Grazie per aver visitato Nature.com.La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto CSS limitato.Per ottenere risultati ottimali, ti consigliamo di utilizzare una versione più recente del browser (o di disattivare la modalità compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili o JavaScript.
Il ginseng rosso è utilizzato nella medicina tradizionale asiatica da centinaia di anni.In questo studio, abbiamo valutato la capacità di quattro tipi di ginseng rosso (ginseng rosso cinese, ginseng rosso coreano A, ginseng rosso coreano B e ginseng rosso coreano C) coltivati in diverse regioni di inibire la formazione e la crescita di cellule polmonari indotte da agenti cancerogeni. tumori.È stato condotto un test sul benzo(a)pirene (B(a)P) su topi A/J e il ginseng rosso coreano B è risultato essere il più efficace nel ridurre il carico tumorale tra le quattro varietà di ginseng rosso.Inoltre, abbiamo analizzato il contenuto di vari ginsenosidi (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Rg5) in quattro estratti di ginseng rosso e abbiamo scoperto che il ginseng rosso coreano B aveva i livelli più elevati di ginsenoside Rg3 (G-Rg3), suggerendo che G-Rg3 può svolgere un ruolo importante nella sua efficacia terapeutica.Questo lavoro mostra che G-Rg3 ha una biodisponibilità relativamente bassa.Tuttavia, quando G-Rg3 è stato somministrato in concomitanza con l'inibitore della P-gp verapamil, l'efflusso di G-Rg3 nelle cellule Caco-2 è diminuito, la velocità di assorbimento intestinale di G-Rg3 è aumentata in un modello di ratto e G-Rg3 è stato aumentato.Nelle cellule Caco-2, il deflusso di Rg3 diminuisce e il livello di concentrazione di Rg3 diminuisce.G-Rg3 è aumentato nell'intestino e nel plasma e la sua capacità di prevenire i tumori è anche migliorata in un modello di tumorigenesi indotta da B(a)P nel ratto.Abbiamo anche scoperto che G-Rg3 riduceva la citotossicità indotta da B (a) P e la formazione di addotti del DNA nelle cellule polmonari umane e ripristinava l'espressione e l'attività degli enzimi di fase II attraverso la via Nrf2, che potrebbe essere correlata al potenziale meccanismo d'azione dell'inibizione G -Rg3..Sulla comparsa di tumori ai polmoni.Il nostro studio dimostra un ruolo potenzialmente importante per G-Rg3 nel colpire i tumori polmonari nei modelli murini.La biodisponibilità orale di questo ginsenoside viene migliorata prendendo di mira la glicoproteina P, consentendo alla molecola di esercitare effetti antitumorali.
Il tipo più comune di cancro al polmone è il cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), che è una delle principali cause di morte per cancro in Cina e Nord America1,2.Il principale fattore che aumenta il rischio di sviluppare il cancro del polmone non a piccole cellule è il fumo.Il fumo di sigaretta contiene più di 60 agenti cancerogeni, tra cui benzo(a)pirene (B(a)P), nitrosammine e isotopi radioattivi derivanti dal decadimento del radon.3 Gli idrocarburi policiclici aromatici B(a)P sono la principale causa di tossicità nelle sigarette Fumo.Dopo l'esposizione al B(a)P, il citocromo P450 lo converte in B(a)P-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido (BPDE), che reagisce con il DNA per formare l'addotto BPDE-DNA 4. Inoltre, questi gli addotti inducono la tumorigenesi polmonare nei topi con stadio del tumore e istopatologia simili ai tumori polmonari umani5.Questa caratteristica rende il modello di cancro polmonare indotto da B(a)P un sistema adatto per valutare composti con possibili proprietà antitumorali.
Una possibile strategia per prevenire lo sviluppo del cancro del polmone nei gruppi ad alto rischio, in particolare i fumatori, è l’uso di agenti chemiopreventivi per sopprimere lo sviluppo di lesioni neoplastiche intraepiteliali e quindi prevenire la loro successiva progressione verso la malignità.Gli studi sugli animali dimostrano che vari agenti chemiopreventivi sono efficaci6.Il nostro precedente rapporto7 evidenziava i buoni effetti preventivi del ginseng rosso sul cancro ai polmoni.Questa erba è stata utilizzata per secoli nella medicina tradizionale asiatica per prolungare la vita e la salute ed è stato documentato il suo effetto antitumorale8.
Il fattore attivo del ginseng è il ginsenoside, che viene utilizzato come marcatore composito per valutare la qualità degli estratti di ginseng.L'analisi quantitativa degli estratti grezzi di ginseng prevede tipicamente l'uso di diversi ginsenosidi, tra cui RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 e Rc9,10.I ginsenosidi hanno uno scarso uso clinico a causa della loro scarsissima biodisponibilità orale11.Sebbene il meccanismo di questa scarsa biodisponibilità non sia chiaro, la causa potrebbe essere l’efflusso di ginsenosidi causato dalla glicoproteina P (P-gp)12.La P-gp è uno dei più importanti trasportatori di efflusso nella superfamiglia dei trasportatori a cassette leganti l'ATP, che utilizza l'energia dell'idrolisi dell'ATP per rilasciare sostanze intracellulari nell'ambiente esterno.I trasportatori P-gp sono generalmente ampiamente distribuiti nell'intestino, nei reni, nel fegato e nella barriera ematoencefalica13.La P-gp svolge un ruolo fondamentale nell'assorbimento intestinale e l'inibizione della P-gp aumenta l'assorbimento orale e la disponibilità di alcuni farmaci antitumorali12,14.Esempi di inibitori precedentemente utilizzati in letteratura sono verapamil e ciclosporina A15.Questo lavoro prevede la creazione di un sistema murino per studiare il cancro polmonare indotto da B(a)P per valutare la capacità di diversi estratti di ginseng rosso provenienti dalla Cina e dalla Corea di influenzare le neoplasie.Gli estratti sono stati analizzati individualmente per identificare ginsenosidi specifici che potrebbero influenzare la carcinogenesi.Il verapamil è stato poi utilizzato per colpire la P-gp e migliorare la biodisponibilità orale e l'efficacia terapeutica dei ginsenosidi che colpiscono il cancro.
