengan G-Rg3r dan G-Rg3s masing-masing adalah 0,75 ± 0,29 mm3 dan 0,81 ± 0,30 mm3, sedangkan nilai untuk G Tikus yang diobati dengan -Rg3s masing-masing sebesar 1,63 ±0,40 mm3.tikus kontrol (p <0,001), menunjukkan bahwa pengobatan G-Rg3 mengurangi beban tumor pada tikus.Pemberian verapamil semakin meningkatkan penurunan ini: nilai pada tikus verapamil+ G-Rg3r menurun dari 0,75 ± 0,29 mm3 menjadi 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), dan nilai untuk verapamil+ dari 0,81 ± 0,30 mm3 menurun menjadi 0,29 ± 0,21 mm3 pada tikus yang diobati dengan G. -Rg3s (p <0,05), menunjukkan bahwa verapamil dapat meningkatkan efek penghambatan G-Rg3 pada tumorigenesis.Beban tumor tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok verapamil, kelompok G-Rg3r dan kelompok G-Rg3s, serta kelompok verapamil+G-Rg3r dan kelompok verapamil+G-Rg3s.Selain itu, tidak ada toksisitas hati atau ginjal yang signifikan terkait dengan pengobatan yang dievaluasi (Gambar 4E,F).
Beban tumor setelah pengobatan G-Rg3 dan kadar G-Rg3r dan G-Rg3 plasma atau usus pada kelompok yang ditunjukkan.(A) Desain eksperimental.(B) Tumor makroskopis pada model tikus.Tumor ditandai dengan panah.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r dalam kombinasi dengan verapamil.d: G-Rg3 dalam kombinasi dengan verapamil.d: Verapamil.e: kontrol.(C) Mikrograf optik tumor pada pembesaran.Jawaban: 100x.b: 400X.(D) Pengaruh pengobatan G-Rg3 + verapamil terhadap beban tumor pada tikus A/J.(E) Kadar plasma enzim hati ALT.(F) Kadar plasma enzim ginjal Cr.(G) Kadar plasma G-Rg3r atau G-Rg3 dari kelompok yang ditunjukkan.(H) Kadar G-Rg3r atau G-Rg3s pada usus kelompok terindikasi.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari penentuan rangkap tiga.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Kadar G-Rg3 pada tikus model kanker yang diinduksi B(a)P dinilai dengan UPLC-MS/MS setelah masa pengobatan 20 minggu sesuai dengan metode yang dijelaskan di bagian Metode.Gambar 4G dan H masing-masing menunjukkan kadar G-Rg3 plasma dan usus.Kadar G-Rg3r plasma adalah 0,44 ± 0,32 μmol/L dan meningkat menjadi 1,17 ± 0,47 μmol/L dengan pemberian verapamil secara bersamaan (p <0,001), sedangkan kadar G-Rg3r usus adalah 0,53 ± 0,08 μg/l.Ketika dikombinasikan dengan verapamil, g meningkat menjadi 1,35 ± 0,13 μg/g (p <0,001).Untuk G-Rg3, hasilnya mengikuti pola yang sama, menunjukkan bahwa pengobatan verapamil meningkatkan bioavailabilitas oral G-Rg3 pada tikus A/J.
