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紅参は何百年もの間、アジアの伝統医学で使用されてきました。この研究では、異なる地域で栽培された 4 種類の紅参 (中国産紅参、韓国紅参 A、韓国紅参 B、韓国紅参 C) の発がん物質誘発性肺の形成と増殖を抑制する能力を評価しました。腫瘍。A/J マウスでベンゾ(a)ピレン (B(a)P) テストを行ったところ、高麗紅参 B が 4 種類の紅参品種の中で腫瘍負荷の軽減に最も効果的であることが判明しました。さらに、4 つの紅参抽出物中のさまざまなジンセノサイド (Rg1、Re、Rc、Rb2、Rb3、Rb1、Rh1、Rd、Rg3、Rh2、F1、Rk1、Rg5) の含有量を分析したところ、高麗紅参 B にはジンセノサイド Rg3 (G-Rg3) のレベルが最も高く、G-Rg3 がその治療効果において重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されています。この研究は、G-Rg3 の生物学的利用能が比較的低いことを示しています。しかし、G-Rg3 を P-gp 阻害剤ベラパミルと同時投与すると、Caco-2 細胞への G-Rg3 の流出が減少し、ラットモデルにおける G-Rg3 の腸吸収速度が増加し、G-Rg3増加されました。Caco-2 細胞では Rg3 の流出が減少し、Rg3 濃度のレベルが低下します。G-Rg3 は腸と血漿で増加し、B(a)P 誘発腫瘍形成のラット モデルでも腫瘍を予防するその能力が強化されます。また、G-Rg3 がヒト肺細胞における B(a)P 誘導性の細胞毒性と DNA 付加体形成を軽減し、Nrf2 経路を介して第 II 相酵素の発現と活性を回復することも発見しました。これは潜在的な作用機序に関連している可能性があります。 G 阻害 -Rg3。。肺腫瘍の発生について。私たちの研究は、マウスモデルにおける肺腫瘍の標的化におけるG-Rg3の潜在的に重要な役割を実証しています。このジンセノサイドの経口バイオアベイラビリティは、P 糖タンパク質を標的とすることで強化され、分子が抗がん効果を発揮できるようになります。
最も一般的なタイプの肺がんは非小細胞肺がん (NSCLC) で、これは中国と北米におけるがんによる死亡の主な原因の 1 つです 1,2。非小細胞肺がんの発症リスクを高める主な要因は喫煙です。紙巻きタバコの煙には、ベンゾ(a)ピレン (B(a)P)、ニトロソアミン、ラドンの崩壊による放射性同位体など、60 以上の発がん物質が含まれています3。多環芳香族炭化水素 B(a)P は紙巻きタバコの毒性の主な原因です。煙。B(a)P に曝露されると、シトクロム P450 はそれを B(a)P-7,8-ジヒドロジオール-9,10-エポキシド (BPDE) に変換し、これが DNA と反応して BPDE-DNA 付加物 4 を形成します。アダクトは、ヒトの肺腫瘍と同様の腫瘍期および組織病理を有するマウスにおいて肺腫瘍形成を誘発する5。この特徴により、B(a)P 誘発肺癌モデルは、抗癌特性を持つ可能性のある化合物を評価するための適切なシステムになります。
高リスク群、特に喫煙者における肺がんの発症を予防するための考えられる戦略の 1 つは、化学予防薬を使用して上皮内腫瘍性病変の発症を抑制し、それによってその後の悪性腫瘍への進行を防ぐことです。動物実験では、さまざまな化学予防薬が有効であることが示されています6。私たちの以前のレポート 7 では、紅参の肺がんに対する優れた予防効果が強調されました。このハーブは、寿命と健康を延ばすためにアジアの伝統医学で何世紀にもわたって使用されており、抗腫瘍効果があることが記録されています8。
高麗人参の活性因子はジンセノサイドであり、高麗人参抽出物の品質を評価するための複合マーカーとして使用されます。高麗人参粗抽出物の定量分析には、通常、RK1、Rg1、F1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rh1、Rh2、Rg3、Rg5、および Rc9,10 を含むいくつかのジンセノサイドの使用が含まれます。ジンセノサイドは、経口での生物学的利用能が非常に低いため、臨床用途はほとんどありません11。この生物学的利用能の低下のメカニズムは明らかではありませんが、P 糖タンパク質 (P-gp)12 によって引き起こされるジンセノサイドの流出が原因である可能性があります。P-gp は、ATP 結合カセットトランスポータースーパーファミリーの中で最も重要な排出トランスポーターの 1 つであり、ATP 加水分解のエネルギーを利用して細胞内物質を外部環境に放出します。P-gp トランスポーターは通常、腸、腎臓、肝臓、血液脳関門に広く分布しています13。P-gp は腸管での吸収に重要な役割を果たしており、P-gp を阻害すると一部の抗がん剤の経口吸収と利用可能性が高まります 12,14。文献で以前に使用されている阻害剤の例は、ベラパミルおよびシクロスポリン A15 です。この研究には、中国および韓国産のさまざまな紅参抽出物の悪性腫瘍に対する影響を評価するために、B(a)P 誘発肺がんを研究するためのマウス系を確立することが含まれます。抽出物は個別に分析され、発がんに影響を与える可能性のある特定のジンセノサイドが特定されました。次に、ベラパミルを使用して P-gp を標的にし、経口バイオアベイラビリティと癌を標的としたジンセノサイドの治療効果を向上させました。
