Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Siekiant geriausių rezultatų, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stiliaus ar JavaScript.
Raudonasis ženšenis tradicinėje Azijos medicinoje naudojamas šimtus metų.Šiame tyrime įvertinome keturių rūšių raudonojo ženšenio (Kinijos raudonojo ženšenio, Korėjos raudonojo ženšenio A, Korėjos raudonojo ženšenio B ir Korėjos raudonojo ženšenio C), auginamų skirtinguose regionuose, gebėjimą slopinti kancerogenų sukeltų plaučių formavimąsi ir augimą. navikai.Benzo(a)pireno (B(a)P) testas buvo atliktas su A/J pelėmis, ir buvo nustatyta, kad Korėjos raudonasis ženšenis B veiksmingiausias mažinant naviko naštą tarp keturių raudonųjų ženšenių veislių.Be to, išanalizavome įvairių ženzenozidų (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 ir Rg5) kiekį keturiuose raudonojo ženšenio ekstraktuose ir nustatėme, kad Korėjos raudonasis ženšenis B didžiausias ginsenozido Rg3 (G-Rg3) kiekis, o tai rodo, kad G-Rg3 gali atlikti svarbų vaidmenį užtikrinant jo terapinį veiksmingumą.Šis darbas rodo, kad G-Rg3 biologinis prieinamumas yra palyginti mažas.Tačiau, kai G-Rg3 buvo vartojamas kartu su P-gp inhibitoriumi verapamiliu, G-Rg3 ištekėjimas į Caco-2 ląsteles sumažėjo, G-Rg3 absorbcijos žarnyne greitis padidėjo žiurkės modelyje, o G-Rg3. buvo padidintas.Caco-2 ląstelėse sumažėja Rg3 nutekėjimas, mažėja Rg3 koncentracijos lygis.G-Rg3 padidėja žarnyne ir plazmoje, o jo gebėjimas užkirsti kelią navikams taip pat sustiprėja B (a) P sukeltos naviko atsiradimo žiurkės modelyje.Taip pat nustatėme, kad G-Rg3 sumažino B (a) P sukeltą citotoksiškumą ir DNR aduktų susidarymą žmogaus plaučių ląstelėse ir atkūrė II fazės fermentų ekspresiją ir aktyvumą per Nrf2 kelią, kuris gali būti susijęs su galimu veikimo mechanizmu. G slopinimo -Rg3..Apie plaučių navikų atsiradimą.Mūsų tyrimas rodo potencialiai svarbų G-Rg3 vaidmenį nukreipiant į plaučių navikus pelių modeliuose.Šio ginsenozido biologinis prieinamumas per burną padidinamas nukreipus į P-glikoproteiną, todėl molekulė gali turėti priešvėžinį poveikį.
Dažniausias plaučių vėžio tipas yra nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC), kuris yra viena iš pagrindinių mirčių nuo vėžio priežasčių Kinijoje ir Šiaurės Amerikoje1,2.Pagrindinis veiksnys, didinantis riziką susirgti nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu, yra rūkymas.Cigarečių dūmuose yra daugiau nei 60 kancerogenų, įskaitant benzo(a)pireną (B(a)P), nitrozaminus ir radioaktyviuosius radono skilimo izotopus.3 Policikliniai aromatiniai angliavandeniliai B(a)P yra pagrindinė cigarečių toksiškumo priežastis. dūmai.Veikiamas B(a)P, citochromas P450 paverčia jį B(a)P-7,8-dihidrodiolio-9,10-epoksidu (BPDE), kuris reaguoja su DNR ir sudaro BPDE-DNR aduktą 4. aduktai sukelia plaučių naviko atsiradimą pelėms, kurių naviko stadija ir histopatologija panaši į žmogaus plaučių navikus5.Dėl šios savybės B (a) P sukeltas plaučių vėžio modelis yra tinkama sistema, skirta įvertinti junginius, turinčius galimų priešvėžinių savybių.
