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홍삼은 수백년 동안 전통 아시아 의학에서 사용되어 왔습니다.본 연구에서는 서로 다른 지역에서 재배된 4종 홍삼(중국홍삼, 고려홍삼A, 고려홍삼B, 고려홍삼C)의 발암물질 유발 폐암 형성 및 성장을 억제하는 능력을 평가하였다. 종양.A/J 생쥐를 대상으로 벤조(a)피렌(B(a)P) 시험을 실시한 결과, 고려홍삼 B가 4가지 홍삼 품종 중 종양 부담 감소에 가장 효과적인 것으로 나타났습니다.또한, 4가지 홍삼추출물에 함유된 다양한 진세노사이드(Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 및 Rg5)의 함량을 분석한 결과 고려홍삼B가 진세노사이드 Rg3(G-Rg3)의 가장 높은 수준은 G-Rg3가 치료 효능에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.이 연구는 G-Rg3가 상대적으로 낮은 생체 이용률을 가지고 있음을 보여줍니다.그러나 G-Rg3를 P-gp 억제제인 베라파밀과 병용투여한 경우 쥐 모델에서 G-Rg3의 Caco-2 세포로의 유출이 감소하고 G-Rg3의 장내 흡수율이 증가하였으며 G-Rg3 증가했습니다.Caco-2 세포에서는 Rg3의 유출이 감소하고 Rg3 농도 수준이 감소합니다.G-Rg3는 장과 혈장에서 증가하고, B(a)P로 유발된 종양 형성의 쥐 모델에서 종양을 예방하는 능력도 향상되었습니다.우리는 또한 G-Rg3가 인간 폐 세포에서 B(a)P에 의해 유발된 세포 독성과 DNA 부가물 형성을 감소시키고 잠재적인 작용 메커니즘과 관련이 있을 수 있는 Nrf2 경로를 통해 2단계 효소의 발현과 활성을 회복한다는 것을 발견했습니다. G 억제 -Rg3..폐 종양의 발생에 대해.우리의 연구는 마우스 모델에서 폐 종양을 표적으로 삼는 데 있어 G-Rg3의 잠재적으로 중요한 역할을 보여줍니다.이 진세노사이드의 경구 생체 이용률은 P-당단백질을 표적으로 하여 분자가 항암 효과를 발휘할 수 있도록 함으로써 향상됩니다.
가장 흔한 유형의 폐암은 비소세포폐암(NSCLC)으로, 이는 중국과 북미에서 암 사망의 주요 원인 중 하나입니다1,2.비소세포폐암 발병 위험을 높이는 주요 요인은 흡연이다.담배 연기에는 벤조(a)피렌(B(a)P), 니트로사민, 라돈 붕괴로 인한 방사성 동위원소 등 60종 이상의 발암 물질이 포함되어 있습니다.3 다환 방향족 탄화수소 B(a)P는 담배 독성의 주요 원인입니다. 연기.B(a)P에 노출되면 시토크롬 P450은 이를 B(a)P-7,8-디하이드로디올-9,10-에폭사이드(BPDE)로 전환하고, 이는 DNA와 반응하여 BPDE-DNA 부가물 4를 형성합니다. 부가물은 인간 폐 종양과 유사한 종양 단계 및 조직병리학을 가진 마우스에서 폐 종양 형성을 유도합니다5.이러한 특징은 B(a)P 유발 폐암 모델을 가능한 항암 특성을 가진 화합물을 평가하는 데 적합한 시스템으로 만듭니다.
고위험군, 특히 흡연자에서 폐암 발병을 예방할 수 있는 한 가지 가능한 전략은 상피내 종양 병변의 발병을 억제하여 악성 종양으로의 진행을 예방하는 화학적 예방제를 사용하는 것입니다.동물 연구에 따르면 다양한 화학예방제가 효과적이라는 것이 밝혀졌습니다6.우리의 이전 보고서7에서는 홍삼이 폐암에 대한 좋은 예방 효과를 강조했습니다.이 허브는 생명과 건강을 연장하기 위해 아시아 전통 의학에서 수세기 동안 사용되어 왔으며 항종양 효과가 있는 것으로 기록되었습니다8.
인삼의 활성인자인 진세노사이드(ginsenoside)는 인삼 추출물의 품질을 평가하는 복합지표로 사용됩니다.조인삼 추출물의 정량 분석에는 일반적으로 RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 및 Rc9,10을 포함한 여러 가지 진세노사이드가 사용됩니다.진세노사이드는 경구 생체 이용률이 매우 낮기 때문에 임상적으로 거의 사용되지 않습니다11.이러한 낮은 생체이용률의 메커니즘은 명확하지 않지만, P-당단백질(P-gp)12에 의한 진세노사이드 유출이 원인일 수 있습니다.P-gp는 ATP 가수분해 에너지를 사용하여 세포내 물질을 외부 환경으로 방출하는 ATP 결합 카세트 수송체 슈퍼패밀리에서 가장 중요한 유출 수송체 중 하나입니다.P-gp 수송체는 일반적으로 장, 신장, 간 및 혈액뇌관문에 널리 분포되어 있습니다13.P-gp는 장내 흡수에 중요한 역할을 하며, P-gp를 억제하면 일부 항암제의 경구 흡수와 가용성이 증가합니다12,14.이전에 문헌에서 사용된 억제제의 예로는 베라파밀과 사이클로스포린 A15가 있습니다.이 연구에는 B(a)P 유발 폐암 연구용 마우스 시스템을 구축하여 중국과 한국의 다양한 홍삼 추출물이 악성 종양에 영향을 미치는 능력을 평가하는 작업이 포함됩니다.발암에 영향을 미칠 수 있는 특정 진세노사이드를 확인하기 위해 추출물을 개별적으로 분석했습니다.그런 다음 베라파밀은 P-gp를 표적으로 삼아 암 표적 진세노사이드의 경구 생체 이용률과 치료 효능을 향상시키는 데 사용되었습니다.