Il meccanismo attraverso il quale le saponine del ginseng esercitano effetti terapeutici sulla carcinogenesi rimane poco chiaro.La ricerca ha dimostrato che vari ginsenosidi possono ridurre il danno al DNA causato da agenti cancerogeni riducendo lo stress ossidativo e attivando gli enzimi di disintossicazione di fase II, prevenendo così il danno cellulare.La glutatione S-transferasi (GST) è un tipico enzima di fase II necessario per ridurre il danno al DNA causato da agenti cancerogeni17.Il fattore 2 correlato all'eritroide nucleare 2 (Nrf2) è un importante fattore di trascrizione che regola l'omeostasi redox e attiva l'espressione degli enzimi di fase II e le risposte antiossidanti citoprotettive18.Il nostro studio ha anche esaminato gli effetti dei ginsenosidi identificati sulla riduzione della citotossicità indotta da B (a) P e sulla formazione di addotti BPDE-DNA, nonché sull'induzione di enzimi di fase II modulando la via Nrf2 nelle cellule polmonari normali.
La creazione di un modello murino di cancro indotto da B(a)P è coerente con il lavoro precedente5.La Figura 1A mostra il disegno sperimentale di un trattamento di 20 settimane di un modello di cancro del topo indotto da B(a)P, acqua (controllo), estratto di ginseng rosso cinese (CRG), estratto di ginseng rosso coreano A (KRGA) e rosso coreano ginseng.Estratto B (KRGB) ed Estratto C di Ginseng Rosso Coreano (KRGC).Dopo 20 settimane di trattamento con ginseng rosso, i topi sono stati sacrificati mediante asfissia con CO2.La Figura 1B mostra tumori polmonari macroscopici in animali trattati con diversi tipi di ginseng rosso e la Figura 1C mostra una micrografia ottica rappresentativa di un campione di tumore.Il carico tumorale degli animali trattati con KRGB (1,5 ± 0,35) era inferiore a quello degli animali di controllo (0,82 ± 0,2, P <0,05), come mostrato nella Figura 1D.Il grado medio di inibizione del carico tumorale è stato del 45%.Altri estratti di ginseng rosso testati non hanno mostrato cambiamenti così significativi nel carico tumorale (P > 0,05).Non sono stati osservati effetti collaterali evidenti nel modello murino durante 20 settimane di trattamento con ginseng rosso, incluso nessun cambiamento nel peso corporeo (dati non mostrati) e nessuna tossicità epatica o renale (Figura 1E,F).
L’estratto di ginseng rosso tratta lo sviluppo del tumore ai polmoni nei topi A/J.(A) Progettazione sperimentale.(B) Tumori polmonari di grandi dimensioni in un modello murino.I tumori sono indicati dalle frecce.a: Gruppo ginseng rosso cinese.b: gruppo A del ginseng rosso coreano.c: gruppo B del ginseng rosso coreano. d: gruppo C del ginseng rosso coreano. d: gruppo di controllo.(C) Micrografia ottica che mostra un tumore al polmone.Ingrandimento: 100. b: 400. (D) Carico tumorale nel gruppo dell'estratto di ginseng rosso.(E) Livelli plasmatici dell'enzima epatico ALT.(F) Livelli plasmatici dell'enzima renale Cr.I dati sono espressi come media ± deviazione standard.*P<0,05.
Gli estratti di ginseng rosso identificati in questo studio sono stati analizzati mediante cromatografia liquida a ultra prestazioni e spettrometria di massa tandem (UPLC-MS/MS) per quantificare i seguenti ginsenosidi: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Tg5.Le condizioni UPLC e MS utilizzate per misurare gli analiti sono state descritte in un rapporto precedente19.I cromatogrammi UPLC-MS/MS di quattro estratti di ginseng rosso sono mostrati nella Figura 2A.Sono state riscontrate differenze significative nel contenuto totale di ginsenoside, con il contenuto totale di ginsenoside più elevato nel CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figura 2B).Nel valutare i singoli ginsenosidi (Figura 2C), KRGB ha mostrato il livello più alto di G-Rg3 rispetto ad altri ginsenosidi (58,33 ± 3,81 μmol/L per G-Rg3 e 41,56 ± 2,88 μmol/L per G -Rg3r).L).tipo ginseng rosso (P <0,001).G-Rg3 si presenta come una coppia di stereoisomeri G-Rg3r e G-Rg3s, che differiscono nella posizione del gruppo ossidrile al carbonio 20 (Fig. 2D).I risultati indicano che G-Rg3r o G-Rg3 possono avere un importante potenziale antitumorale in un modello murino di cancro indotto da B(a)P.