Viena iš galimų strategijų, kaip užkirsti kelią plaučių vėžio išsivystymui didelės rizikos grupėse, ypač rūkantiems, yra chemoprevencinių medžiagų naudojimas, siekiant slopinti intraepitelinių navikų pažeidimų vystymąsi ir taip užkirsti kelią tolesniam jų progresavimui iki piktybinių navikų.Tyrimai su gyvūnais rodo, kad įvairios chemoprevencinės medžiagos yra veiksmingos6.Ankstesnėje mūsų ataskaitoje7 buvo pabrėžtas geras raudonojo ženšenio profilaktinis poveikis plaučių vėžiui.Ši žolė šimtmečius buvo naudojama tradicinėje Azijos medicinoje, siekiant pailginti gyvenimą ir pailginti sveikatą, ir dokumentais nustatyta, kad ji turi priešnavikinį poveikį8.
Aktyvus ženšenio veiksnys yra žensenozidas, kuris naudojamas kaip sudėtinis žymeklis ženšenio ekstraktų kokybei įvertinti.Kiekybinė neapdorotų ženšenio ekstraktų analizė paprastai apima kelių ginsenozidų naudojimą, įskaitant RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 ir Rc9,10.Ginsenozidai klinikai mažai naudojami dėl labai prasto biologinio prieinamumo per burną11.Nors šio prasto biologinio prieinamumo mechanizmas nėra aiškus, priežastis gali būti P-glikoproteino (P-gp)12 sukeltas ginsenozidų nutekėjimas.P-gp yra vienas iš svarbiausių ištekėjimo transporterių ATP surišančių kasečių transporterių superšeimoje, kuri naudoja ATP hidrolizės energiją, kad išlaisvintų tarpląstelines medžiagas į išorinę aplinką.P-gp pernešėjai paprastai yra plačiai paplitę žarnyno, inkstų, kepenų ir kraujo-smegenų barjeruose13.P-gp vaidina lemiamą vaidmenį absorbuojant žarnyną, o P-gp slopinimas padidina kai kurių vaistų nuo vėžio absorbciją ir prieinamumą per burną12,14.Anksčiau literatūroje naudotų inhibitorių pavyzdžiai yra verapamilis ir ciklosporinas A15.Šis darbas apima pelių sistemos sukūrimą, skirtą B (a) P sukelto plaučių vėžio tyrimui, siekiant įvertinti skirtingų raudonųjų ženšenio ekstraktų iš Kinijos ir Korėjos gebėjimą paveikti piktybinius navikus.Ekstraktai buvo analizuojami atskirai, siekiant nustatyti specifinius ginsenozidus, kurie gali turėti įtakos kancerogenezei.Tada verapamilis buvo naudojamas P-gp nukreipti ir gerinti vėžį nukreiptų ginsenozidų biologinį prieinamumą ir terapinį veiksmingumą.
Mechanizmas, kuriuo ženšenio saponinai daro terapinį poveikį kancerogenezei, lieka neaiškus.Tyrimai parodė, kad įvairūs ginsenozidai gali sumažinti kancerogenų sukeltą DNR žalą, nes sumažina oksidacinį stresą ir aktyvuoja II fazės detoksikacijos fermentus, taip užkertant kelią ląstelių pažeidimams.Glutationo S-transferazė (GST) yra tipiškas II fazės fermentas, reikalingas siekiant sumažinti kancerogenų sukeltą DNR pažeidimą17.Su branduoliniu eritroidu 2 susijęs faktorius 2 (Nrf2) yra svarbus transkripcijos faktorius, reguliuojantis redokso homeostazę ir aktyvuojantis II fazės fermentų ekspresiją bei citoprotekcinius antioksidacinius atsakus18.Mūsų tyrime taip pat buvo tiriamas nustatytų ginsenozidų poveikis B(a)P sukelto citotoksiškumo mažinimui ir BPDE-DNR aduktų susidarymui, taip pat II fazės fermentų indukcijai, moduliuojant Nrf2 kelią normaliose plaučių ląstelėse.