Uji viabilitas sel digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas B(a)P dan G-Rg3 pada sel hEL.Sitotoksisitas yang diinduksi oleh B(a)P dalam sel hEL ditunjukkan pada Gambar 5A, sedangkan sifat tidak beracun dari G-Rg3r dan G-Rg3 ditunjukkan pada Gambar 5A dan 5B.5B, C. Untuk mengevaluasi efek sitoprotektif G-Rg3, B(a)P diberikan bersama dengan berbagai konsentrasi G-Rg3r atau G-Rg3 ke dalam sel hEL.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5D, G-Rg3r pada konsentrasi 5 μM, 10 μM, dan 20 μM memulihkan viabilitas sel masing-masing menjadi 58,3%, 79,3%, dan 77,3%.Hasil serupa juga terlihat pada kelompok G-Rg3s.Ketika konsentrasi G-Rg3 adalah 5 µM, 10 µM dan 20 µM, viabilitas sel masing-masing dipulihkan menjadi 58,3%, 72,7% dan 76,7% (Gambar 5E).).Kehadiran hasil tambahan BPDE-DNA diukur menggunakan kit ELISA.Hasil kami menunjukkan bahwa kadar hasil tambahan BPDE-DNA meningkat pada kelompok yang diberi perlakuan B(a)P dibandingkan dengan kelompok kontrol, namun dibandingkan dengan pengobatan bersama G-Rg3, tingkat hasil tambahan BPDE-DNA pada kelompok B(a)P B pada kelompok yang diberi perlakuan, kadar hasil DNA berkurang secara signifikan.Hasil pengobatan dengan B(a)P saja ditunjukkan pada Gambar 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 untuk G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 untuk G -Rg3s, p <0,001).
Viabilitas sel dan pembentukan hasil adisi BPDE-DNA dalam sel hEL yang diobati dengan G-Rg3 dan B(a)P.(A) Viabilitas sel hEL yang diobati dengan B(a)P.(B) Viabilitas sel hEL yang diobati dengan G-Rg3r.(C) Viabilitas sel hEL yang diobati dengan G-Rg3.(D) Viabilitas sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3r.(E) Viabilitas sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3.(F) Tingkat hasil tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari penentuan rangkap tiga.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ekspresi enzim GST terdeteksi setelah pengobatan bersama dengan 10 μM B(a)P dan 10 μM G-Rg3r atau G-Rg3s.Hasil kami menunjukkan bahwa B(a)P menekan ekspresi GST (59,7 ± 8,2% pada kelompok G-Rg3r dan 39 ± 4,5% pada kelompok G-Rg3s), dan B(a)P dikaitkan dengan G-Rg3r. , atau dengan G-Rg3r, atau dengan G-Rg3r.Perawatan bersama dengan G-Rg3 memulihkan ekspresi GST.Ekspresi GST (103,7 ± 15,5% pada kelompok G-Rg3r dan 110 ± 11,1% pada kelompok G-Rg3s, masing-masing p <0,05 dan p <0,001, Gambar 6A, B, dan C).Aktivitas GST dinilai menggunakan alat uji aktivitas.Hasil kami menunjukkan bahwa kelompok perlakuan kombinasi memiliki aktivitas GST lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok B(a)P saja (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% pada kelompok G-Rg3r vs. 92,3 ± 6,5 pada kelompok G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% pada kelompok G-Rg3s, p <0,001, Gambar 6D).
Ekspresi GST dan Nrf2 dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3.(A) Deteksi ekspresi GST dengan Western blotting.(B) Ekspresi kuantitatif GST dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3r.(C) Ekspresi kuantitatif GST dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3s.(D) Aktivitas GST dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3.(E) Deteksi ekspresi Nrf2 dengan Western blotting.(F) Ekspresi kuantitatif Nrf2 dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3r.(G) Ekspresi kuantitatif Nrf2 dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3s.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari penentuan rangkap tiga.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Untuk menjelaskan jalur yang terlibat dalam penekanan tumorigenesis yang diinduksi B(a)P yang dimediasi G-Rg3, ekspresi Nrf2 dinilai dengan Western blotting.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6E,F,G, dibandingkan dengan kelompok kontrol, hanya tingkat Nrf2 pada kelompok perlakuan B(a)P yang mengalami penurunan;namun, dibandingkan dengan kelompok perlakuan B(a)P, kadar B(a) Nrf2 pada kelompok PG-Rg3 meningkat (106 ± 9,5% untuk G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% untuk G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% untuk G-Rg3s, p <0,01).