高麗人参サポニンが発がんに対して治療効果を発揮するメカニズムはまだ不明です。研究では、さまざまなジンセノサイドが酸化ストレスを軽減し、第 II 相解毒酵素を活性化することで発がん物質によって引き起こされる DNA 損傷を軽減し、それによって細胞損傷を防ぐことができることが示されています。グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) は、発がん物質によって引き起こされる DNA 損傷を軽減するために必要な典型的な第 II 相酵素です 17。核赤血球 2 関連因子 2 (Nrf2) は、酸化還元恒常性を調節し、第 II 相酵素の発現と細胞保護抗酸化反応を活性化する重要な転写因子です 18。我々の研究では、同定されたジンセノサイドがB(a)P誘導性の細胞毒性とBPDE-DNA付加体形成の低減に及ぼす影響、また正常肺細胞におけるNrf2経路を調節することによる第II相酵素の誘導についても調べた。
B(a)P 誘発癌のマウス モデルの確立は、以前の研究と一致しています 5。図 1A は、B(a)P、水 (対照)、紅参抽出物 (CRG)、韓国紅参抽出物 A (KRGA)、および韓国紅により誘発されたマウス癌モデルの 20 週間の治療の実験計画を示しています。人参。エキスB（KRGB）と高麗紅参エキスC（KRGC）。20 週間の紅参処理後、マウスを CO2 窒息により屠殺しました。図 1B は、さまざまな種類の紅参で治療された動物の肉眼的肺腫瘍を示し、図 1C は腫瘍サンプルの代表的な光学顕微鏡写真を示します。図 1D に示すように、KRGB 処置動物の腫瘍量 (1.5 ± 0.35) は対照動物の腫瘍量 (0.82 ± 0.2、P < 0.05) よりも低かった。腫瘍負荷阻害の平均程度は45%でした。試験した他の紅参抽出物では、腫瘍量にそれほど大きな変化は見られませんでした (P > 0.05)。マウスモデルでは、20 週間の紅参処理中に、体重の変化 (データは示さず) や肝臓や腎臓への毒性など、明らかな副作用は観察されませんでした (図 1E、F)。
紅参抽出物は、A/J マウスの肺腫瘍の発生を治療します。(A) 実験計画。(B) マウスモデルにおける大きな肺腫瘍。腫瘍は矢印で示されています。a: 中国の紅参グループ。b: 高麗紅参のグループ A。c: 高麗紅参グループ B。 d: 高麗紅参グループ C。 d: 対照グループ。(C) 肺腫瘍を示す光学顕微鏡写真。倍率: 100。 b: 400。 (D) 紅参抽出物グループの腫瘍量。(E) 肝酵素 ALT の血漿レベル。(F) 腎臓酵素 Cr の血漿レベル。データは平均±標準偏差として表されます。*P<0.05。
この研究で特定された紅参抽出物は、超高性能液体クロマトグラフィー タンデム質量分析法 (UPLC-MS/MS) によって分析され、次のジンセノサイドが定量されました: Rg1、Re、Rc、Rb2、Rb3、Rb1、Rh1、Rd、Rg3、 Rh2、F1、Rk1、Rg5。分析物の測定に使用される UPLC および MS 条件は、以前のレポートで説明されています 19。4 種類の紅参抽出物の UPLC-MS/MS クロマトグラムを図 2A に示します。総ジンセノサイド含有量には有意な差があり、CRG の総ジンセノサイド含有量が最も高かった (590.27 ± 41.28 μmol/L) (図 2B)。個々のジンセノサイドを評価すると (図 2C)、KRGB は他のジンセノサイドと比較して最高レベルの G-Rg3 を示しました (G-Rg3s では 58.33 ± 3.81 μmol/L、G -Rg3r では 41.56 ± 2.88 μmol/L)。紅参タイプ (P < 0.001)。G-Rg3 は、炭素 20 のヒドロキシル基の位置が異なる一対の立体異性体 G-Rg3r および G-Rg3s として存在します (図 2D)。結果は、G-Rg3r または G-Rg3 が B(a)P 誘発癌マウス モデルにおいて重要な抗癌能を持っている可能性があることを示しています。
各種紅参抽出物中のジンセノサイドの含有量。(A) 4 つの紅参抽出物の UPLC-MS/MS クロマトグラム。(B) 示された抽出物中の総ジンセノサイド含有量の推定。(C) 標識抽出物中の個々のジンセノサイドの検出。(D) ジンセノサイド立体異性体 G-Rg3r および G-Rg3s の構造。データは、3回の測定の平均±標準偏差として表されます。***P <0.001。
UPLC-MS/MS 研究では、20 週間の治療後の腸サンプルと血液サンプル中のジンセノサイドの定量が必要でした。KRGB による処理では、血液中に 0.0063 ± 0.0005 μg/ml の Rg5 が存在するだけでした。残留ジンセノサイドは検出されず、経口バイオアベイラビリティーが低く、したがってこれらのジンセノサイドへの曝露が減少していることを示しています。