Contenuto di ginsenosidi in vari estratti di ginseng rosso.(A) Cromatogrammi UPLC-MS/MS di quattro estratti di ginseng rosso.(B) Stima del contenuto totale di ginsenoside negli estratti indicati.(C) Rilevazione dei singoli ginsenosidi negli estratti etichettati.(D) Strutture degli stereoisomeri ginsenosidici G-Rg3r e G-Rg3.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di determinazioni triplicate.***P<0,001.
Lo studio UPLC-MS/MS ha richiesto la quantificazione dei ginsenosidi in campioni intestinali e di sangue dopo 20 settimane di trattamento.Il trattamento con KRGB ha evidenziato la presenza di soli 0,0063 ± 0,0005 μg/ml di Rg5 nel sangue.Non sono stati rilevati ginsenosidi rimanenti, indicando una scarsa biodisponibilità orale e quindi una ridotta esposizione a questi ginsenosidi.
La linea cellulare di adenocarcinoma del colon Caco-2 è morfologicamente e biochimicamente simile alle cellule epiteliali intestinali umane, dimostrando la sua utilità nel valutare il trasporto degli enterociti attraverso la barriera epiteliale intestinale.Questa analisi si basava su uno studio precedente 20 .Le figure 3A,B,C,D,E,F mostrano immagini rappresentative del trasporto transcellulare di G-Rg3r e G-Rg3 utilizzando un modello monostrato Caco-2.Il trasporto transcellulare di G-Rg3r o G-Rg3 attraverso i monostrati Caco-2 dal lato basolaterale a quello apicale (Pb-a) era significativamente più alto rispetto al lato apicale-basolaterale (Pa-b).Per G-Rg3r, il valore medio di Pa-b era 0,38 ± 0,06, che aumentava a 0,73 ± 0,06 dopo il trattamento con 50 μmol/L di verapamil e a 1,14 ± 0,09 dopo il trattamento con 100 μmol/L di verapamil (p < 0,01 e 0,001, rispettivamente; Figura 2).3A).Le osservazioni per G-Rg3 hanno seguito uno schema simile (Fig. 3B) e i risultati hanno mostrato che il trattamento con verapamil ha migliorato il trasporto di G-Rg3r e G-Rg3.Il trattamento con verapamil ha anche comportato una diminuzione significativa dei rapporti di efflusso medi di Pb-a e G-Rg3r e G-Rg3s (Figura 3C,D,E,F), indicando che il trattamento con verapamil riduce il contenuto di ginsenoside nelle cellule di efflusso Caco-2..
Trasporto transcellulare di G-Rg3 in monostrati di Caco-2 e assorbimento intestinale in un test di perfusione nel ratto.(A) Valore Pa-b del gruppo G-Rg3r nel monostrato Caco-2.(B) Valore Pa-b dei gruppi G-Rg3s nel monostrato Caco-2.(C) Valore Pb del gruppo G-Rg3r nel monostrato Caco-2.(D) Valore Pb dei gruppi G-Rg3 nel monostrato Caco-2.(E) Rapporto di resa dei gruppi G-Rg3r in un monostrato Caco-2.(F) Rapporto di resa dei gruppi G-Rg3 in un monostrato Caco-2.(G) Percentuale di assorbimento intestinale di G-Rg3r in un test di perfusione nei ratti.(H) Percentuale di assorbimento intestinale di G-Rg3 in un test di perfusione nei ratti.Permeabilità e assorbimento sono stati confrontati senza l'aggiunta di verapamil.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di cinque esperimenti indipendenti.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Coerentemente con il lavoro precedente20, è stata eseguita la perfusione intestinale ortotopica dei ratti per determinare se l'assorbimento di G-Rg3 nell'intestino aumenta dopo il trattamento con verapamil.Le Figure 3G,H mostrano test di perfusione rappresentativi per valutare la percentuale di assorbimento intestinale di G-Rg3r e G-Rg3 in ratti modello di cancro durante i periodi di tempo sopra menzionati.La percentuale iniziale di debole assorbimento di G-Rg3r pari a circa il 10% è aumentata a oltre il 20% dopo il trattamento con 50 μM di verapamil e a oltre il 25% dopo il trattamento con 100 μM di verapamil.Allo stesso modo, G-Rg3, che aveva un assorbimento iniziale del 10%, ha mostrato anche un picco di oltre il 20% dopo il trattamento con 50 μM di verapamil e quasi il 30% dopo il trattamento con 100 μM di verapamil, suggerendo che l’inibizione della P-gp da parte del verapamil aumenta assorbimento intestinale di G Rg3 in un modello murino di cancro ai polmoni.