인삼 사포닌이 발암에 치료 효과를 미치는 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다.연구에 따르면 다양한 진세노사이드가 산화 스트레스를 줄이고 2단계 해독 효소를 활성화하여 세포 손상을 예방함으로써 발암 물질로 인한 DNA 손상을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다.글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)는 발암 물질로 인한 DNA 손상을 줄이는 데 필요한 전형적인 2단계 효소입니다17.핵 적혈구계 2 관련 인자 2(Nrf2)는 산화환원 항상성을 조절하고 2단계 효소의 발현과 세포 보호 항산화 반응을 활성화하는 중요한 전사 인자입니다.우리 연구에서는 또한 확인된 진세노사이드가 B(a)P에 의해 유발된 세포 독성 및 BPDE-DNA 부가물 형성을 감소시키고 정상 폐 세포에서 Nrf2 경로를 조절하여 2단계 효소를 유도하는 데 미치는 영향을 조사했습니다.
B(a)P 유발 암의 마우스 모델 확립은 이전 연구와 일치합니다5.그림 1A는 B(a)P, 물(대조군), 중국홍삼추출물(CRG), 고려홍삼추출물A(KRGA) 및 고려홍삼으로 유도된 마우스 암 모델의 20주 치료 실험 설계를 보여줍니다. 인삼.B추출물(KRGB)과 고려홍삼추출물C(KRGC).홍삼 처리 20주 후, 마우스를 CO2 질식으로 희생시켰다.그림 1B는 다양한 종류의 홍삼을 처리한 동물의 육안 폐종양을 보여주고, 그림 1C는 종양 샘플의 대표적인 광학 현미경 사진을 보여줍니다.그림 1D에 표시된 대로 KRGB 처리 동물(1.5 ± 0.35)의 종양 부담은 대조군 동물(0.82 ± 0.2, P < 0.05)보다 낮았습니다.평균 종양 부하 억제 정도는 45%였습니다.테스트한 다른 홍삼 추출물은 종양 부담에 있어서 이러한 유의미한 변화를 나타내지 않았습니다(P > 0.05).홍삼 치료 20주 동안 마우스 모델에서 체중 변화 없음(데이터 표시 안 함), 간 또는 신장 독성 없음(그림 1E,F)을 포함하여 뚜렷한 부작용이 관찰되지 않았습니다.
홍삼 추출물은 A/J 쥐의 폐종양 발달을 치료합니다.(A) 실험 설계.(B) 마우스 모델의 큰 폐 종양.종양은 화살표로 표시됩니다.A: 중국홍삼그룹입니다.b: 고려홍삼 A군.c: 고려홍삼군 B. d: 고려홍삼군 C. d: 대조군.(C) 폐 종양을 보여주는 밝은 현미경 사진.배율: 100. b: 400. (D) 홍삼 추출물 그룹의 종양 부하.(E) 간 효소 ALT의 혈장 수준.(F) 신장 효소 Cr의 혈장 수준.데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.*P<0.05.
본 연구에서 동정된 홍삼추출물을 초고성능액체크로마토그래피탠덤질량분석기(UPLC-MS/MS)로 분석하여 Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 및 Rg5.분석물질을 측정하는 데 사용된 UPLC 및 MS 조건은 이전 보고서19에 설명되어 있습니다.4가지 홍삼 추출물의 UPLC-MS/MS 크로마토그램은 그림 2A에 나와 있습니다.총 진세노사이드 함량에는 상당한 차이가 있었으며, 총 진세노사이드 함량은 CRG(590.27 ± 41.28 μmol/L)에서 가장 높았습니다(그림 2B).개별 진세노사이드를 평가할 때(그림 2C), KRGB는 다른 진세노사이드와 비교하여 가장 높은 수준의 G-Rg3를 나타냈습니다(G-Rg3s의 경우 58.33 ± 3.81 μmol/L, G-Rg3r의 경우 41.56 ± 2.88 μmol/L).L).홍삼 종류(P<0.001).G-Rg3는 탄소 20의 수산기 위치가 다른 입체 이성질체 G-Rg3r 및 G-Rg3s 쌍으로 나타납니다(그림 2D).결과는 G-Rg3r 또는 G-Rg3가 B(a)P 유발 암 마우스 모델에서 중요한 항암 잠재력을 가질 수 있음을 나타냅니다.
각종 홍삼추출물에 함유된 진세노사이드 함량.(A) 4종 홍삼추출물의 UPLC-MS/MS 크로마토그램.(B) 표시된 추출물의 총 진세노사이드 함량 추정.(C) 표지된 추출물에서 개별 진세노사이드의 검출.(D) 진세노사이드 입체이성질체 G-Rg3r 및 G-Rg3s의 구조.데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.***P<0.001.