B (a) P sukelto vėžio pelių modelio sukūrimas atitinka ankstesnį darbą5.1A paveiksle parodytas eksperimentinis 20 savaičių trukmės pelių vėžio modelio, kurį sukėlė B(a)P, vandens (kontrolinė), kininio raudonojo ženšenio ekstrakto (CRG), Korėjos raudonojo ženšenio ekstrakto A (KRGA) ir Korėjos raudonojo ekstrakto, gydymo planas. ženšenis.Ekstraktas B (KRGB) ir Korėjos raudonojo ženšenio ekstraktas C (KRGC).Po 20 savaičių gydymo raudonuoju ženšeniu pelės buvo nužudytos uždusinant CO2.1B paveiksle pavaizduoti makroskopiniai plaučių navikai gyvūnams, gydytiems skirtingų rūšių raudonuoju ženšeniu, o 1C paveiksle parodyta reprezentatyvi naviko mėginio šviesos mikrografija.KRGB gydytų gyvūnų auglių našta (1,5 ± 0,35) buvo mažesnė nei kontrolinių gyvūnų (0,82 ± 0,2, P < 0,05), kaip parodyta 1D paveiksle.Vidutinis naviko apkrovos slopinimo laipsnis buvo 45%.Kiti tirti raudonojo ženšenio ekstraktai tokių reikšmingų naviko naštos pokyčių neparodė (P > 0,05).Per 20 gydymo raudonuoju ženšeniu savaičių pelės modelyje nepastebėta jokių akivaizdžių šalutinių poveikių, įskaitant kūno svorio pasikeitimą (duomenys nerodomi) ir toksinio poveikio kepenims ar inkstams (1E, F pav.).
Raudonojo ženšenio ekstraktas gydo A/J pelių plaučių navikų vystymąsi.(A) Eksperimentinis dizainas.(B) Dideli plaučių navikai pelės modelyje.Navikai žymimi rodyklėmis.a: Kinijos raudonojo ženšenio grupė.b: Korėjos raudonojo ženšenio A grupė.c: Korėjos raudonojo ženšenio grupė B. d: Korėjos raudonojo ženšenio grupė C. d: Kontrolinė grupė.(C) Šviesos mikrografija, rodanti plaučių naviką.Didinimas: 100. b: 400. (D) Auglio apkrova raudonojo ženšenio ekstrakto grupėje.(E) Kepenų fermento ALT kiekis plazmoje.(F) Inkstų fermento Cr koncentracija plazmoje.Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05.
Šiame tyrime nustatyti raudonojo ženšenio ekstraktai buvo analizuojami naudojant itin efektyvią skysčių chromatografijos tandeminę masės spektrometriją (UPLC-MS/MS), siekiant kiekybiškai įvertinti šiuos ginsenozidus: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 ir Rg5.Analitėms matuoti naudotos UPLC ir MS sąlygos buvo aprašytos ankstesnėje ataskaitoje19.Keturių raudonojo ženšenio ekstraktų UPLC-MS/MS chromatogramos parodytos 2A paveiksle.Bendras ginzenozido kiekis labai skyrėsi, o didžiausias bendras ginzenozido kiekis CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (2B pav.).Vertinant atskirus ginzenozidus (2C pav.), KRGB parodė aukščiausią G-Rg3 lygį, palyginti su kitais ginsenozidais (58,33 ± 3,81 μmol/L G-Rg3 ir 41,56 ± 2,88 μmol/L G -Rg3r).raudonojo ženšenio tipo (P < 0,001).G-Rg3 atsiranda kaip pora stereoizomerų G-Rg3r ir G-Rg3s, kurie skiriasi hidroksilo grupės padėtimi prie anglies 20 (2D pav.).Rezultatai rodo, kad G-Rg3r arba G-Rg3 gali turėti svarbų priešvėžinį potencialą B (a) P sukeltame vėžio pelių modelyje.