Kami mengkonfirmasi peran pencegahan Nrf2 dengan menekan ekspresi Nrf2 menggunakan RNA interferensi kecil spesifik (siRNA).Knockdown Nrf2 dikonfirmasi oleh Western blotting (Gbr. 7A,B).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7C,D, pengobatan bersama sel hEL dengan B(a)P dan G-Rg3 menghasilkan penurunan jumlah hasil tambahan BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) dibandingkan dengan pengobatan dengan B(a)P sendirian di kelompok siRNA kontrol.) G-Rg3r adalah 4,13 ± 0,49, G-Rg3s adalah 1,8 ± 0,32 dan 4,1 ± 0,57, p <0,01).Namun, efek penghambatan G-Rg3 pada pembentukan BPDE-DNA dihapuskan oleh knockdown Nrf2.Pada kelompok siNrf2, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam pembentukan hasil adisi BPDE-DNA antara pengobatan bersama B(a)P dan G-Rg3 dan pengobatan B(a)P saja (3,0 ± 0,21 untuk G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).untuk G-Rg3r versus 3,6 untuk G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Pengaruh knockdown Nrf2 pada pembentukan adduct BPDE-DNA di sel hEL.(A) Knockdown Nrf2 dikonfirmasi oleh Western blotting.(B) Kuantifikasi intensitas pita Nrf2.(C) Pengaruh knockdown Nrf2 pada kadar adduct BPDE-DNA dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3r.(D) Pengaruh knockdown Nrf2 pada kadar adduct BPDE-DNA dalam sel hEL yang diobati dengan B(a)P dan G-Rg3.Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari penentuan rangkap tiga.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Studi ini mengevaluasi efek pencegahan berbagai ekstrak ginseng merah pada model tikus kanker paru-paru yang diinduksi B(a)P, dan pengobatan KRGB secara signifikan mengurangi beban tumor.Mengingat G-Rg3 memiliki kandungan tertinggi pada ekstrak ginseng ini, maka peran penting ginsenoside dalam menghambat tumorigenesis telah dipelajari.Baik G-Rg3r dan G-Rg3 (dua epimer G-Rg3) secara signifikan mengurangi beban tumor pada model tikus kanker yang diinduksi B(a)P.G-Rg3r dan G-Rg3 memberikan efek antikanker dengan menginduksi apoptosis sel tumor21, menghambat pertumbuhan tumor22, menghentikan siklus sel23 dan mempengaruhi angiogenesis24.G-Rg3 juga telah terbukti menghambat metastasis seluler25, dan kemampuan G-Rg3 untuk meningkatkan efek kemoterapi dan radioterapi telah didokumentasikan26,27.Poon dkk menunjukkan bahwa pengobatan G-Rg3 dapat mengurangi efek genotoksik B(a)P28.Studi ini menunjukkan potensi terapeutik G-Rg3 dalam menargetkan molekul karsinogenik lingkungan dan mencegah kanker.
Meskipun memiliki potensi profilaksis yang baik, bioavailabilitas ginsenosides oral yang buruk menimbulkan tantangan dalam penggunaan klinis molekul-molekul ini.Analisis farmakokinetik pemberian ginsenosides oral pada tikus menunjukkan bahwa bioavailabilitasnya masih kurang dari 5%29.Tes ini menunjukkan bahwa setelah masa pengobatan 20 minggu, hanya kadar Rg5 dalam darah yang menurun.Meskipun mekanisme yang mendasari rendahnya bioavailabilitas masih belum diketahui, P-gp diperkirakan terlibat dalam penghabisan ginsenosides.Penelitian ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa pemberian verapamil, suatu penghambat P-gp, meningkatkan bioavailabilitas oral G-Rg3r dan G-Rg3s.Dengan demikian, temuan ini menunjukkan bahwa G-Rg3r dan G-Rg3s bertindak sebagai substrat P-gp untuk mengatur pengeluarannya.