結腸腺癌細胞株 Caco-2 は、形態学的および生化学的にヒト腸上皮細胞と類似しており、腸上皮関門を通過する腸細胞輸送の評価におけるその有用性を示しています。この分析は以前の研究 20 に基づいています。図 3A、B、C、D、E、F は、Caco-2 単層モデルを使用した G-Rg3r および G-Rg3 の経細胞輸送の代表的な画像を示しています。Caco-2 単層を横切る基底外側から頂端側 (Pb-a) への G-Rg3r または G-Rg3 の経細胞輸送は、頂端から基底側へ (Pa-b) よりも有意に高かった。G-Rg3r の場合、平均 Pa-b 値は 0.38 ± 0.06 でしたが、50 μmol/L ベラパミルでの処理後は 0.73 ± 0.06 に増加し、100 μmol/L ベラパミルでの処理後は 1.14 ± 0.09 に増加しました (p < 0.01 および 0.001、それぞれ図2）。3A）。G-Rg3 の観察も同様のパターンに従い (図 3B)、その結果、ベラパミル処理により G-Rg3r および G-Rg3 の輸送が強化されることが示されました。ベラパミル処理により、平均 Pb-a、G-Rg3r、および G-Rg3s 流出比も大幅に減少しました (図 3C、D、E、F)。これは、ベラパミル処理により Caco-2 流出細胞のジンセノサイド含有量が減少することを示しています。。
Caco-2単層におけるG-Rg3の経細胞輸送とラット灌流アッセイにおける腸管吸収。(A) Caco-2 単層における G-Rg3r 基の Pa-b 値。(B) Caco-2 単層における G-Rg3s 基の Pa-b 値。(C) Caco-2 単層における G-Rg3r 基の Pb 値。(D) Caco-2 単層における G-Rg3s 基の Pb 値。(E) Caco-2 単層における G-Rg3r 基の収率比。(F) Caco-2 単層における G-Rg3 基の収率比。(G) ラットの灌流アッセイにおける G-Rg3r の腸吸収のパーセンテージ。(H) ラットの灌流アッセイにおける G-Rg3 の腸吸収のパーセンテージ。ベラパミルを添加しない場合の透過性と吸収性を比較しました。データは、5 回の独立した実験の平均 ± 標準偏差として表されます。*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001。
以前の研究 20 と一致して、ベラパミル治療後に腸での G-Rg3 吸収が増加するかどうかを決定するために、ラットの同所性腸灌流を実施しました。図３Ｇ、Ｈは、上記の期間中の癌モデルラットにおけるＧ−Ｒｇ３ｒおよびＧ−Ｒｇ３の腸吸収のパーセンテージを評価するための代表的な灌流アッセイを示す。約10%の弱いG-Rg3r取り込みの初期割合は、50μMベラパミルでの処理後は20%以上に増加し、100μMベラパミルでの処理後は25%以上に増加した。同様に、初期取り込み量が 10% だった G-Rg3 も、50 μM ベラパミルでの処理後には 20% 以上のピークを示し、100 μM ベラパミルでの処理後にはほぼ 30% のピークを示し、ベラパミルによる P-gp の阻害が効果を増強することを示唆しています。肺癌マウスモデルにおける腸管 G 吸収 Rg3。
上記の方法に従って、図 4A に示すように、B(a)P 誘発癌モデル マウスをランダムに 6 つのグループに分けました。対照群と比較して、G-Rg3 治療群では有意な体重減少や毒性の臨床徴候は観察されませんでした (データは示さず)。20 週間の治療後、各マウスの肺を採取しました。図４Ｂは、上記治療群のマウスの肉眼的肺腫瘍を示し、図４Ｃは、代表的な腫瘍の代表的な光学顕微鏡写真を示す。各グループの腫瘍量（図 4D）に関して、G-Rg3r および G-Rg3s で治療されたマウスの値はそれぞれ 0.75 ± 0.29 mm3 および 0.81 ± 0.30 mm3 であったのに対し、G-Rg3r および G-Rg3s で治療されたマウスの値は-Rg3s はそれぞれ 1.63 ±0.40 mm3 でした。対照マウス（p < 0.001）は、G-Rg3 治療によりマウスの腫瘍量が減少したことを示しています。ベラパミルの投与により、この減少はさらに促進されました。ベラパミル+ G-Rg3r マウスの値は 0.75 ± 0.29 mm3 から 0.33 ± 0.25 mm3 に減少し (p < 0.01)、ベラパミル + の値は 0.81 ± 0.30 mm3 から 0.29 ± 0.21 に減少しました。 G-Rg3s 処置マウスにおける mm3 (p < 0.05) は、ベラパミルが腫瘍形成に対する G-Rg3 の阻害効果を増強する可能性があることを示しています。腫瘍量は、対照群とベラパミル群、G-Rg3r 群と G-Rg3s 群、ベラパミル + G-Rg3r 群とベラパミル + G-Rg3s 群の間で有意差は示されませんでした。さらに、評価した治療に関連する重大な肝臓または腎臓の毒性はありませんでした (図 4E、F)。