Ginsenozidų kiekis įvairiuose raudonojo ženšenio ekstraktuose.(A) Keturių raudonųjų ženšenio ekstraktų UPLC-MS/MS chromatogramos.(B) Bendro ginsenozido kiekio nurodytuose ekstraktuose įvertinimas.(C) Atskirų ginsenozidų aptikimas paženklintuose ekstraktuose.(D) Ginsenozido stereoizomerų G-Rg3r ir G-Rg3s struktūros.Duomenys išreiškiami kaip trijų kartotinių nustatymų vidurkis ± standartinis nuokrypis.***P <0,001.
Atlikus UPLC-MS/MS tyrimą, po 20 gydymo savaičių reikėjo kiekybiškai įvertinti ginsenozidų kiekį žarnyno ir kraujo mėginiuose.Gydymas KRGB parodė, kad kraujyje buvo tik 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5.Likusių ginsenozidų nebuvo aptikta, o tai rodo prastą biologinį prieinamumą per burną, todėl sumažėjo šių ginsenozidų poveikis.
Storosios žarnos adenokarcinomos ląstelių linija Caco-2 yra morfologiškai ir biochemiškai panaši į žmogaus žarnyno epitelio ląsteles, parodydama jos naudingumą vertinant enterocitų transportavimą per žarnyno epitelio barjerą.Ši analizė buvo pagrįsta ankstesniu tyrimu 20 .3A, B, C, D, E, F paveiksluose pavaizduoti reprezentatyvūs G-Rg3r ir G-Rg3 transląstelinio transportavimo vaizdai naudojant Caco-2 vienasluoksnį modelį.Transląstelinis G-Rg3r arba G-Rg3 pernešimas per Caco-2 monosluoksnius iš bazolaterinės pusės į viršūnę (Pb-a) buvo žymiai didesnis nei iš viršūnės į bazolaterinę pusę (Pa-b).G-Rg3r vidutinė Pa-b vertė buvo 0,38 ± 0,06, kuri padidėjo iki 0,73 ± 0,06 po gydymo 50 μmol/L verapamiliu ir iki 1,14 ± 0,09 po gydymo 100 μmol/L verapamiliu (p <,0,01 ir 0,01) atitinkamai 2 pav.).3A).G-Rg3 stebėjimai buvo panašūs (3B pav.), o rezultatai parodė, kad gydymas verapamiliu pagerino G-Rg3r ir G-Rg3 transportavimą.Gydymas verapamiliu taip pat žymiai sumažino vidutinius Pb-a ir G-Rg3r bei G-Rg3 ištekėjimo santykius (3C, D, E, F pav.), o tai rodo, kad gydymas verapamiliu sumažina ginsenozido kiekį Caco-2 ištekėjimo ląstelėse..
Transląstelinis G-Rg3 pernešimas Caco-2 monosluoksniuose ir žarnyno absorbcija žiurkių perfuzijos tyrime.(A) G-Rg3r grupės Pa-b reikšmė Caco-2 viename sluoksnyje.(B) G-Rg3s grupių Pa-b reikšmė Caco-2 viename sluoksnyje.(C) G-Rg3r grupės Pb reikšmė Caco-2 viename sluoksnyje.(D) G-Rg3s grupių Pb reikšmė Caco-2 viename sluoksnyje.(E) G-Rg3r grupių derlingumo santykis Caco-2 viename sluoksnyje.(F) G-Rg3 grupių derlingumo santykis Caco-2 viename sluoksnyje.(G) G-Rg3r absorbcijos žarnyne procentas perfuzijos tyrime žiurkėms.(H) G-Rg3 absorbcijos žarnyne procentas perfuzijos tyrime žiurkėms.Pralaidumas ir absorbcija buvo lyginami nepridedant verapamilio.Duomenys išreiškiami kaip penkių nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Remiantis ankstesniu darbu20, buvo atlikta ortotopinė žiurkių žarnyno perfuzija, siekiant nustatyti, ar po gydymo verapamiliu padidėja G-Rg3 absorbcija žarnyne.3G, H paveikslai rodo reprezentatyvius perfuzijos tyrimus, skirtus įvertinti G-Rg3r ir G-Rg3 absorbcijos žarnyne procentą vėžio modelio žiurkėms per aukščiau nurodytus laikotarpius.Pradinis maždaug 10 % silpno G-Rg3r įsisavinimo procentas padidėjo iki daugiau nei 20 % po gydymo 50 μM verapamiliu ir iki daugiau nei 25 % po gydymo 100 μM verapamiliu.Be to, G-Rg3, kurio pradinis pasisavinimas buvo 10%, taip pat pasireiškė daugiau nei 20% po gydymo 50 μM verapamiliu ir beveik 30% po gydymo 100 μM verapamiliu, o tai rodo, kad verapamilis sustiprina P-gp slopinimą. žarnyno G absorbcija Rg3 plaučių vėžio pelės modelyje.