Penelitian ini menunjukkan bahwa pengobatan kombinasi dengan verapamil meningkatkan bioavailabilitas oral G-Rg3 pada model tikus yang menderita kanker paru-paru.Temuan ini didukung oleh peningkatan transportasi transeluler G-Rg3 di usus pada blokade P-gp, sehingga meningkatkan penyerapannya.Pengujian pada sel Caco2 menunjukkan bahwa pengobatan verapamil mengurangi penghabisan G-Rg3r dan G-Rg3s sekaligus meningkatkan permeabilitas membran.Sebuah studi oleh Yang dkk.Penelitian telah menunjukkan bahwa pengobatan dengan siklosporin A (penghambat P-gp lainnya) meningkatkan bioavailabilitas ginsenoside Rh2 dari nilai dasar 1%20 menjadi lebih dari 30%.Senyawa ginsenosides K dan Rg1 juga menunjukkan hasil serupa30,31.Ketika verapamil dan siklosporin A diberikan secara bersamaan, penghabisan senyawa K dalam sel Caco-2 berkurang secara signifikan dari 26,6 menjadi kurang dari 3, sementara tingkat intraselulernya meningkat 40 kali lipat30.Dengan adanya verapamil, kadar Rg1 meningkat pada sel epitel paru tikus, menunjukkan peran P-gp dalam penghabisan ginsenoside, seperti yang ditunjukkan oleh Meng dkk.31.Namun, verapamil tidak memiliki efek yang sama terhadap penghabisan beberapa ginsenosides (seperti Rg1, F1, Rh1 dan Re), menunjukkan bahwa mereka tidak terpengaruh oleh substrat P-gp, seperti yang ditunjukkan oleh Liang et al.32.Pengamatan ini mungkin terkait dengan keterlibatan transporter lain dan struktur ginsenoside alternatif.
Mekanisme efek pencegahan G-Rg3 pada kanker masih belum jelas.Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa G-Rg3 mencegah kerusakan DNA dan apoptosis dengan mengurangi stres oksidatif dan peradangan16,33, yang mungkin merupakan mekanisme yang mendasari untuk mencegah tumorigenesis yang diinduksi B(a)P.Beberapa laporan menunjukkan bahwa genotoksisitas yang disebabkan oleh B(a)P dapat dikurangi dengan memodulasi enzim fase II untuk membentuk BPDE-DNA34.GST adalah enzim fase II khas yang menghambat pembentukan hasil adisi BPDE-DNA dengan mendorong pengikatan GSH ke BPDE, sehingga mengurangi kerusakan DNA yang disebabkan oleh B(a)P35.Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan G-Rg3 mengurangi sitotoksisitas yang diinduksi B(a)P dan pembentukan adduksi BPDE-DNA dalam sel hEL dan mengembalikan ekspresi dan aktivitas GST secara in vitro.Namun, efek ini tidak ada karena tidak adanya Nrf2, menunjukkan bahwa G-Rg3 menginduksi efek sitoprotektif melalui jalur Nrf2.Nrf2 adalah faktor transkripsi utama untuk enzim detoksifikasi fase II yang mendorong pembersihan xenobiotik36.Aktivasi jalur Nrf2 menginduksi sitoproteksi dan mengurangi kerusakan jaringan37.Selain itu, beberapa laporan mendukung peran Nrf2 sebagai penekan tumor dalam karsinogenesis38.Studi kami menunjukkan bahwa induksi jalur Nrf2 oleh G-Rg3 memainkan peran pengaturan penting dalam genotoksisitas yang diinduksi B(a)P dengan menyebabkan detoksifikasi B(a)P dengan mengaktifkan enzim fase II, sehingga menghambat proses tumorigenesis.
Penelitian kami mengungkap potensi ginseng merah dalam mencegah kanker paru-paru yang diinduksi B(a)P pada tikus melalui keterlibatan penting ginsenoside G-Rg3.Bioavailabilitas oral yang buruk dari molekul ini menghambat penerapan klinisnya.Namun, penelitian ini untuk pertama kalinya menunjukkan bahwa G-Rg3 adalah substrat P-gp, dan pemberian inhibitor P-gp meningkatkan bioavailabilitas G-Rg3 in vitro dan in vivo.G-Rg3 mengurangi sitotoksisitas yang diinduksi B(a)P dengan mengatur jalur Nrf2, yang mungkin merupakan mekanisme potensial untuk fungsi pencegahannya.Penelitian kami menegaskan potensi ginsenoside G-Rg3 untuk pencegahan dan pengobatan kanker paru-paru.