示されたグループにおける G-Rg3 治療後の腫瘍量、血漿または腸内 G-Rg3r および G-Rg3 レベル。(A) 実験計画。(B) マウスモデルの肉眼的腫瘍。腫瘍は矢印で示されています。a：G-Rg3r。b：G-Rg3s。c: G-Rg3r とベラパミルの組み合わせ。d: G-Rg3 とベラパミルの組み合わせ。d: ベラパミル。e：コントロール。(C) 拡大した腫瘍の光学顕微鏡写真。答え: 100倍。b：400倍。(D) A/J マウスにおける腫瘍負荷に対する G-Rg3 + ベラパミル治療の効果。(E) 肝臓酵素 ALT の血漿レベル。(F) 腎臓酵素 Cr の血漿レベル。(G) 示されたグループの G-Rg3r または G-Rg3 の血漿レベル。(H) 示されたグループの腸内の G-Rg3r または G-Rg3s のレベル。データは、3回の測定の平均±標準偏差として表されます。*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001。
B(a)P 誘発癌モデル マウスの G-Rg3 レベルを、「方法」セクションに記載の方法に従って 20 週間の治療期間後に UPLC-MS/MS によって評価しました。図 4G および H は、それぞれ血漿および腸内 G-Rg3 レベルを示しています。血漿 G-Rg3r レベルは 0.44 ± 0.32 μmol/L であり、ベラパミルの併用投与により 1.17 ± 0.47 μmol/L に増加しましたが (p < 0.001)、腸内 G-Rg3r レベルは 0.53 ± 0.08 μg/L でした。ベラパミルと組み合わせると、g は 1.35 ± 0.13 μg/g に増加しました (p < 0.001)。G-Rg3 についても、結果は同様のパターンに従い、ベラパミル治療により A/J マウスにおける G-Rg3 の経口バイオアベイラビリティが増加したことが示されました。
細胞生存率アッセイを使用して、hEL 細胞に対する B(a)P および G-Rg3 の細胞毒性を評価しました。hEL 細胞において B(a)P によって誘導される細胞毒性を図 5A に示し、G-Rg3r および G-Rg3 の非毒性特性を図 5A および 5B に示します。G-Rg3の細胞保護効果を評価するために、B(a)Pを様々な濃度のG-Rg3rまたはG-Rg3とhEL細胞に同時投与した。図５Ｄに示すように、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭの濃度のＧ－Ｒｇ３ｒは、細胞生存率をそれぞれ５８．３％、７９．３％、および７７．３％に回復した。同様の結果が G-Rg3s グループでも見られます。G-Rg3 の濃度が 5 μM、10 μM、および 20 μM の場合、細胞生存率はそれぞれ 58.3%、72.7%、および 76.7% に回復しました (図 5E)。）。BPDE-DNA付加物の存在はELISAキットを使用して測定されました。我々の結果は、B(a)P治療群では対照群と比較してBPDE-DNA付加物レベルが増加したが、G-Rg3共治療と比較して、B(a)P群のBPDE-DNA付加物レベルが増加したことを示した。 B 治療グループでは、DNA 付加物レベルが大幅に減少しました。B(a)P 単独による処理の結果を図 5F に示します (G-Rg3r については 1.87 ± 0.33 対 3.77 ± 0.42、G-Rg3s については 1.93 ± 0.48 対 3.77 ± 0.42、p < 0.001)。
G-Rg3 および B(a)P で処理した hEL 細胞における細胞生存率および BPDE-DNA 付加体形成。(A) B(a)P で処理した hEL 細胞の生存率。(B) G-Rg3r で処理した hEL 細胞の生存率。(C) G-Rg3 で処理した hEL 細胞の生存率。(D) B(a)P および G-Rg3r で処理した hEL 細胞の生存率。(E) B(a)P および G-Rg3 で処理した hEL 細胞の生存率。(F) B(a)P および G-Rg3 で処理した hEL 細胞における BPDE-DNA 付加体のレベル。データは、3回の測定の平均±標準偏差として表されます。*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001。
GST 酵素発現は、10 μM B(a)P および 10 μM G-Rg3r または G-Rg3s での共処理後に検出されました。我々の結果は、B(a)P が GST 発現を抑制し (G-Rg3r グループで 59.7 ± 8.2%、G-Rg3s グループで 39 ± 4.5%)、B(a)P が G-Rg3r のいずれかと関連していることを示しました。 、または G-Rg3r で、または G-Rg3r で。G-Rg3s との同時処理により GST 発現が回復しました。GST 発現 (G-Rg3r グループで 103.7 ± 15.5%、G-Rg3s グループで 110 ± 11.1%、それぞれ p < 0.05 および p < 0.001、図 6A、B、および C)。GST 活性は、活性アッセイキットを使用して評価されました。我々の結果は、B(a)P 単独群と比較して併用治療群の GST 活性が高いことを示しました (G-Rg3r 群では 96.3 ± 6.6% 対 35.7 ± 7.8% 対 G-Rg3r 群では 92.3 ± 6.5) ）。G-Rg3s グループの % 対 35.7 ± 7.8%、p < 0.001、図 6D)。