Pagal aukščiau pateiktą metodą, B (a) P sukeltos vėžio modelio pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į šešias grupes, kaip parodyta 4A paveiksle.Gydymo G-Rg3 grupėje, palyginti su kontroline grupe, reikšmingo svorio netekimo ar klinikinių toksiškumo požymių nepastebėta (duomenys nerodomi).Po 20 gydymo savaičių buvo paimti kiekvienos pelės plaučiai.4B paveiksle pavaizduoti makroskopiniai plaučių navikai pelėms pirmiau minėtose gydymo grupėse, o 4C paveiksle parodyta reprezentatyvaus naviko šviesos mikrografija.Kalbant apie naviko naštą kiekvienoje grupėje (4D pav.), G-Rg3r ir G-Rg3s gydytų pelių reikšmės buvo atitinkamai 0,75 ± 0,29 mm3 ir 0,81 ± 0,30 mm3, o G pelių, gydytų G-Rg3. su -Rg3s buvo atitinkamai 1,63 ±0,40 mm3.kontrolinių pelių (p < 0,001), o tai rodo, kad gydymas G-Rg3 sumažino naviko naštą pelėms.Verapamilio vartojimas dar labiau padidino šį sumažėjimą: verapamilis+ G-Rg3r pelių reikšmės sumažėjo nuo 0,75 ± 0,29 mm3 iki 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), o verapamilio+ vertės sumažėjo nuo 0,81 ± 0,30 mm2 iki 1,9 mm3 G. -Rg3s gydytose pelėse (p < 0,05), o tai rodo, kad verapamilis gali sustiprinti slopinamąjį G-Rg3 poveikį navikogenezei.Naviko našta reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės grupės ir verapamilio grupės, G-Rg3r grupės ir G-Rg3s grupės bei verapamilio+G-Rg3r grupės ir verapamilio+G-Rg3s grupės reikšmingų skirtumų neparodė.Be to, su vertinamu gydymu nebuvo reikšmingo toksinio poveikio kepenims ar inkstams (4E, F pav.).
Naviko našta po gydymo G-Rg3 ir G-Rg3r bei G-Rg3 koncentracija plazmoje arba žarnyne nurodytose grupėse.(A) Eksperimentinis dizainas.(B) Makroskopiniai navikai pelės modelyje.Navikai žymimi rodyklėmis.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r kartu su verapamiliu.d: G-Rg3 kartu su verapamiliu.d: Verapamilis.e: valdymas.(C) optinė naviko mikrografija padidinus.Atsakymas: 100 kartų.b: 400X.(D) G-Rg3 + verapamilio gydymo poveikis naviko naštai A / J pelėms.(E) Kepenų fermento ALT kiekis plazmoje.(F) Inkstų fermento Cr koncentracija plazmoje.(G) nurodytų grupių G-Rg3r arba G-Rg3 kiekis plazmoje.(H) G-Rg3r arba G-Rg3 lygiai nurodytų grupių žarnyne.Duomenys išreiškiami kaip trijų kartotinių nustatymų vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3 lygiai B(a)P sukelto vėžio modelio pelėse buvo įvertinti UPLC-MS/MS po 20 savaičių gydymo pagal metodų skyriuje aprašytą metodą.4G ir H paveikslai rodo atitinkamai plazmos ir žarnyno G-Rg3 lygį.G-Rg3r kiekis plazmoje buvo 0,44 ± 0,32 μmol/L ir padidėjo iki 1,17 ± 0,47 μmol/L kartu vartojant verapamilį (p < 0,001), o žarnyno G-Rg3r lygis buvo 0,53 ± 0,08 µg/l.Derinant su verapamiliu, g padidėjo iki 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).G-Rg3 rezultatai buvo panašūs, o tai rodo, kad gydymas verapamiliu padidino geriamąjį G-Rg3 biologinį prieinamumą A/J pelėms.