Tikus A/J betina berumur enam minggu (20 ± 1 g) dan tikus Wistar jantan berumur 7 minggu (250 ± 20 g) diperoleh dari The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) dan Institut Zoologi Wuhan.Universitas (Wuhan, Cina).Pusat Pengumpulan Kultur Tipe Tiongkok (Wuhan, Tiongkok) memberi kami sel Caco-2 dan hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) adalah sumber B(a)P dan tricaprine.Ginsenosides G-Rg3r dan G-Rg3s yang dimurnikan, dimetil sulfoksida (DMSO), kit uji proliferasi CellTiter-96 (MTS), verapamil, media esensial minimal (MEM), dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Chengdu Must Bio-Technology .Co, Ltd.(Chengdu, Tiongkok).Kit mini DNA QIAamp dan kit ELISA tambahan BPDE-DNA dibeli dari Qiagen (Stanford, CA, USA) dan Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).Kit uji aktivitas GST dan kit uji protein total (metode standar BCA) dibeli dari Solarbio (Beijing, Cina).Semua ekstrak ginseng merah disimpan di Laboratorium Mingyu 7. Universitas Baptis Hong Kong (Hong Kong, Cina) dan Pusat Kanker Korea (Seoul, Korea) adalah sumber komersial ekstrak CRG dan berbagai ekstrak ginseng merah dari berbagai asal Korea (termasuk KRGA, KRGB dan KRGC).Ginseng merah terbuat dari akar ginseng segar berumur 6 tahun.Ekstrak ginseng merah diperoleh dengan cara mencuci ginseng dengan air sebanyak tiga kali, kemudian memekatkan ekstrak airnya, dan terakhir mengeringkannya pada suhu rendah hingga diperoleh bubuk ekstrak ginseng.Antibodi (anti-Nrf2, anti-GST, dan β-aktin), imunoglobulin G (IgG) anti-kelinci terkonjugasi peroksidase lobak, reagen transfeksi, siRNA kontrol, dan siRNA Nrf2 dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz (Santa Cruz, CA) .), AS).
Sel Caco2 dan hEL dikultur dalam cawan kultur sel berukuran 100 mm2 dengan MEM yang mengandung 10% FBS pada suhu 37 °C dalam atmosfer lembab 5% CO2.Untuk menentukan pengaruh kondisi pengobatan, sel hEL diinkubasi dengan konsentrasi B(a)P dan G-Rg3 yang berbeda dalam MEM selama 48 jam.Sel dapat dianalisis lebih lanjut atau dikumpulkan untuk menyiapkan ekstrak bebas sel.
Semua percobaan disetujui oleh Komite Etika Hewan Eksperimental dari Tongji Medical College, Universitas Sains dan Teknologi Huazhong (Persetujuan No. 2019; Registrasi No. 4587TH).Semua percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman dan peraturan yang relevan, dan penelitian dilakukan sesuai dengan pedoman Penelitian Hewan: Pelaporan Eksperimen In Vivo (ARRIVE).Tikus A/J berumur delapan minggu pertama kali disuntik secara intraperitoneal dengan B(a)P dalam larutan trikaprin (100 mg/kg, 0,2 ml).Setelah seminggu, tikus-tikus tersebut dibagi secara acak menjadi kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang berbeda, masing-masing kelompok berjumlah 15 ekor tikus, dan diberi gavage sekali sehari.Setelah 20 minggu pengobatan, hewan dikorbankan karena asfiksia CO2.Paru-paru dikumpulkan dan difiksasi selama 24 jam.Jumlah tumor superfisial dan ukuran tumor individu dihitung untuk setiap paru di bawah mikroskop bedah.Perkiraan volume tumor (V) dihitung menggunakan persamaan berikut: V (mm3) = 4/3πr3, di mana r adalah diameter tumor.Jumlah bersih semua volume tumor di paru-paru tikus mewakili total volume tumor, dan rata-rata total volume tumor di setiap kelompok mewakili beban tumor.Sampel darah utuh dan usus dikumpulkan dan disimpan pada suhu −80°C untuk penentuan UPLC-MS/MS.Serum dikumpulkan dan penganalisis kimia otomatis digunakan untuk menganalisis kadar alanine aminotransferase (ALT) dan kreatinin serum (Cr) untuk menilai fungsi hati dan ginjal.