B(a)P および G-Rg3 で処理した hEL 細胞における GST および Nrf2 の発現。(A) ウェスタンブロッティングによる GST 発現の検出。(B) B(a)P および G-Rg3r で処理した hEL 細胞における GST の定量的発現。(C) B(a)P および G-Rg3s で処理した hEL 細胞における GST の定量的発現。(D) B(a)P および G-Rg3 で処理した hEL 細胞における GST 活性。(E) ウェスタンブロッティングによる Nrf2 発現の検出。(F) B(a)P および G-Rg3r で処理した hEL 細胞における Nrf2 の定量的発現。(G) B(a)P および G-Rg3s で処理した hEL 細胞における Nrf2 の定量的発現。データは、3回の測定の平均±標準偏差として表されます。*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001。
B(a)P 誘発腫瘍形成の G-Rg3 媒介抑制に関与する経路を解明するために、Nrf2 発現をウェスタン ブロッティングによって評価しました。図６Ｅ、Ｆ、Ｇに示すように、対照群と比較して、Ｂ（ａ）Ｐ治療群ではＮｒｆ２レベルのみが減少した。ただし、B(a)P 治療グループと比較して、PG-Rg3 グループの B(a) Nrf2 レベルは増加しました (G-Rg3r では 106 ± 9.5%、G-Rg3r では 51.3 ± 6.8%、G-Rg3r では 117 ± 6.2%)。 G-Rg3r 対 G-Rg3s では 41 ± 9.8%、p < 0.01)。
我々は、特異的低分子干渉RNA（siRNA）を用いてNrf2発現を抑制することにより、Nrf2の予防的役割を確認した。Nrf2 ノックダウンはウエスタンブロッティングにより確認されました (図 7A、B)。図 7C、D に示すように、hEL 細胞を B(a)P および G-Rg3 で共処理すると、B(a)P での処理と比較して BPDE-DNA 付加体の数が減少しました (1.47 ± 0.21)。 ）G-Rg3r は 4.13 ± 0.49、G-Rg3s は 1.8 ± 0.32 および 4.1 ± 0.57、p < 0.01）でした。しかし、BPDE-DNA 形成に対する G-Rg3 の阻害効果は、Nrf2 ノックダウンによって消失しました。siNrf2 グループでは、B(a)P と G-Rg3 の共処理と B(a)P 単独処理の間で BPDE-DNA 付加体形成に有意差はありませんでした (G-Rg3r では 3.0 ± 0.21 対 3.56 ± 0.32 ）。G-Rg3r の場合対 G-Rg3s の場合は 3.6 対 ±0.45 対 4.0±0.37、p > 0.05)。
hEL細胞におけるBPDE-DNA付加物形成に対するNrf2ノックダウンの影響。(A) Nrf2 ノックダウンはウエスタンブロッティングにより確認されました。(B) Nrf2 バンド強度の定量化。(C) B(a)P および G-Rg3r で処理した hEL 細胞における BPDE-DNA 付加物レベルに対する Nrf2 ノックダウンの影響。(D) B(a)P および G-Rg3 で処理した hEL 細胞における BPDE-DNA 付加物レベルに対する Nrf2 ノックダウンの影響。データは、3回の測定の平均±標準偏差として表されます。*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001。
この研究では、B(a)P 誘発肺がんのマウスモデルに対するさまざまな紅参抽出物の予防効果を評価し、KRGB 治療により腫瘍量が大幅に減少しました。この高麗人参抽出物中に G-Rg3 が最も多く含まれていることを考慮すると、腫瘍形成の阻害におけるこのジンセノサイドの重要な役割が研究されています。G-Rg3r と G-Rg3 (G-Rg3 の 2 つのエピマー) は両方とも、B(a)P 誘発癌のマウス モデルにおける腫瘍量を大幅に減少させました。G-Rg3r および G-Rg3 は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し 21、腫瘍増殖を阻害し 22、細胞周期を停止し 23、血管新生に影響を与える 24 ことによって抗がん効果を発揮します。G-Rg3 は細胞転移を阻害することも示されており 25、G-Rg3 が化学療法や放射線療法の効果を増強する能力も実証されています 26,27。Poonらは、G-Rg3処理がB(a)P28の遺伝毒性効果を軽減できることを実証した。この研究は、環境の発がん性分子を標的にし、がんを予防する上での G-Rg3 の治療的可能性を実証しています。