Secondo il metodo di cui sopra, i topi modello di cancro indotto da B(a)P sono stati divisi casualmente in sei gruppi, come mostrato nella Figura 4A.Non è stata osservata alcuna perdita di peso significativa o segni clinici di tossicità nel gruppo di trattamento G-Rg3 rispetto al gruppo di controllo (dati non mostrati).Dopo 20 settimane di trattamento, sono stati raccolti i polmoni di ciascun topo.La Figura 4B mostra tumori polmonari macroscopici nei topi nei gruppi di trattamento di cui sopra e la Figura 4C mostra una micrografia ottica rappresentativa di un tumore rappresentativo.Per quanto riguarda il carico tumorale in ciascun gruppo (Fig. 4D), i valori per i topi trattati con G-Rg3r e G-Rg3s erano rispettivamente 0,75 ± 0,29 mm3 e 0,81 ± 0,30 mm3, mentre i valori per i topi G trattati con -Rg3 erano 1,63 rispettivamente ±0,40 mm3.topi di controllo (p <0,001), indicando che il trattamento con G-Rg3 ha ridotto il carico tumorale nei topi.La somministrazione di verapamil ha ulteriormente migliorato questa riduzione: i valori nei topi verapamil+ G-Rg3r sono diminuiti da 0,75 ± 0,29 mm3 a 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) e i valori per verapamil+ da 0,81 ± 0,30 mm3 sono diminuiti a 0,29 ± 0,21. mm3 nei topi trattati con G. -Rg3s (p < 0,05), indicando che il verapamil può potenziare l'effetto inibitorio di G-Rg3 sulla tumorigenesi.Il carico tumorale non ha mostrato differenze significative tra il gruppo di controllo e il gruppo verapamil, il gruppo G-Rg3r e il gruppo G-Rg3s, e il gruppo verapamil+G-Rg3r e il gruppo verapamil+G-Rg3s.Inoltre, non sono state riscontrate tossicità epatiche o renali significative associate ai trattamenti valutati (Figura 4E,F).
Carico tumorale dopo trattamento con G-Rg3 e livelli plasmatici o intestinali di G-Rg3r e G-Rg3 nei gruppi indicati.(A) Progettazione sperimentale.(B) Tumori macroscopici in un modello murino.I tumori sono indicati dalle frecce.la: Sol-Rg3r.b: Sol-Tg3s.c: G-Rg3r in combinazione con verapamil.d: G-Rg3 in combinazione con verapamil.d: Verapamil.e: controllo.(C) Micrografia ottica del tumore con ingrandimento.Risposta: 100x.b: 400X.(D) Effetto del trattamento con G-Rg3 + verapamil sul carico tumorale nei topi A/J.(E) Livelli plasmatici dell'enzima epatico ALT.(F) Livelli plasmatici dell'enzima renale Cr.(G) Livelli plasmatici di G-Rg3r o G-Rg3 dei gruppi indicati.(H) Livelli di G-Rg3r o G-Rg3 nell'intestino dei gruppi indicati.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di determinazioni triplicate.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
I livelli di G-Rg3 nei topi modello di cancro indotto da B(a)P sono stati valutati mediante UPLC-MS/MS dopo un periodo di trattamento di 20 settimane secondo il metodo descritto nella sezione Metodi.Le figure 4G e H mostrano rispettivamente i livelli plasmatici e intestinali di G-Rg3.I livelli plasmatici di G-Rg3r erano 0,44 ± 0,32 μmol/L e aumentavano a 1,17 ± 0,47 μmol/L con la somministrazione concomitante di verapamil (p < 0,001), mentre i livelli intestinali di G-Rg3r erano 0,53 ± 0,08 µg/l.In combinazione con verapamil, i g aumentavano a 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Per G-Rg3, i risultati hanno seguito un modello simile, indicando che il trattamento con verapamil ha aumentato la biodisponibilità orale di G-Rg3 nei topi A/J.
Il test di vitalità cellulare è stato utilizzato per valutare la citotossicità di B(a)P e G-Rg3 sulle cellule hEL.La citotossicità indotta da B(a)P nelle cellule hEL è mostrata nella Figura 5A, mentre le proprietà non tossiche di G-Rg3r e G-Rg3 sono mostrate nelle Figure 5A e 5B.5B, C. Per valutare l'effetto citoprotettivo di G-Rg3, B(a)P è stato co-somministrato con varie concentrazioni di G-Rg3r o G-Rg3 nelle cellule hEL.Come mostrato nella Figura 5D, G-Rg3r a concentrazioni di 5 μM, 10 μM e 20 μM hanno ripristinato la vitalità cellulare rispettivamente al 58,3%, 79,3% e 77,3%.Risultati simili possono essere osservati anche nel gruppo G-Rg3.Quando le concentrazioni di G-Rg3 erano 5 µM, 10 µM e 20 µM, la vitalità cellulare è stata ripristinata rispettivamente al 58,3%, 72,7% e 76,7% (Figura 5E).).La presenza di addotti BPDE-DNA è stata misurata utilizzando un kit ELISA.I nostri risultati hanno mostrato che i livelli di addotti BPDE-DNA erano aumentati nel gruppo trattato con B(a)P rispetto al gruppo di controllo, ma rispetto al co-trattamento con G-Rg3, i livelli di addotti BPDE-DNA nel gruppo B(a)P B nel gruppo trattato, i livelli di addotti al DNA erano significativamente ridotti.I risultati del trattamento con il solo B(a)P sono mostrati nella Figura 5F (1,87 ± 0,33 vs 3,77 ± 0,42 per G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs 3,77 ± 0,42 per G -Rg3s, p < 0,001).