UPLC-MS/MS 연구에서는 치료 20주 후 장 및 혈액 샘플에서 진세노사이드의 정량화가 필요했습니다.KRGB로 치료한 결과 혈액에는 Rg5가 0.0063 ± 0.0005 μg/ml만 존재하는 것으로 나타났습니다.남은 진세노사이드는 검출되지 않았는데, 이는 경구 생체 이용률이 낮고 따라서 이러한 진세노사이드에 대한 노출이 감소했음을 나타냅니다.
결장 선암종 세포주 Caco-2는 형태학적으로나 생화학적으로 인간 장 상피 세포와 유사하여 장 상피 장벽을 통과하는 장세포 수송을 평가하는 데 유용함을 보여줍니다.이 분석은 이전 연구 20를 기반으로 했습니다.그림 3A, B, C, D, E, F는 Caco-2 단층 모델을 사용하여 G-Rg3r 및 G-Rg3의 세포간 수송에 대한 대표적인 이미지를 보여줍니다.기저측면에서 기저측면(Pb-a)으로 Caco-2 단층을 가로지르는 G-Rg3r 또는 G-Rg3의 세포간 수송은 기저측면에서 기저측면(Pa-b)으로의 수송보다 상당히 높았습니다.G-Rg3r의 경우 평균 Pa-b 값은 0.38 ± 0.06이었으며, 이는 50 μmol/L 베라파밀 처리 후 0.73 ± 0.06, 100 μmol/L 베라파밀 처리 후 1.14 ± 0.09로 증가했습니다(p < 0.01 및 0.001, 각각 그림 2).3A).G-Rg3에 대한 관찰은 유사한 패턴을 따랐으며(그림 3B), 결과는 베라파밀 치료가 G-Rg3r 및 G-Rg3의 수송을 향상시키는 것으로 나타났습니다.베라파밀 처리는 또한 평균 Pb-a, G-Rg3r 및 G-Rg3s 유출 비율(그림 3C,D,E,F)의 상당한 감소를 가져왔으며, 이는 베라파밀 처리가 Caco-2 유출 세포에서 진세노사이드 함량을 감소시킨다는 것을 나타냅니다..
Caco-2 단층에서 G-Rg3의 세포 간 수송 및 쥐 관류 분석에서의 장 흡수.(A) Caco-2 단층의 G-Rg3r 그룹의 Pa-b 값.(B) Caco-2 단층의 G-Rg3s 그룹의 Pa-b 값.(C) Caco-2 단층의 G-Rg3r 그룹의 Pb 값.(D) Caco-2 단층의 G-Rg3s 그룹의 Pb 값.(E) Caco-2 단층의 G-Rg3r 그룹의 수율 비율.(F) Caco-2 단층의 G-Rg3 그룹의 수율 비율.(G) 쥐의 관류 분석에서 G-Rg3r의 장 흡수율.(H) 쥐의 관류 분석에서 G-Rg3의 장 흡수율.베라파밀을 첨가하지 않은 상태에서 투과도와 흡수도를 비교하였습니다.데이터는 5번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
이전 연구와 일치하여 베라파밀 치료 후 장의 G-Rg3 흡수가 증가하는지 여부를 확인하기 위해 쥐의 정위 장 관류를 수행했습니다.그림 3G, H는 위 기간 동안 암 모델 쥐에서 G-Rg3r 및 G-Rg3의 장 흡수 비율을 평가하기 위한 대표적인 관류 분석을 보여줍니다.약 10%의 약한 G-Rg3r 흡수의 초기 비율은 50μM 베라파밀 치료 후 20% 이상으로 증가했고, 100μM 베라파밀 치료 후 25% 이상으로 증가했습니다.마찬가지로 초기 흡수율이 10%였던 G-Rg3도 50μM 베라파밀 처리 후 20% 이상, 100μM 베라파밀 처리 후 거의 30%의 피크를 보여 베라파밀에 의한 P-gp 억제가 향상됨을 시사합니다. 폐암 마우스 모델의 장내 G 흡수 Rg3.
상기 방법에 따라, B(a)P 유발 암 모델 마우스를 도 4A에 도시된 바와 같이 무작위로 6개 그룹으로 나누었다.대조군과 비교하여 G-Rg3 치료군에서는 유의미한 체중 감소나 독성의 임상 징후가 관찰되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).20주간의 치료 후, 각 마우스의 폐를 수집했습니다.그림 4B는 위 치료 그룹의 마우스에서 육안으로 볼 수 있는 폐 종양을 보여주고, 그림 4C는 대표적인 종양의 대표적인 광학 현미경 사진을 보여줍니다.각 그룹의 종양 부담(그림 4D)과 관련하여 G-Rg3r 및 G-Rg3s를 처리한 마우스의 값은 각각 0.75 ± 0.29 mm3 및 0.81 ± 0.30 mm3인 반면, G-Rg3r 및 G-Rg3s를 처리한 마우스의 값은 각각 0.75 ± 0.30 mm3입니다. -Rg3s의 경우 각각 1.63 ±0.40mm3입니다.대조군 마우스(p<0.001)는 G-Rg3 치료가 마우스의 종양 부담을 감소시켰음을 나타냅니다.베라파밀 투여로 이러한 감소가 더욱 강화되었습니다. 베라파밀+ G-Rg3r 마우스의 값은 0.75 ± 0.29 mm3에서 0.33 ± 0.25 mm3으로 감소했으며(p < 0.01), 베라파밀+ 값은 0.81 ± 0.30 mm3에서 0.29 ± 0.21로 감소했습니다. G.-Rg3s 처리 생쥐의 mm3(p < 0.05)는 베라파밀이 종양 형성에 대한 G-Rg3의 억제 효과를 향상시킬 수 있음을 나타냅니다.종양 부담은 대조군과 베라파밀군, G-Rg3r군과 G-Rg3s군, 베라파밀+G-Rg3r군과 베라파밀+G-Rg3s군 사이에 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다.더욱이 평가된 치료법과 관련된 심각한 간 또는 신장 독성은 없었습니다(그림4E,F).