ジンセノサイドには優れた予防効果があるにもかかわらず、経口での生物学的利用能が低いため、これらの分子の臨床使用には課題が生じています。ラットへのジンセノサイドの経口投与の薬物動態分析では、その生物学的利用能が依然として 5% 未満であることが示されました 29。これらの検査では、20週間の治療期間後、血中Rg5レベルのみが低下したことが示されました。バイオアベイラビリティーの低下の根本的なメカニズムはまだ解明されていませんが、P-gp はジンセノサイドの流出に関与していると考えられています。この研究は、P-gp ブロッカーであるベラパミルの投与により、G-Rg3r および G-Rg3s の経口バイオアベイラビリティが増加することを初めて実証しました。したがって、この発見は、G-Rg3r および G-Rg3s が P-gp の基質として作用し、その流出を調節することを示唆しています。
この研究は、肺癌のマウスモデルにおいて、ベラパミルとの併用治療により、G-Rg3の経口バイオアベイラビリティが増加することを実証しています。この発見は、P-gp 遮断時に G-Rg3 の腸内経細胞輸送が増加し、それによってその吸収が増加することによって裏付けられています。Caco2 細胞におけるアッセイでは、ベラパミル処理により G-Rg3r および G-Rg3s の流出が減少し、同時に膜透過性が向上することが示されました。Yangらによる研究。研究では、シクロスポリン A (別の P-gp ブロッカー) による治療により、ジンセノサイド Rh2 の生物学的利用能がベースライン値の 1%20 から 30% 以上に増加することが示されています。ジンセノサイド化合物 K および Rg1 も同様の結果を示しました 30,31。ベラパミルとシクロスポリン A を同時投与すると、Caco-2 細胞における化合物 K の流出は 26.6 から 3 未満に大幅に減少し、その細胞内レベルは 40 倍増加しました 30。Meng et al. 31 が示したように、ベラパミルの存在下では、ラット肺上皮細胞の Rg1 レベルが増加し、ジンセノサイド流出における P-gp の役割が示唆されました。しかし、Liangらによって示されたように、ベラパミルは一部のジンセノサイド（Rg1、F1、Rh1、Reなど）の流出に対して同様の効果を示さず、ジンセノサイドがP-gp基質の影響を受けないことを示している。３２．この観察は、他のトランスポーターおよび代替ジンセノサイド構造の関与に関連している可能性があります。
G-Rg3 のがん予防効果のメカニズムは不明です。これまでの研究では、G-Rg3 が酸化ストレスと炎症を軽減することで DNA 損傷とアポトーシスを防ぐことが示されており 16,33、これが B(a)P 誘発腫瘍形成を防ぐ根本的なメカニズムである可能性があります。いくつかの報告では、B(a)P によって誘発される遺伝毒性は、第 II 相酵素を調節して BPDE-DNA を形成することによって軽減できることが示されています 34。GST は、GSH の BPDE への結合を促進することで BPDE-DNA 付加体形成を阻害し、それによって B(a)P35 によって誘発される DNA 損傷を軽減する典型的な第 II 相酵素です。我々の結果は、G-Rg3処理がhEL細胞におけるB(a)P誘導性の細胞毒性とBPDE-DNA付加体形成を減少させ、インビトロでGSTの発現と活性を回復することを示している。しかし、Nrf2 が存在しない場合にはこれらの効果は見られず、G-Rg3 が Nrf2 経路を通じて細胞保護効果を誘導することが示唆されました。Nrf2 は、生体異物の除去を促進する第 II 相解毒酵素の主要な転写因子です 36。Nrf2 経路の活性化は細胞保護を誘導し、組織損傷を軽減します 37。さらに、いくつかの報告は、発癌における腫瘍抑制因子としての Nrf2 の役割を支持しています 38。我々の研究は、G-Rg3によるNrf2経路の誘導が、第II相酵素を活性化することによってB(a)P解毒を引き起こし、それによって腫瘍形成プロセスを阻害することにより、B(a)P誘導性遺伝毒性において重要な調節的役割を果たしているということを示している。
私たちの研究は、ジンセノサイド G-Rg3 の重要な関与を通じて、マウスの B(a)P 誘発性肺がんを予防する紅参の可能性を明らかにしています。この分子は経口での生物学的利用能が低いため、臨床応用が妨げられています。しかし、この研究は、G-Rg3 が P-gp の基質であり、P-gp 阻害剤の投与により in vitro および in vivo で G-Rg3 の生物学的利用能が増加することを初めて示しました。G-Rg3 は、Nrf2 経路を調節することによって B(a)P 誘発性の細胞毒性を軽減します。これは、G-Rg3 の予防機能の潜在的なメカニズムである可能性があります。私たちの研究は、肺がんの予防と治療におけるジンセノサイド G-Rg3 の可能性を確認しています。