Sampel yang dikumpulkan dikeluarkan dari tempat penyimpanan dingin, dicairkan, ditimbang, dan ditempatkan ke dalam tabung seperti dijelaskan di atas.Ke dalamnya ditambahkan 0,5 μM phlorizin (standar internal) dalam larutan metanol 0,8 ml.Jaringan kemudian dihomogenisasi menggunakan Tissue-Tearor dan homogenat selanjutnya dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml.Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 15500 rpm selama 15 menit.Setelah membuang 1,0 ml supernatan, keringkan dengan nitrogen.Dua ratus mikroliter metanol digunakan untuk pemulihan.Darah dikumpulkan dan diproses dalam satu jalur dan digunakan sebagai acuan untuk semua pengukuran.
Pelat Transwell 24-sumur diunggulkan dengan 1,0 × 105 sel Caco-2 per sumur untuk mengevaluasi potensi peningkatan transportasi G-Rg3 dengan penambahan verapamil.Setelah 3 minggu kultur, sel dicuci dengan HBSS dan dipreinkubasi pada suhu 37°C.400 μL dari 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, atau campuran dengan 50 atau 100 μM verapamil) disuntikkan ke sisi basolateral atau apikal dari monolayer, dan 600 μL larutan HBSS ditambahkan ke yang lain. samping.Kumpulkan 100 µl media kultur pada waktu yang ditentukan (0, 15, 30, 45, 60, 90 dan 120 menit) dan tambahkan 100 µl HBSS untuk membuat volume ini.Sampel disimpan pada suhu −4 °C hingga terdeteksi oleh UPLC-MS/MS.Ekspresi Papp = dQ/(dT × A × C0) digunakan untuk mengukur permeabilitas apikal dan basolateral searah dan sebaliknya (Pa-b dan Pb-a, masing-masing);dQ/dT adalah perubahan konsentrasi, A (0,6 cm2) adalah luas permukaan monolayer, dan C0 adalah konsentrasi donor awal.Rasio penghabisan dihitung sebagai Pb-a/Pa-b, yang mewakili tingkat penghabisan obat yang diteliti.
Tikus Wistar jantan dipuasakan selama 24 jam, hanya diberi air putih, dan dibius dengan suntikan larutan pentobarbital 3,5% secara intravena.Tabung silikon yang diintubasi memiliki ujung duodenum sebagai pintu masuk dan ujung ileum sebagai pintu keluar.Gunakan pompa peristaltik untuk memompa saluran masuk dengan 10 µM G-Rg3r atau G-Rg3s dalam HBSS isotonik dengan laju aliran 0,1 ml/menit.Efek verapamil dinilai dengan menambahkan 50 μM atau 100 μM senyawa ke 10 μM G-Rg3r atau G-Rg3s.UPLC-MS/MS dilakukan pada ekstrak perfusi yang dikumpulkan pada titik waktu 60, 90, 120, dan 150 menit setelah dimulainya perfusi.Persentase serapan dihitung dengan rumus % serapan = (1 – Cout/Cin) × 100%;konsentrasi G-Rg3 pada saluran keluar dan saluran masuk masing-masing dinyatakan dengan Cout dan Cin.