표시된 그룹의 G-Rg3 치료 후 종양 부담 및 혈장 또는 장내 G-Rg3r 및 G-Rg3 수준.(A) 실험 설계.(B) 마우스 모델의 거시적 종양.종양은 화살표로 표시됩니다.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: 베라파밀과 조합된 G-Rg3r.d: 베라파밀과 조합된 G-Rg3.d: 베라파밀.전자: 통제.(C) 확대된 종양의 광학 현미경 사진.답: 100배.b: 400X.(D) A/J 마우스의 종양 부담에 대한 G-Rg3 + 베라파밀 치료의 효과.(E) 간 효소 ALT의 혈장 수준.(F) 신장 효소 Cr의 혈장 수준.(G) 표시된 그룹의 G-Rg3r 또는 G-Rg3의 혈장 수준.(H) 표시된 그룹의 장 내 G-Rg3r 또는 G-Rg3s 수준.데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
B(a)P 유발 암 모델 마우스의 G-Rg3 수준은 방법 섹션에 설명된 방법에 따라 20주 치료 기간 후에 UPLC-MS/MS로 평가되었습니다.그림 4G와 H는 각각 혈장 및 장내 G-Rg3 수준을 보여줍니다.혈장 G-Rg3r 수준은 0.44 ± 0.32 μmol/L였으며 베라파밀 병용 투여로 1.17 ± 0.47 μmol/L로 증가한 반면(p < 0.001), 장내 G-Rg3r 수준은 0.53 ± 0.08 μg/L였습니다.베라파밀과 결합하면 g는 1.35 ± 0.13 μg/g으로 증가했습니다(p < 0.001).G-Rg3의 경우 결과는 유사한 패턴을 따랐으며, 이는 베라파밀 치료가 A/J 마우스에서 G-Rg3의 경구 생체 이용률을 증가시켰음을 나타냅니다.
hEL 세포에 대한 B(a)P 및 G-Rg3의 세포독성을 평가하기 위해 세포 생존율 분석을 사용했습니다.hEL 세포에서 B(a)P에 의해 유발된 세포독성은 그림 5A에 표시되어 있으며, G-Rg3r 및 G-Rg3의 무독성 특성은 그림 5A 및 5B에 표시되어 있습니다.5B, C. G-Rg3의 세포 보호 효과를 평가하기 위해 B(a)P를 다양한 농도의 G-Rg3r 또는 G-Rg3와 함께 hEL 세포에 공동 투여했습니다.도 5D에 도시된 바와 같이, 5 μM, 10 μM 및 20 μM 농도의 G-Rg3r은 세포 생존율을 각각 58.3%, 79.3% 및 77.3%로 복원했습니다.G-Rg3s 그룹에서도 비슷한 결과를 볼 수 있습니다.G-Rg3s의 농도가 5 μM, 10 μM 및 20 μM일 때 세포 생존율은 각각 58.3%, 72.7% 및 76.7%로 회복되었습니다(그림 5E).).BPDE-DNA 부가물의 존재는 ELISA 키트를 사용하여 측정되었습니다.우리의 결과는 대조군과 비교하여 B(a)P 처리군에서 BPDE-DNA 부가물 수준이 증가한 것으로 나타났으나, G-Rg3 동시 처리와 비교하여 B(a)P 그룹의 BPDE-DNA 부가물 수준이 나타났습니다. B 처리군에서는 DNA 부가물 수준이 크게 감소했습니다.B(a)P 단독 처리 결과는 그림 5F에 나와 있습니다(G-Rg3r의 경우 1.87 ± 0.33 대 3.77 ± 0.42, G-Rg3s의 경우 1.93 ± 0.48 대 3.77 ± 0.42, p < 0.001).