生後 6 週齢の雌 A/J マウス (20 ± 1 g) および生後 7 週齢の雄 Wistar ラット (250 ± 20 g) を、The Jackson Laboratory (米国バーハーバー) および武漢動物研究所から入手しました。大学（中国、武漢）。中国型培養収集センター (中国、武漢) から、Caco-2 細胞と hEL 細胞が提供されました。Sigma-Aldrich (セントルイス、米国) は、B(a)P とトリカプリンの供給源です。精製ジンセノサイド G-Rg3r および G-Rg3s、ジメチルスルホキシド (DMSO)、CellTiter-96 増殖アッセイ キット (MTS)、ベラパミル、最小必須培地 (MEM)、およびウシ胎児血清 (FBS) は Chengdu Must Bio-Technology から購入しました。 。株式会社。（中国、成都）。QIAamp DNA ミニキットおよび BPDE-DNA 付加物 ELISA キットは、Qiagen (米国カリフォルニア州スタンフォード) および Cell Biolabs (米国カリフォルニア州サンディエゴ) から購入しました。GST 活性アッセイ キットおよび総タンパク質アッセイ キット (標準 BCA 法) は、Solarbio (北京、中国) から購入しました。すべての紅参抽出物は、Mingyu Laboratory 7 に保管されています。香港バプテスト大学 (中国、香港) および韓国がんセンター (韓国、ソウル) は、CRG 抽出物およびさまざまな韓国起源のさまざまな紅参抽出物 (KRGA、KRGB を含む) の商業供給源です。およびKRGC）。紅参は6年根の新鮮な高麗人参の根から作られています。紅参抽出物は、高麗人参を水で３回洗浄した後、水抽出物を濃縮し、最後に低温で乾燥して高麗人参抽出粉末を得ることで得られる。抗体 (抗 Nrf2、抗 GST、および β-アクチン)、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン G (IgG)、トランスフェクション試薬、コントロール siRNA、および Nrf2 siRNA は、Santa Cruz Biotechnology (カリフォルニア州サンタクルーズ) から購入しました。 。）、米国）。
Caco2 細胞と hEL 細胞を、10% FBS を含む MEM を含む 100 mm2 の細胞培養皿で、37 °C、5% CO2 の加湿雰囲気下で培養しました。処理条件の効果を調べるために、hEL 細胞を MEM 中でさまざまな濃度の B(a)P および G-Rg3 とともに 48 時間インキュベートしました。細胞をさらに分析または収集して、無細胞抽出物を調製することができます。
すべての実験は、華中科技大学同済医科大学実験動物倫理委員会によって承認されました（承認番号2019、登録番号4587TH）。すべての実験は関連するガイドラインおよび規制に従って行われ、研究は動物研究: In Vivo Experiments の報告 (ARRIVE) ガイドラインに従って行われました。８週齢のＡ／Ｊマウスに、まずトリカプリン溶液中のＢ（ａ）Ｐ（１００ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ）を腹腔内注射した。1週間後、マウスを対照群と異なる治療群にランダムに分け、各群15匹ずつ、1日1回強制経口摂取させた。20 週間の治療後、動物を CO2 窒息により屠殺しました。肺を採取し、24時間固定した。表在性腫瘍の数と個々の腫瘍のサイズは、解剖顕微鏡下で各肺について定量化されました。腫瘍体積推定値 (V) は、次の式を使用して計算されました: V (mm3) = 4/3πr3、ここで、r は腫瘍直径です。マウスの肺のすべての腫瘍体積の正味合計が総腫瘍体積を表し、各グループの平均総腫瘍体積が腫瘍量を表しました。全血および腸サンプルを収集し、UPLC-MS/MS 測定のために -80°C で保存しました。血清を収集し、自動化学分析装置を使用してアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) および血清クレアチニン (Cr) レベルを分析し、肝臓および腎臓の機能を評価しました。
収集したサンプルを冷蔵保管庫から取り出し、解凍し、重量を量り、上記のようにチューブに入れた。これに、０．８ｍｌのメタノール溶液中の０．５μＭのフロリジン（内部標準）を添加した。次いで、組織をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅａｒｏｒを使用してホモジナイズし、続いてホモジネートを１．５ｍｌの微量遠心管に移した。混合物を１５５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み 1.0 ml を除去した後、窒素で乾燥します。回収には 200 マイクロリットルのメタノールを使用しました。血液は 1 つのラインで収集および処理され、すべての測定の基準として使用されます。