Vitalità cellulare e formazione di addotti BPDE-DNA in cellule hEL trattate con G-Rg3 e B (a) P.(A) Vitalità delle cellule hEL trattate con B (a) P.(B) Vitalità delle cellule hEL trattate con G-Rg3r.(C) Vitalità delle cellule hEL trattate con G-Rg3.(D) Vitalità delle cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3r.(E) Vitalità delle cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3.(F) Livelli di addotto BPDE-DNA nelle cellule hEL trattate con B(a)P e G-Rg3.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di determinazioni triplicate.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
L'espressione dell'enzima GST è stata rilevata dopo il co-trattamento con 10 μM di B(a)P e 10 μM di G-Rg3r o G-Rg3s.I nostri risultati hanno mostrato che B(a)P ha soppresso l'espressione di GST (59,7 ± 8,2% nel gruppo G-Rg3r e 39 ± 4,5% nel gruppo G-Rg3s) e B(a)P era associato a G-Rg3r , o con G-Rg3r, o con G-Rg3r.Il co-trattamento con G-Rg3 ha ripristinato l'espressione GST.Espressione GST (103,7 ± 15,5% nel gruppo G-Rg3r e 110 ± 11,1% nel gruppo G-Rg3s, p <0,05 e p <0,001, rispettivamente, Fig. 6A, B e C).L'attività GST è stata valutata utilizzando un kit di analisi dell'attività.I nostri risultati hanno mostrato che il gruppo di trattamento combinato aveva un’attività GST più elevata rispetto al gruppo solo B(a)P (96,3 ± 6,6% contro 35,7 ± 7,8% nel gruppo G-Rg3r contro 92,3 ± 6,5 nel gruppo G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% nel gruppo G-Rg3, p <0,001, Figura 6D).
Espressione di GST e Nrf2 in cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3.(A) Rilevazione dell'espressione GST mediante Western blotting.(B) Espressione quantitativa di GST in cellule hEL trattate con B(a)P e G-Rg3r.(C) Espressione quantitativa di GST nelle cellule hEL trattate con B(a)P e G-Rg3.(D) Attività GST nelle cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3.(E) Rilevazione dell'espressione di Nrf2 mediante Western blotting.(F) Espressione quantitativa di Nrf2 in cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3r.(G) Espressione quantitativa di Nrf2 in cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di determinazioni triplicate.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Per chiarire i percorsi coinvolti nella soppressione mediata da G-Rg3 della tumorigenesi indotta da B (a) P, l'espressione di Nrf2 è stata valutata mediante Western blotting.Come mostrato nelle Figure 6E,F,G, rispetto al gruppo di controllo, solo il livello di Nrf2 nel gruppo di trattamento B(a)P era diminuito;tuttavia, rispetto al gruppo di trattamento B(a)P, i livelli di B(a) Nrf2 nel gruppo PG-Rg3 erano aumentati (106 ± 9,5% per G-Rg3r contro 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% per G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% per G-Rg3s, p < 0,01).
Abbiamo confermato il ruolo preventivo di Nrf2 sopprimendo l'espressione di Nrf2 utilizzando specifici piccoli RNA interferenti (siRNA).Il knockdown di Nrf2 è stato confermato dal Western blotting (Fig. 7A,B).Come mostrato nelle Figure 7C,D, il co-trattamento delle cellule hEL con B(a)P e G-Rg3 ha comportato una diminuzione del numero di addotti BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) rispetto al trattamento con B(a)P da solo nel gruppo di controllo siRNA.) G-Rg3r era 4,13 ± 0,49, G-Rg3s era 1,8 ± 0,32 e 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Tuttavia, l'effetto inibitorio di G-Rg3 sulla formazione di BPDE-DNA è stato abolito dal knockdown di Nrf2.Nel gruppo siNrf2, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nella formazione di addotti BPDE-DNA tra il co-trattamento con B(a)P e G-Rg3 e il solo trattamento con B(a)P (3,0 ± 0,21 per G-Rg3r contro 3,56 ± 0,32 ).per G-Rg3r rispetto a 3,6 per G-Rg3s rispetto a ±0,45 rispetto a 4,0±0,37, p > 0,05).
Effetto del knockdown di Nrf2 sulla formazione di addotti BPDE-DNA nelle cellule hEL.(A) Il knockdown di Nrf2 è stato confermato dal Western blotting.(B) Quantificazione dell'intensità della banda Nrf2.(C) Effetto del knockdown di Nrf2 sui livelli di addotti BPDE-DNA nelle cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3r.(D) Effetto del knockdown di Nrf2 sui livelli di addotti BPDE-DNA nelle cellule hEL trattate con B (a) P e G-Rg3.I dati sono espressi come media ± deviazione standard di determinazioni triplicate.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Questo studio ha valutato gli effetti preventivi di vari estratti di ginseng rosso su un modello murino di cancro ai polmoni indotto da B(a)P e il trattamento con KRGB ha ridotto significativamente il carico tumorale.Considerando che G-Rg3 è il contenuto più elevato in questo estratto di ginseng, è stato studiato l'importante ruolo di questo ginsenoside nell'inibizione della tumorigenesi.Sia G-Rg3r che G-Rg3 (due epimeri di G-Rg3) hanno ridotto significativamente il carico tumorale in un modello murino di cancro indotto da B(a)P.G-Rg3r e G-Rg3 esercitano effetti antitumorali inducendo l'apoptosi delle cellule tumorali21, inibendo la crescita del tumore22, arrestando il ciclo cellulare23 e influenzando l'angiogenesi24.È stato anche dimostrato che G-Rg3 inibisce le metastasi cellulari25 ed è stata documentata la capacità di G-Rg3 di potenziare gli effetti della chemioterapia e della radioterapia26,27.Poon et al hanno dimostrato che il trattamento con G-Rg3 potrebbe ridurre gli effetti genotossici di B(a)P28.Questo studio dimostra il potenziale terapeutico di G-Rg3 nel colpire le molecole cancerogene ambientali e nella prevenzione del cancro.