G-Rg3 및 B(a)P로 처리된 hEL 세포의 세포 생존력 및 BPDE-DNA 부가물 형성.(A) B(a)P로 처리된 hEL 세포의 생존 가능성.(B) G-Rg3r로 처리된 hEL 세포의 생존 가능성.(C) G-Rg3으로 처리된 hEL 세포의 생존 가능성.(D) B(a)P 및 G-Rg3r로 처리된 hEL 세포의 생존 가능성.(E) B(a)P 및 G-Rg3으로 처리된 hEL 세포의 생존 가능성.(F) B(a)P 및 G-Rg3으로 처리된 hEL 세포에서 BPDE-DNA 부가물의 수준.데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
10 μM B(a)P와 10 μM G-Rg3r 또는 G-Rg3s를 함께 처리한 후 GST 효소 발현이 검출되었습니다.우리의 결과는 B(a)P가 GST 발현을 억제하고(G-Rg3r 그룹에서 59.7 ± 8.2%, G-Rg3s 그룹에서 39 ± 4.5%) B(a)P가 G-Rg3r과 연관되어 있음을 보여주었습니다. , 또는 G-Rg3r 또는 G-Rg3r을 사용합니다.G-Rg3s와의 공동 치료로 GST 발현이 회복되었습니다.GST 발현(G-Rg3r 그룹에서 103.7 ± 15.5%, G-Rg3s 그룹에서 110 ± 11.1%, 각각 p < 0.05 및 p < 0.001, 그림 6A, B 및 C).GST 활성은 활성 분석 키트를 사용하여 평가되었습니다.우리의 결과는 병용 치료군이 B(a)P 단독군에 비해 더 높은 GST 활성을 갖는 것으로 나타났습니다(96.3 ± 6.6% 대 G-Rg3r 군의 35.7 ± 7.8% 대 G-Rg3r 군의 92.3 ± 6.5%). ).% 대 G-Rg3s 그룹의 35.7 ± 7.8%, p < 0.001, 그림 6D).
B(a)P 및 G-Rg3로 처리된 hEL 세포에서 GST 및 Nrf2의 발현.(A) 웨스턴 블롯팅에 의한 GST 발현 검출.(B) B(a)P 및 G-Rg3r로 처리된 hEL 세포에서 GST의 정량적 발현.(C) B(a)P 및 G-Rg3s로 처리된 hEL 세포에서 GST의 정량적 발현.(D) B(a)P 및 G-Rg3으로 처리된 hEL 세포에서의 GST 활성.(E) 웨스턴 블롯팅에 의한 Nrf2 발현의 검출.(F) B(a)P 및 G-Rg3r로 처리된 hEL 세포에서 Nrf2의 정량적 발현.(G) B(a)P 및 G-Rg3s로 처리된 hEL 세포에서 Nrf2의 정량적 발현.데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
B(a)P에 의해 유발된 종양 발생의 G-Rg3 매개 억제에 관여하는 경로를 밝히기 위해 Nrf2 발현을 Western blotting으로 평가했습니다.그림 6E,F,G에서 볼 수 있듯이 대조군과 비교하여 B(a)P 처리군에서는 Nrf2 수준만 감소했습니다.그러나 B(a)P 치료군과 비교하여 PG-Rg3 그룹의 B(a) Nrf2 수준은 증가했습니다(G-Rg3r의 경우 106 ± 9.5% 대 G-Rg3r의 경우 51.3 ± 6.8%, 117 ± 6.2%). G-Rg3r 대 G-Rg3s의 경우 41 ± 9.8%, p < 0.01).
특정 소형 간섭 RNA(siRNA)를 사용하여 Nrf2 발현을 억제함으로써 Nrf2의 예방 역할을 확인했습니다.Nrf2 녹다운은 Western blotting으로 확인되었습니다 (그림 7A, B).도 7C,D에 도시된 바와 같이, hEL 세포를 B(a)P 및 G-Rg3으로 공동 처리하면 B(a)P 처리에 비해 BPDE-DNA 부가물(1.47 ± 0.21)의 수가 감소했습니다. 대조 siRNA 그룹에서는 단독으로.) G-Rg3r은 4.13 ± 0.49, G-Rg3s는 1.8 ± 0.32 및 4.1 ± 0.57, p < 0.01).그러나 BPDE-DNA 형성에 대한 G-Rg3의 억제 효과는 Nrf2 녹다운에 의해 폐지되었습니다.siNrf2 그룹에서는 B(a)P와 G-Rg3 병용 처리와 B(a)P 단독 처리 사이에 BPDE-DNA 부가물 형성에 유의미한 차이가 없었습니다(G-Rg3r의 경우 3.0 ± 0.21 대 3.56 ± 0.32). ).G-Rg3r의 경우 대 G-Rg3s의 경우 3.6 대 ±0.45 대 4.0±0.37, p > 0.05).
hEL 세포에서 BPDE-DNA 부가물 형성에 대한 Nrf2 녹다운의 효과.(A) Nrf2 녹다운은 Western blotting으로 확인되었습니다.(B) Nrf2 밴드 강도의 정량화.(C) B(a)P 및 G-Rg3r로 처리된 hEL 세포에서 BPDE-DNA 부가물 수준에 대한 Nrf2 녹다운의 효과.(D) B(a)P 및 G-Rg3으로 처리된 hEL 세포에서 BPDE-DNA 부가물 수준에 대한 Nrf2 녹다운의 효과.데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
본 연구에서는 B(a)P 유발 폐암 마우스 모델에 대한 다양한 홍삼 추출물의 예방 효과를 평가했으며, KRGB 치료는 종양 부담을 유의하게 감소시켰습니다.이 인삼 추출물에서 G-Rg3의 함량이 가장 높다는 점을 고려하여 이 진세노사이드가 종양 형성을 억제하는 중요한 역할이 연구되었습니다.G-Rg3r과 G-Rg3(G-Rg3의 2개 에피머) 모두 B(a)P 유발 암 마우스 모델에서 종양 부담을 크게 감소시켰습니다.G-Rg3r 및 G-Rg3은 종양 세포의 세포사멸을 유도하고, 종양 성장을 억제하고, 세포 주기를 정지하고, 혈관신생에 영향을 미쳐 항암 효과를 발휘합니다.G-Rg3는 또한 세포 전이를 억제하는 것으로 나타났으며25 화학 요법 및 방사선 요법의 효과를 향상시키는 G-Rg3의 능력이 문서화되었습니다26,27.Poon 등은 G-Rg3 치료가 B(a)P28의 유전독성 효과를 감소시킬 수 있음을 입증했습니다.이 연구는 환경 발암성 분자를 표적으로 삼고 암을 예방하는 G-Rg3의 치료 잠재력을 보여줍니다.