ベラパミルの添加による G-Rg3 輸送の潜在的な増強を評価するために、24 ウェル Transwell プレートにウェルあたり 1.0 × 105 Caco-2 細胞を播種しました。3週間の培養後、細胞をHBSSで洗浄し、37℃でプレインキュベートしました。400 μL の 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r、G-Rg3s、または 50 または 100 μM ベラパミルとの混合物) を単層の基底側または頂端側に注入し、600 μL の HBSS 溶液をもう一方の側に添加しました。側。指定された時間 (0、15、30、45、60、90、120 分) で 100 μl の培地を収集し、100 μl の HBSS を加えてこの容量を構成します。UPLC-MS/MS による検出まで、サンプルは -4 °C で保存されました。式 Papp = dQ/(dT × A × C0) は、見かけの一方向の心尖端および側底側透過性、およびその逆の定量化に使用されます (それぞれ Pa-b および Pb-a)。dQ/dT は濃度変化、A (0.6 cm2) は単層の表面積、C0 は初期ドナー濃度です。流出比は Pb-a/Pa-b として計算され、治験薬の流出速度を表します。
雄の Wistar ラットを 24 時間絶食させ、水のみを摂取させ、3.5% ペントバルビタール溶液の静脈内注射で麻酔をかけました。挿管されたシリコンチューブは、十二指腸の端が入口となり、回腸の端が出口となります。蠕動ポンプを使用して、等張 HBSS 中の 10 μM G-Rg3r または G-Rg3s を 0.1 ml/分の流量で注入口にポンプします。ベラパミルの効果は、50μMまたは100μMの化合物を10μMのG-Rg3rまたはG-Rg3sに添加することによって評価した。UPLC-MS/MS は、灌流開始後 60、90、120、および 150 分の時点で収集された灌流抽出物に対して実行されました。吸収率は、吸収率 % = (1 – Cout/Cin) × 100% という式で定量化されます。出口および入口における G-Rg3 の濃度はそれぞれ Cout および Cin で表されます。
hEL 細胞を 96 ウェルプレートにウェルあたり 1 × 104 細胞の密度で播種し、DMSO に溶解した B(a)P (0、1、5、10、20、30、40 μM) または G-Rg3 で処理しました。 。次いで、薬剤を培地で48時間かけてさまざまな濃度（0、1、2、5、10、20μM）に希釈しました。市販の MTS アッセイキットを使用して、細胞を標準プロトコルに供し、マイクロプレートリーダーを使用して 490 nm で測定しました。B(a)P (10 μM) および G-Rg3 (0、1、5、10、20 μM) で共処理したグループの細胞生存レベルを上記の方法に従って評価し、未処理グループと比較しました。
hEL 細胞を 6 ウェルプレートに 1 × 105 細胞/ウェルの密度で播種し、10 μM G-Rg3 の存在下または非存在下で 10 μMB(a)P で処理しました。48 時間の処理後、QIAamp DNA Mini Kit を製造元のプロトコールに従って使用して、hEL 細胞から DNA を抽出しました。BPDE-DNA付加物の形成は、BPDE-DNA付加物ELISAキットを使用して検出した。BPDE-DNA付加物の相対レベルは、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定することにより測定した。
hEL 細胞を 96 ウェルプレートにウェルあたり 1 × 104 細胞の密度で播種し、10 μM G-Rg3 の非存在下または存在下で 10 μMB(a)P で 48 時間処理しました。ＧＳＴ活性は、市販のＧＳＴ活性アッセイキットを製造業者のプロトコールに従って使用して測定した。相対的な GST 活性化は、マイクロプレート リーダーを使用して 450 nm での吸光度によって測定されました。
hEL細胞を氷冷PBSで洗浄し、次いでプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降アッセイ緩衝液を使用して溶解した。総タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質を定量した後、各サンプル中のタンパク質 30 μg を 12% SDS-PAGE で分離し、電気泳動によって PVDF 膜に転写しました。膜を5%スキムミルクでブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートした後、増強された化学発光試薬を添加して結合シグナルを視覚化しました。各タンパク質バンドの強度は、ImageJ ソフトウェアを使用して定量化されました。
GraphPad Prism 7.0 ソフトウェアを使用してすべてのデータを分析し、平均 ± 標準偏差として表しました。治療群間の変動は、スチューデントの t 検定または一元配置分散分析を使用して評価され、P 値 <0.05 は統計的有意性を示します。
この研究中に取得または分析されたすべてのデータは、この公開された論文および補足情報ファイルに含まれています。
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投稿日時: 2023 年 9 月 17 日