Nonostante il loro buon potenziale profilattico, la scarsa biodisponibilità orale dei ginsenosidi rappresenta una sfida per l’uso clinico di queste molecole.L'analisi farmacocinetica della somministrazione orale di ginsenosidi nei ratti ha dimostrato che la sua biodisponibilità è ancora inferiore al 5%29.Questi test hanno dimostrato che dopo il periodo di trattamento di 20 settimane, solo i livelli ematici di Rg5 sono diminuiti.Anche se il meccanismo alla base della scarsa biodisponibilità resta da chiarire, si ritiene che la P-gp sia coinvolta nell’efflusso dei ginsenosidi.Questo lavoro ha dimostrato per la prima volta che la somministrazione di verapamil, un bloccante della P-gp, aumenta la biodisponibilità orale di G-Rg3r e G-Rg3.Pertanto, questa scoperta suggerisce che G-Rg3r e G-Rg3 agiscono come substrati della P-gp per regolarne l'efflusso.
Questo lavoro dimostra che il trattamento combinato con verapamil aumenta la biodisponibilità orale di G-Rg3 in un modello murino di cancro ai polmoni.Questa scoperta è supportata dall’aumento del trasporto transcellulare intestinale di G-Rg3 in seguito al blocco della P-gp, aumentandone così l’assorbimento.I test sulle cellule Caco2 hanno mostrato che il trattamento con verapamil ha ridotto l'efflusso di G-Rg3r e G-Rg3 migliorando al contempo la permeabilità della membrana.Uno studio di Yang et al.Gli studi hanno dimostrato che il trattamento con ciclosporina A (un altro bloccante della P-gp) aumenta la biodisponibilità del ginsenoside Rh2 da un valore basale dell'1%20 a oltre il 30%.Anche i composti ginsenosidi K e Rg1 hanno mostrato risultati simili30,31.Quando verapamil e ciclosporina A sono stati somministrati contemporaneamente, l'efflusso del composto K nelle cellule Caco-2 è stato significativamente ridotto da 26,6 a meno di 3, mentre i suoi livelli intracellulari sono aumentati di 40 volte30.In presenza di verapamil, i livelli di Rg1 aumentavano nelle cellule epiteliali del polmone di ratto, suggerendo un ruolo della P-gp nell'efflusso dei ginsenoside, come mostrato da Meng et al.31.Tuttavia, il verapamil non ha avuto lo stesso effetto sull’efflusso di alcuni ginsenosidi (come Rg1, F1, Rh1 e Re), indicando che essi non sono influenzati dai substrati della P-gp, come mostrato da Liang et al.32 .Questa osservazione può essere correlata al coinvolgimento di altri trasportatori e di strutture ginsenosidiche alternative.
Il meccanismo dell’effetto preventivo di G-Rg3 sul cancro non è chiaro.Studi precedenti hanno dimostrato che G-Rg3 previene il danno al DNA e l'apoptosi riducendo lo stress ossidativo e l'infiammazione16,33, che potrebbe essere il meccanismo sottostante per prevenire la tumorigenesi indotta da B (a) P.Alcuni rapporti indicano che la genotossicità indotta dal B(a)P può essere ridotta modulando gli enzimi di fase II per formare BPDE-DNA34.Il GST è un tipico enzima di fase II che inibisce la formazione di addotti BPDE-DNA promuovendo il legame del GSH al BPDE, riducendo così il danno al DNA indotto da B(a)P35.I nostri risultati mostrano che il trattamento con G-Rg3 riduce la citotossicità indotta da B (a) P e la formazione di addotti BPDE-DNA nelle cellule hEL e ripristina l'espressione e l'attività di GST in vitro.Tuttavia, questi effetti erano assenti in assenza di Nrf2, suggerendo che G-Rg3 induce effetti citoprotettivi attraverso la via Nrf2.Nrf2 è un importante fattore di trascrizione per gli enzimi di disintossicazione di fase II che promuove l'eliminazione degli xenobiotici36.L'attivazione della via Nrf2 induce citoprotezione e riduce il danno tissutale37.Inoltre, diversi rapporti hanno supportato il ruolo di Nrf2 come soppressore del tumore nella carcinogenesi38.Il nostro studio mostra che l'induzione della via Nrf2 da parte di G-Rg3 svolge un importante ruolo regolatorio nella genotossicità indotta da B (a) P causando la disintossicazione da B (a) P attivando gli enzimi di fase II, inibendo così il processo di tumorigenesi.
Il nostro lavoro rivela il potenziale del ginseng rosso nella prevenzione del cancro polmonare indotto da B(a)P nei topi attraverso l’importante coinvolgimento del ginsenoside G-Rg3.La scarsa biodisponibilità orale di questa molecola ne ostacola l’applicazione clinica.Tuttavia, questo studio mostra per la prima volta che G-Rg3 è un substrato della P-gp e la somministrazione di un inibitore della P-gp aumenta la biodisponibilità di G-Rg3 in vitro e in vivo.G-Rg3 riduce la citotossicità indotta da B (a) P regolando la via Nrf2, che può essere un potenziale meccanismo per la sua funzione preventiva.Il nostro studio conferma il potenziale del ginsenoside G-Rg3 per la prevenzione e il trattamento del cancro ai polmoni.