좋은 예방 가능성에도 불구하고, 진세노사이드의 낮은 경구 생체 이용률은 이들 분자의 임상적 사용에 어려움을 제기합니다.쥐의 진세노사이드 경구 투여에 대한 약동학적 분석에서는 진세노사이드의 생체 이용률이 여전히 5% 미만인 것으로 나타났습니다29.이 테스트에서는 20주간의 치료 기간 후에 Rg5의 혈중 농도만 감소한 것으로 나타났습니다.생체 이용률이 낮은 기본 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았지만 P-gp는 진세노사이드 유출에 관여하는 것으로 생각됩니다.이 연구는 P-gp 차단제인 베라파밀의 투여가 G-Rg3r 및 G-Rg3s의 경구 생체 이용률을 증가시킨다는 것을 처음으로 입증했습니다.따라서, 이 발견은 G-Rg3r과 G-Rg3s가 P-gp의 유출을 조절하는 기질로 작용한다는 것을 시사합니다.
이 연구는 베라파밀과의 병용 치료가 폐암 마우스 모델에서 G-Rg3의 경구 생체 이용률을 증가시킨다는 것을 보여줍니다.이 발견은 P-gp 차단 시 G-Rg3의 장내 세포간 수송이 증가하여 흡수가 증가한다는 점에서 뒷받침됩니다.Caco2 세포 분석에서는 베라파밀 처리가 G-Rg3r 및 G-Rg3s의 유출을 감소시키면서 막 투과성을 향상시키는 것으로 나타났습니다.Yang 등의 연구.연구에 따르면 사이클로스포린 A(또 다른 P-gp 차단제)로 치료하면 진세노사이드 Rh2의 생체 이용률이 기준치 1%20에서 30% 이상으로 증가하는 것으로 나타났습니다.Ginsenosides 화합물 K와 Rg1도 비슷한 결과를 보여주었습니다30,31.베라파밀과 사이클로스포린 A를 병용 투여한 경우, Caco-2 세포에서 화합물 K의 유출은 26.6에서 3 미만으로 크게 감소한 반면, 세포 내 수준은 40배30 증가했습니다.Meng et al.31에 따르면 베라파밀이 존재하면 쥐의 폐 상피 세포에서 Rg1 수준이 증가했는데, 이는 진세노사이드 유출에서 P-gp의 역할을 암시합니다.그러나 베라파밀은 일부 진세노사이드(예: Rg1, F1, Rh1 및 Re)의 유출에 대해 동일한 효과를 나타내지 않았으며, 이는 Liang 등이 제시한 바와 같이 P-gp 기질의 영향을 받지 않음을 나타냅니다.32 .이러한 관찰은 다른 수송체 및 대체 진세노사이드 구조의 개입과 관련이 있을 수 있습니다.
암에 대한 G-Rg3의 예방 효과의 메커니즘은 불분명합니다.이전 연구에서는 G-Rg3가 산화 스트레스와 염증을 감소시켜 DNA 손상과 세포사멸을 예방하는 것으로 나타났습니다16,33. 이는 B(a)P로 유발된 종양 형성을 예방하는 기본 메커니즘일 수 있습니다.일부 보고서에 따르면 B(a)P에 의해 유발된 유전독성은 BPDE-DNA34를 형성하기 위해 2단계 효소를 조절함으로써 감소될 수 있습니다.GST는 GSH와 BPDE의 결합을 촉진하여 B(a)P35에 의해 유발되는 DNA 손상을 감소시켜 BPDE-DNA 부가물 형성을 억제하는 전형적인 2상 효소입니다.우리의 결과는 G-Rg3 처리가 hEL 세포에서 B(a)P 유발 세포 독성 및 BPDE-DNA 부가물 형성을 감소시키고 시험관 내에서 GST 발현 및 활성을 복원한다는 것을 보여줍니다.그러나 Nrf2가 없는 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않았는데, 이는 G-Rg3가 Nrf2 경로를 통해 세포 보호 효과를 유도한다는 것을 의미합니다.Nrf2는 생체이물 제거를 촉진하는 2단계 해독 효소의 주요 전사 인자입니다.Nrf2 경로의 활성화는 세포 보호를 유도하고 조직 손상을 감소시킵니다.더욱이, 몇몇 보고서는 발암에서 종양 억제자로서 Nrf2의 역할을 뒷받침했습니다.우리의 연구는 G-Rg3에 의한 Nrf2 경로의 유도가 2단계 효소를 활성화하여 B(a)P 해독을 유발하여 종양 형성 과정을 억제함으로써 B(a)P 유발 유전독성에 중요한 조절 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
우리 연구는 진세노사이드 G-Rg3의 중요한 관여를 통해 쥐의 B(a)P 유발 폐암을 예방하는 홍삼의 잠재력을 보여줍니다.이 분자의 낮은 경구 생체 이용률은 임상 적용을 방해합니다.그러나 이 연구에서는 G-Rg3가 P-gp의 기질이며 P-gp 억제제를 투여하면 시험관 내 및 생체 내에서 G-Rg3의 생체 이용률이 증가한다는 사실이 처음으로 나타났습니다.G-Rg3는 예방 기능의 잠재적인 메커니즘일 수 있는 Nrf2 경로를 조절하여 B(a)P로 유발된 세포 독성을 감소시킵니다.우리의 연구는 폐암 예방 및 치료에 대한 진세노사이드 G-Rg3의 잠재력을 확인합니다.