Ląstelių gyvybingumo tyrimas buvo naudojamas B(a)P ir G-Rg3 citotoksiškumui hEL ląstelėse įvertinti.B(a)P hEL ląstelėse sukeltas citotoksiškumas parodytas 5A paveiksle, o netoksiškos G-Rg3r ir G-Rg3 savybės parodytos 5A ir 5B paveiksluose.5B, C. Norint įvertinti citoprotekcinį G-Rg3 poveikį, B(a)P į hEL ląsteles buvo skiriamas kartu su įvairiomis G-Rg3r arba G-Rg3 koncentracijomis.Kaip parodyta 5D paveiksle, G-Rg3r, esant 5 μM, 10 μM ir 20 μM koncentracijoms, atkūrė ląstelių gyvybingumą atitinkamai iki 58,3%, 79,3% ir 77,3%.Panašūs rezultatai taip pat gali būti matomi G-Rg3s grupėje.Kai G-Rg3 koncentracija buvo 5 µM, 10 µM ir 20 µM, ląstelių gyvybingumas buvo atkurtas atitinkamai iki 58,3 %, 72,7 % ir 76,7 % (5E pav.).).BPDE-DNR aduktų buvimas buvo matuojamas naudojant ELISA rinkinį.Mūsų rezultatai parodė, kad BPDE-DNR aduktų lygis padidėjo B(a)P gydytoje grupėje, palyginti su kontroline grupe, tačiau, palyginti su G-Rg3 kartu gydymu, BPDE-DNR aduktų lygis B(a)P grupėje. B gydytoje grupėje DNR aduktų lygis buvo žymiai sumažintas.Gydymo vien B(a)P rezultatai parodyti 5F paveiksle (1,87 ± 0,33 ir 3,77 ± 0,42 G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 ir 3,77 ± 0,42 G -Rg3s, p < 0,001).
Ląstelių gyvybingumas ir BPDE-DNR aduktų susidarymas hEL ląstelėse, apdorotose G-Rg3 ir B(a)P.(A) B (a) P apdorotų hEL ląstelių gyvybingumas.(B) G-Rg3r apdorotų hEL ląstelių gyvybingumas.(C) G-Rg3 apdorotų hEL ląstelių gyvybingumas.(D) B(a)P ir G-Rg3r apdorotų hEL ląstelių gyvybingumas.(E) B(a)P ir G-Rg3 apdorotų hEL ląstelių gyvybingumas.(F) BPDE-DNR adukto lygiai hEL ląstelėse, apdorotose B(a)P ir G-Rg3.Duomenys išreiškiami kaip trijų kartotinių nustatymų vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST fermento ekspresija buvo aptikta po bendro apdorojimo 10 μM B (a) P ir 10 μM G-Rg3r arba G-Rg3s.Mūsų rezultatai parodė, kad B(a)P slopino GST ekspresiją (59,7 ± 8,2 % G-Rg3r grupėje ir 39 ± 4,5 % G-Rg3s grupėje), o B(a)P buvo susijęs su bet kuriuo iš G-Rg3r. , arba su G-Rg3r, arba su G-Rg3r.Bendras gydymas su G-Rg3 atkūrė GST ekspresiją.GST ekspresija (103,7 ± 15,5 % G-Rg3r grupėje ir 110 ± 11,1 % G-Rg3s grupėje, atitinkamai p < 0,05 ir p < 0,001, 6A, B ir C pav.).GST aktyvumas buvo įvertintas naudojant aktyvumo tyrimo rinkinį.Mūsų rezultatai parodė, kad kombinuoto gydymo grupėje buvo didesnis GST aktyvumas, palyginti su tik B(a)P grupe (96,3 ± 6,6 %, palyginti su 35,7 ± 7,8 % G-Rg3r grupėje ir 92,3 ± 6,5 G-Rg3r grupėje). ).% palyginti su 35,7 ± 7,8 % G-Rg3s grupėje, p < 0,001, 6D pav.).