Topi A/J femmine di sei settimane (20 ± 1 g) e ratti Wistar maschi di 7 settimane (250 ± 20 g) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) e dal Wuhan Institute of Zoology.Università (Wuhan, Cina).Il Centro cinese di raccolta di colture di tipo (Wuhan, Cina) ci ha fornito cellule Caco-2 e hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) è una fonte di B(a)P e tricaprina.I ginsenosidi purificati G-Rg3r e G-Rg3s, il dimetilsolfossido (DMSO), il kit di test di proliferazione CellTiter-96 (MTS), il verapamil, il terreno essenziale minimo (MEM) e il siero bovino fetale (FBS) sono stati acquistati da Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Cina).Il mini kit QIAamp DNA e il kit ELISA per addotti BPDE-DNA sono stati acquistati da Qiagen (Stanford, CA, USA) e Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).Il kit di analisi dell'attività GST e il kit di analisi delle proteine totali (metodo BCA standard) sono stati acquistati da Solarbio (Pechino, Cina).Tutti gli estratti di ginseng rosso sono conservati nel Laboratorio Mingyu 7. L'Università Battista di Hong Kong (Hong Kong, Cina) e il Korea Cancer Center (Seoul, Corea) sono fonti commerciali di estratto CRG e vari estratti di ginseng rosso di varie origini coreane (compresi KRGA, KRGB e KRGC).Il ginseng rosso è ottenuto dalle radici del ginseng fresco di 6 anni.L'estratto di ginseng rosso si ottiene lavando il ginseng con acqua tre volte, quindi concentrando l'estratto acquoso e infine essiccando a bassa temperatura per ottenere l'estratto di ginseng in polvere.Gli anticorpi (anti-Nrf2, anti-GST e β-actina), l'immunoglobulina G anti-coniglio coniugata con perossidasi di rafano (IgG), il reagente di trasfezione, il siRNA di controllo e il siRNA Nrf2 sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), STATI UNITI D'AMERICA).
Le cellule Caco2 e hEL sono state coltivate in piastre di coltura cellulare da 100 mm2 con MEM contenente il 10% di FBS a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.Per determinare l'effetto delle condizioni di trattamento, le cellule hEL sono state incubate con diverse concentrazioni di B(a)P e G-Rg3 in MEM per 48 ore.Le cellule possono essere ulteriormente analizzate o raccolte per preparare estratti privi di cellule.
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico animale sperimentale del Tongji Medical College, Università di scienza e tecnologia di Huazhong (approvazione n. 2019; registrazione n. 4587TH).Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Ai topi A/J di otto settimane è stato prima iniettato per via intraperitoneale B(a)P in soluzione tricaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Dopo una settimana, i topi sono stati divisi casualmente in gruppi di controllo e diversi gruppi di trattamento, 15 topi in ciascun gruppo, e sottoposti a sonda gastrica una volta al giorno.Dopo 20 settimane di trattamento, gli animali sono stati sacrificati mediante asfissia da CO2.I polmoni sono stati raccolti e fissati per 24 ore.Il numero di tumori superficiali e le dimensioni dei singoli tumori sono stati quantificati per ciascun polmone al microscopio da dissezione.Le stime del volume del tumore (V) sono state calcolate utilizzando la seguente espressione: V (mm3) = 4/3πr3, dove r è il diametro del tumore.La somma netta di tutti i volumi tumorali nei polmoni dei topi rappresentava il volume totale del tumore e il volume totale medio del tumore in ciascun gruppo rappresentava il carico tumorale.I campioni di sangue intero e intestinali sono stati raccolti e conservati a -80°C per la determinazione UPLC-MS/MS.È stato raccolto il siero ed è stato utilizzato un analizzatore chimico automatizzato per analizzare i livelli di alanina aminotransferasi (ALT) e creatinina sierica (Cr) per valutare la funzionalità epatica e renale.
I campioni raccolti sono stati rimossi dalla cella frigorifera, scongelati, pesati e posti in provette come descritto sopra.A questo è stata aggiunta 0,5 μM di florizina (standard interno) in 0,8 ml di soluzione metanolo.Il tessuto è stato quindi omogeneizzato utilizzando Tissue-Tearor e l'omogenato è stato successivamente trasferito in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.La miscela è stata centrifugata a 15500 giri al minuto per 15 minuti.Dopo aver rimosso 1,0 ml di surnatante, asciugare con azoto.Per il recupero sono stati utilizzati 200 microlitri di metanolo.Il sangue viene raccolto ed elaborato su un'unica linea e viene utilizzato come riferimento per tutte le misurazioni.
Piastre Transwell da 24 pozzetti sono state seminate con 1,0 × 105 cellule Caco-2 per pozzetto per valutare il potenziale miglioramento del trasporto G-Rg3 mediante l'aggiunta di verapamil.Dopo 3 settimane di coltura, le cellule sono state lavate con HBSS e preincubate a 37°C.400 μL di 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s o una miscela con 50 o 100 μM di verapamil) sono stati iniettati sul lato basolaterale o apicale del monostrato e 600 μL di soluzione HBSS sono stati aggiunti all'altro lato.Raccogliere 100 ml di terreno di coltura ai tempi designati (0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minuti) e aggiungere 100 ml di HBSS per compensare questo volume.I campioni sono stati conservati a -4 °C fino al rilevamento mediante UPLC-MS/MS.L'espressione Papp = dQ/(dT × A × C0) viene utilizzata per quantificare la permeabilità apparente unidirezionale apicale e basolaterale e viceversa (Pa-b e Pb-a, rispettivamente);dQ/dT è la variazione di concentrazione, A (0,6 cm2) è l'area superficiale del monostrato e C0 è la concentrazione iniziale del donatore.Il rapporto di efflusso è calcolato come Pb-a/Pa-b, che rappresenta la velocità di efflusso del farmaco in studio.