6주령 암컷 A/J 마우스(20 ± 1g)와 7주령 수컷 Wistar 쥐(250±20g)를 The Jackson Laboratory(미국 바 하버)와 우한 동물학 연구소에서 입수했습니다.대학 (중국 우한).중국 유형 배양 수집 센터(중국 우한)에서 Caco-2 및 hEL 세포를 제공했습니다.Sigma-Aldrich(미국 세인트루이스)는 B(a)P와 트리카프린의 공급원입니다.정제된 진세노사이드 G-Rg3r 및 G-Rg3s, 디메틸 설폭사이드(DMSO), CellTiter-96 증식 분석 키트(MTS), 베라파밀, 최소 필수 배지(MEM) 및 소 태아 혈청(FBS)은 Chengdu Must Bio-Technology에서 구입했습니다. .유한 회사.(중국 청두).QIAamp DNA 미니 키트와 BPDE-DNA 부가물 ELISA 키트는 Qiagen(Stanford, CA, USA) 및 Cell Biolabs(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다.GST 활성 분석 키트와 총 단백질 분석 키트(표준 BCA 방법)는 Solarbio(Beijing, China)에서 구입했습니다.모든 홍삼 추출물은 Mingyu Laboratory 7에 보관되어 있습니다. 홍콩침례대학교(홍콩, 중국)와 한국암센터(대한민국, 서울)는 CRG 추출물과 다양한 한국산 홍삼 추출물(KRGA, KRGB 포함)의 상업적 공급원입니다. 및 KRGC).홍삼은 6년근 수삼의 뿌리로 만들어집니다.홍삼추출물은 인삼을 물로 3회 세척한 후, 수성추출물을 농축하고, 최종적으로 저온에서 건조하여 인삼추출분말을 얻는다.항체(항-Nrf2, 항-GST 및 β-액틴), 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항토끼 면역글로불린 G(IgG), 형질감염 시약, 대조 siRNA 및 Nrf2 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입했습니다. .), 미국).
Caco2 및 hEL 세포를 5% CO2의 가습된 분위기에서 37°C, 10% FBS가 포함된 MEM이 포함된 100mm2 세포 배양 접시에서 배양했습니다.치료 조건의 효과를 확인하기 위해 hEL 세포를 MEM에서 다양한 농도의 B(a)P 및 G-Rg3와 함께 48시간 동안 배양했습니다.세포를 추가로 분석하거나 수집하여 무세포 추출물을 제조할 수 있습니다.
모든 실험은 화중과학기술대학교 통지의과대학 실험동물윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 2019, 등록 번호 4587TH).모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며, 연구는 Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments(ARRIVE) 지침에 따라 수행되었습니다.8주령 A/J 마우스에게 트리카프린 용액(100mg/kg, 0.2ml)에 포함된 B(a)P를 먼저 복강 내 주사했습니다.일주일 후, 마우스를 대조군과 다른 처리군으로 무작위로 나누어 각 그룹에 15마리씩 하루에 한 번씩 위관 영양을 공급했습니다.20주간의 치료 후 동물은 CO2 질식으로 희생되었습니다.폐를 수집하고 24시간 동안 고정했습니다.표재성 종양의 수와 개별 종양 크기를 해부 현미경으로 각 폐에 대해 정량화했습니다.종양 부피 추정치(V)는 다음 식을 사용하여 계산되었습니다: V(mm3) = 4/3πr3, 여기서 r은 종양 직경입니다.생쥐 폐의 모든 종양 부피의 순합은 총 종양 부피를 나타내고, 각 그룹의 평균 총 종양 부피는 종양 부하를 나타냅니다.UPLC-MS/MS 측정을 위해 전혈 및 장 샘플을 수집하고 -80°C에서 보관했습니다.혈청을 수집하고 자동 화학 분석기를 사용하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 혈청 크레아티닌(Cr) 수준을 분석하여 간 및 신장 기능을 평가했습니다.