GST ir Nrf2 ekspresija hEL ląstelėse, apdorotose B(a)P ir G-Rg3.(A) GST ekspresijos aptikimas Western blot metodu.(B) Kiekybinė GST ekspresija hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3r.(C) Kiekybinė GST ekspresija hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3.(D) GST aktyvumas hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3.(E) Nrf2 ekspresijos aptikimas Western blot metodu.(F) Kiekybinė Nrf2 ekspresija hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3r.(G) Kiekybinė Nrf2 ekspresija hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3.Duomenys išreiškiami kaip trijų kartotinių nustatymų vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Siekiant išsiaiškinti būdus, susijusius su G-Rg3 sukeltu B (a) P sukeltos naviko atsiradimo slopinimu, Nrf2 ekspresija buvo įvertinta Western blot metodu.Kaip parodyta 6E, F, G paveiksluose, lyginant su kontroline grupe, sumažėjo tik Nrf2 lygis B(a)P gydymo grupėje;tačiau, palyginti su B(a)P gydymo grupe, B(a) Nrf2 lygis PG-Rg3 grupėje buvo padidėjęs (106 ± 9,5 % G-Rg3r, palyginti su 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6, 2 % G-Rg3r palyginti su 41 ± 9,8 % G-Rg3s, p < 0,01).
Mes patvirtinome prevencinį Nrf2 vaidmenį slopindami Nrf2 ekspresiją, naudodami specifinę mažą trukdančią RNR (siRNR).Nrf2 numušimas buvo patvirtintas Western blot metodu (7A, B pav.).Kaip parodyta 7C, D paveiksluose, kartu gydant hEL ląsteles B(a)P ir G-Rg3, sumažėjo BPDE-DNR aduktų skaičius (1,47 ± 0,21), palyginti su gydymu B(a)P. vien tik kontrolinėje siRNR grupėje.) G-Rg3r buvo 4,13 ± 0,49, G-Rg3s buvo 1,8 ± 0,32 ir 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Tačiau slopinantis G-Rg3 poveikis BPDE-DNR susidarymui buvo panaikintas dėl Nrf2 numušimo.siNrf2 grupėje nebuvo reikšmingo skirtumo tarp BPDE-DNR aduktų susidarymo tarp gydymo B(a)P ir G-Rg3 ir gydymo vien B(a)P (3,0 ± 0,21 G-Rg3r ir 3,56 ± 0,32). ).G-Rg3r, palyginti su 3,6 G-Rg3s, palyginti su ±0,45 ir 4,0±0,37, p > 0,05).
Nrf2 numušimo poveikis BPDE-DNR adukto susidarymui hEL ląstelėse.(A) Nrf2 numušimas buvo patvirtintas Western blot būdu.(B) Nrf2 juostos intensyvumo kiekybinis įvertinimas.(C) Nrf2 numušimo poveikis BPDE-DNR adukto lygiams hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3r.(D) Nrf2 numušimo poveikis BPDE-DNR adukto lygiui hEL ląstelėse, apdorotose B (a) P ir G-Rg3.Duomenys išreiškiami kaip trijų kartotinių nustatymų vidurkis ± standartinis nuokrypis.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Šiame tyrime buvo įvertintas įvairių raudonojo ženšenio ekstraktų prevencinis poveikis B (a) P sukelto plaučių vėžio pelės modeliui, o gydymas KRGB žymiai sumažino naviko naštą.Atsižvelgiant į tai, kad šiame ženšenio ekstrakte G-Rg3 yra didžiausias kiekis, buvo ištirtas svarbus šio ginsenozido vaidmuo slopinant navikogenezę.Tiek G-Rg3r, tiek G-Rg3 (du G-Rg3 epimerai) žymiai sumažino naviko naštą B (a) P sukelto vėžio pelės modelyje.G-Rg3r ir G-Rg3 daro priešvėžinį poveikį, sukeldami naviko ląstelių apoptozę21, slopindami naviko augimą22, sustabdydami ląstelių ciklą23 ir paveikdami angiogenezę24.Taip pat buvo įrodyta, kad G-Rg3 slopina ląstelių metastazes25, o G-Rg3 gebėjimas sustiprinti chemoterapijos ir radioterapijos poveikį buvo dokumentuotas 26, 27.Poon ir kt. parodė, kad gydymas G-Rg3 gali sumažinti B (a) P28 genotoksinį poveikį.Šis tyrimas parodo terapinį G-Rg3 potencialą nukreipiant į aplinkos kancerogenines molekules ir užkertant kelią vėžiui.