sel-sel hEL diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 1 × 104 sel per sumur dan diolah dengan B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) atau G-Rg3 yang dilarutkan dalam DMSO .Obat-obatan tersebut kemudian diencerkan dengan media kultur ke berbagai konsentrasi (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) selama 48 jam.Dengan menggunakan alat uji MTS yang tersedia secara komersial, sel-sel dikenai protokol standar dan kemudian diukur menggunakan pembaca lempeng mikro pada 490 nm.Tingkat viabilitas sel dari kelompok yang diobati bersama dengan B(a)P (10 μM) dan G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) dinilai berdasarkan metode di atas dan dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati.
Sel-sel hEL diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 1 × 105 sel/sumur dan diolah dengan 10 μMB(a)P dengan ada atau tidaknya 10 μM G-Rg3.Setelah 48 jam perawatan, DNA diekstraksi dari sel hEL menggunakan QIAamp DNA Mini Kit sesuai dengan protokol pabrikan.Pembentukan hasil tambahan BPDE-DNA dideteksi menggunakan kit ELISA hasil tambahan BPDE-DNA.Tingkat relatif hasil tambahan BPDE-DNA diukur menggunakan microplate reader dengan mengukur serapan pada 450 nm.
sel-sel hEL diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 1 × 104 sel per sumur dan diperlakukan dengan 10 μMB (a) P tanpa adanya atau adanya 10 μM G-Rg3 selama 48 jam.Aktivitas GST diukur menggunakan alat uji aktivitas GST komersial sesuai dengan protokol pabrikan.Aktivasi GST relatif diukur dengan absorbansi pada 450 nm menggunakan microplate reader.
sel hEL dicuci dengan PBS dingin dan kemudian dilisiskan menggunakan buffer uji radioimunopresipitasi yang mengandung protease inhibitor dan inhibitor fosfatase.Setelah kuantifikasi protein menggunakan alat uji protein total, 30 μg protein dalam setiap sampel dipisahkan oleh 12% SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF melalui elektroforesis.Membran diblokir dengan susu skim 5% dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4°C.Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak, reagen chemiluminescence yang ditingkatkan ditambahkan untuk memvisualisasikan sinyal pengikatan.Intensitas setiap pita protein diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ.
Perangkat lunak GraphPad Prism 7.0 digunakan untuk menganalisis semua data, dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi.Variasi antara kelompok perlakuan dinilai menggunakan uji t Student atau analisis varians satu arah, dengan nilai P <0,05 yang menunjukkan signifikansi statistik.
Semua data yang diperoleh atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan file informasi tambahan.
Torre, LA, Siegel, RL dan Jemal, A. Statistik kanker paru-paru.kata keterangan.Kedaluwarsa.obat-obatan.biologi.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Karsinogen tembakau, biomarkernya dan kanker akibat tembakau.Nat.Pendeta kanker.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH dan Venitt, S. DNA dan protein tambahan dalam jaringan manusia akibat paparan asap tembakau.internasionalitas.J.Kanker.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA dan Yu M. Pengaruh Houttuynia cordata dan silibinin pada tumorigenesis paru yang diinduksi benzo(a)pyrene pada tikus A/J.Kanker 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. dkk.Produk alami antikanker diisolasi dari bahan obat Cina.rahang.obat-obatan.6, 27 (2011).
Yang, Y. dkk.Kemanjuran polifenon E, ginseng merah, dan rapamycin pada tumorigenesis paru yang diinduksi benzo(a)pyrene pada tikus A/J.Kanker 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS dan Yuan, KS Red, keterlibatan dalam terapi kanker.rahang.J.Nutt.obat-obatan.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS dan Gao, L. Ginsenosides di akar dan daun ginseng Amerika.J.Pertanian.Kimia makanan.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA dan Yuan KS Farmakologi ginseng: banyak komponen dan banyak efek.biokimia.farmakologi.58, 1685–1693 (1999).
Waktu posting: 17 Sep-2023