수집된 샘플을 냉장 보관에서 꺼내 해동하고 무게를 측정한 다음 위에서 설명한 대로 튜브에 넣었습니다.여기에 0.8ml 메탄올 용액에 용해된 0.5μM 플로리진(내부 표준)을 첨가했습니다.그런 다음 조직을 Tissue-Tearor를 사용하여 균질화하고 균질액을 1.5ml 미세원심분리 튜브로 옮겼습니다.혼합물을 15500rpm에서 15분 동안 원심분리하였다.상층액 1.0ml를 제거한 후 질소로 건조시킨다.회수를 위해 200 마이크로리터의 메탄올이 사용되었습니다.혈액은 한 라인에서 수집 및 처리되며 모든 측정의 기준으로 사용됩니다.
베라파밀 첨가에 의한 G-Rg3 수송의 잠재적인 향상을 평가하기 위해 24웰 트랜스웰 플레이트에 웰당 1.0 x 105개의 Caco-2 세포를 시딩했습니다.3주간의 배양 후, 세포를 HBSS로 세척하고 37℃에서 전배양하였다.10μM G-Rg3(G-Rg3r, G-Rg3s 또는 50 또는 100μM 베라파밀과의 혼합물) 400μL를 단층의 기저측면 또는 정점측에 주입하고, 다른 층에는 HBSS 용액 600μL를 첨가했습니다. 옆.지정된 시간(0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분)에 배양 배지 100μl를 수집하고 HBSS 100μl를 첨가하여 이 용량을 구성합니다.샘플은 UPLC-MS/MS로 검출될 때까지 -4°C에서 보관되었습니다.Papp = dQ/(dT × A × C0) 표현은 겉보기 단방향 정점 및 기저측 투과성을 정량화하는 데 사용되며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다(각각 Pa-b 및 Pb-a).dQ/dT는 농도의 변화이고, A(0.6 cm2)는 단층의 표면적이며, C0는 초기 도너 농도이다.유출 비율은 연구 약물의 유출 속도를 나타내는 Pb-a/Pa-b로 계산됩니다.
수컷 Wistar 쥐를 24시간 동안 금식시키고, 물만 마시고, 3.5% 펜토바르비탈 용액을 정맥 주사하여 마취시켰다.삽관된 실리콘 튜브는 십이지장의 끝이 입구이고 회장의 끝이 출구입니다.연동 펌프를 사용하여 등장성 HBSS의 10 μM G-Rg3r 또는 G-Rg3s로 입구를 0.1 ml/min의 유량으로 펌핑합니다.베라파밀의 효과는 10μM G-Rg3r 또는 G-Rg3s에 50μM 또는 100μM의 화합물을 첨가하여 평가되었습니다.관류 시작 후 60, 90, 120, 150분 시점에 채취한 관류 추출물에 대해 UPLC-MS/MS를 수행하였다.흡수율은 %흡수율 = (1 – Cout/Cin) × 100% 공식으로 정량화됩니다.출구와 입구의 G-Rg3 농도는 각각 Cout과 Cin으로 표현됩니다.
hEL 세포를 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하고 DMSO에 용해된 B(a)P(0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) 또는 G-Rg3로 처리했습니다. .그런 다음 약물을 배양 배지를 사용하여 48시간에 걸쳐 다양한 농도(0, 1, 2, 5, 10, 20 μM)로 희석했습니다.시판되는 MTS 분석 키트를 사용하여 세포에 표준 프로토콜을 적용한 다음 490 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했습니다.B(a)P (10 μM) 및 G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM)을 동시 처리한 군의 세포 생존율을 상기 방법에 따라 평가하고 무처리 군과 비교하였다.
hEL 세포를 6웰 플레이트에 1 x 105개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 10μM G-Rg3의 존재 또는 부재 하에 10μMB(a)P로 처리했습니다.처리 48시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA Mini Kit를 사용하여 hEL 세포로부터 DNA를 추출했습니다.BPDE-DNA 부가물의 형성은 BPDE-DNA 부가물 ELISA 키트를 사용하여 검출되었습니다.BPDE-DNA 부가물의 상대적 수준은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 측정했습니다.
hEL 세포를 96웰 플레이트에 웰당 1 x 104개 세포의 밀도로 시딩하고 10μM G-Rg3의 부재 또는 존재 하에 48시간 동안 10μMB(a)P로 처리했습니다.GST 활성은 제조사의 프로토콜에 따라 상용 GST 활성 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다.상대적인 GST 활성화는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서의 흡광도로 측정되었습니다.
hEL 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척한 후 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 방사면역침전 분석 완충액을 사용하여 용해시켰습니다.Total Protein Assay Kit를 이용하여 단백질을 정량한 후, 각 시료 중 30 μg의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 전기영동을 통해 PVDF 멤브레인에 옮겼습니다.막을 5% 탈지유로 차단하고 4°C에서 밤새 1차 항체와 함께 배양했습니다.양 고추냉이 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체와 함께 배양한 후 강화된 화학발광 시약을 첨가하여 결합 신호를 시각화했습니다.ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 단백질 밴드의 강도를 정량화했습니다.
GraphPad Prism 7.0 소프트웨어를 사용하여 평균 ± 표준 편차로 표현된 모든 데이터를 분석했습니다.치료 그룹 간의 차이는 스튜던트 t 테스트 또는 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었으며, P 값 <0.05는 통계적 유의성을 나타냅니다.
이 연구 중에 획득하거나 분석한 모든 데이터는 이 출판된 기사와 보충 정보 파일에 포함되어 있습니다.
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게시 시간: 2023년 9월 17일