Ratti maschi Wistar sono stati tenuti a digiuno per 24 ore, hanno bevuto solo acqua e anestetizzati con un'iniezione endovenosa di soluzione di pentobarbital al 3,5%.Il tubo in silicone intubato ha l'estremità del duodeno come ingresso e l'estremità dell'ileo come uscita.Utilizzare una pompa peristaltica per pompare l'ingresso con 10 µM G-Rg3r o G-Rg3s in HBSS isotonico ad una portata di 0,1 ml/min.L'effetto del verapamil è stato valutato aggiungendo 50 μM o 100 μM del composto a 10 μM di G-Rg3r o G-Rg3s.UPLC-MS/MS è stato eseguito su estratti di perfusione raccolti nei punti temporali 60, 90, 120 e 150 minuti dopo l'inizio della perfusione.La percentuale di assorbimento è quantificata dalla formula % assorbimento = (1 – Cout/Cin) × 100%;la concentrazione di G-Rg3 all'uscita e all'ingresso è espressa rispettivamente da Cout e Cin.
Le cellule hEL sono state seminate in piastre da 96 pozzetti con una densità di 1 × 104 cellule per pozzetto e trattate con B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) o G-Rg3 disciolto in DMSO .I farmaci sono stati poi diluiti con terreno di coltura a varie concentrazioni (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) nell'arco di 48 ore.Utilizzando un kit di analisi MTS disponibile in commercio, le cellule sono state sottoposte a un protocollo standard e quindi misurate utilizzando un lettore di micropiastre a 490 nm.Il livello di vitalità cellulare dei gruppi co-trattati con B(a)P (10 μM) e G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) è stato valutato secondo il metodo sopra e confrontato con il gruppo non trattato.
Le cellule hEL sono state seminate in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 1 × 105 cellule/pozzetto e trattate con 10 μMB(a)P in presenza o assenza di 10 μM G-Rg3.Dopo 48 ore di trattamento, il DNA è stato estratto dalle cellule hEL utilizzando il kit QIAamp DNA Mini secondo il protocollo del produttore.La formazione di addotti BPDE-DNA è stata rilevata utilizzando un kit ELISA per addotti BPDE-DNA.I livelli relativi dell'addotto BPDE-DNA sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre misurando l'assorbanza a 450 nm.
Le cellule hEL sono state seminate in piastre da 96 pozzetti con una densità di 1 × 104 cellule per pozzetto e trattate con 10 μMB (a) P in assenza o presenza di 10 μM G-Rg3 per 48 ore.L'attività GST è stata misurata utilizzando un kit commerciale di analisi dell'attività GST secondo il protocollo del produttore.L'attivazione relativa della GST è stata misurata mediante assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
Le cellule hEL sono state lavate con PBS ghiacciato e quindi lisate utilizzando un tampone di analisi di radioimmunoprecipitazione contenente inibitori della proteasi e inibitori della fosfatasi.Dopo la quantificazione delle proteine utilizzando un kit di analisi delle proteine totali, 30 μg di proteine in ciascun campione sono stati separati mediante SDS-PAGE al 12% e trasferiti su una membrana in PVDF mediante elettroforesi.Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e incubate con anticorpi primari durante la notte a 4°C.Dopo l'incubazione con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano, sono stati aggiunti reagenti di chemiluminescenza potenziati per visualizzare il segnale di legame.L'intensità di ciascuna banda proteica è stata quantificata utilizzando il software ImageJ.
Il software GraphPad Prism 7.0 è stato utilizzato per analizzare tutti i dati, espressi come media ± deviazione standard.La variazione tra i gruppi di trattamento è stata valutata utilizzando il test t di Student o l'analisi della varianza a una via, con un valore P <0,05 che indica significatività statistica.
Tutti i dati ottenuti o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e in file di informazioni supplementari.
Torre, LA, Siegel, RL e Jemal, A. Statistiche sul cancro al polmone.avverbio.Scaduto.medicinale.biologia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Agenti cancerogeni del tabacco, loro biomarcatori e cancro indotto dal tabacco.Naz.Cappellano del cancro.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH e Venitt, S. DNA e addotti proteici nei tessuti umani derivanti dall'esposizione al fumo di tabacco.internazionalità.J. Cancro.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA e Yu M. Effetto di Houttuynia cordata e silibinina sulla tumorigenesi polmonare indotta da benzo (a) pirene nei topi A/J.Cancro 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Prodotto naturale antitumorale isolato da materiali medicinali cinesi.mascella.medicinale.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Efficacia del polifenone E, del ginseng rosso e della rapamicina sulla tumorigenesi polmonare indotta da benzo(a)pirene nei topi A/J.Cancro 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS e Yuan, KS Red, coinvolgimento nella terapia del cancro.mascella.J. Nutt.medicinale.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS e Gao, L. Ginsenosidi nelle radici e nelle foglie del ginseng americano.J. Agric.Chimica degli alimenti.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA e Yuan KS Farmacologia del ginseng: molti componenti e molti effetti.biochimica.farmacologia.58, 1685–1693 (1999).
Orario di pubblicazione: 17 settembre 2023