Nepaisant gero profilaktinio potencialo, prastas ginsenozidų biologinis prieinamumas per burną kelia iššūkį klinikiniam šių molekulių naudojimui.Žiurkių geriamųjų ginsenozidų farmakokinetinė analizė parodė, kad jo biologinis prieinamumas vis dar yra mažesnis nei 5 %29.Šie tyrimai parodė, kad po 20 savaičių gydymo Rg5 kiekis kraujyje sumažėjo tik.Nors pagrindinis prasto biologinio prieinamumo mechanizmas dar turi būti išaiškintas, manoma, kad P-gp yra susijęs su ginsenozidų nutekėjimu.Šis darbas pirmą kartą parodė, kad verapamilio, P-gp blokatoriaus, vartojimas padidina geriamąjį G-Rg3r ir G-Rg3 biologinį prieinamumą.Taigi, ši išvada rodo, kad G-Rg3r ir G-Rg3 veikia kaip P-gp substratai, reguliuojantys jo ištekėjimą.
Šis darbas rodo, kad kombinuotas gydymas verapamiliu padidina geriamąjį G-Rg3 biologinį prieinamumą plaučių vėžio pelės modelyje.Šią išvadą patvirtina padidėjęs G-Rg3 pernešimas žarnyne, kai blokuojamas P-gp, taip padidindamas jo absorbciją.Tyrimai Caco2 ląstelėse parodė, kad gydymas verapamiliu sumažino G-Rg3r ir G-Rg3s ištekėjimą, tuo pačiu pagerindamas membranos pralaidumą.Yang ir kt. atliktas tyrimas.Tyrimai parodė, kad gydymas ciklosporinu A (kitu P-gp blokatoriumi) padidina ginsenozido Rh2 biologinį prieinamumą nuo pradinės vertės 1 %20 iki daugiau nei 30 %.Ginsenozidų junginiai K ir Rg1 taip pat parodė panašius rezultatus30, 31.Kartu vartojant verapamilį ir ciklosporiną A, junginio K ištekėjimas į Caco-2 ląsteles žymiai sumažėjo nuo 26,6 iki mažiau nei 3, o jo intraląstelinis lygis padidėjo 40 kartų30.Esant verapamiliui, Rg1 lygis padidėjo žiurkės plaučių epitelio ląstelėse, o tai rodo P-gp vaidmenį ginsenozido ištekėjime, kaip parodė Meng ir kt.31.Tačiau verapamilis neturėjo tokio paties poveikio kai kurių ginsenozidų (pvz., Rg1, F1, Rh1 ir Re) ištekėjimui, o tai rodo, kad jų neveikia P-gp substratai, kaip parodė Liang ir kt.32 .Šis stebėjimas gali būti susijęs su kitų transporterių ir alternatyvių ginsenozido struktūrų dalyvavimu.
Prevencinio G-Rg3 poveikio vėžiui mechanizmas neaiškus.Ankstesni tyrimai parodė, kad G-Rg3 apsaugo nuo DNR pažeidimo ir apoptozės, sumažindamas oksidacinį stresą ir uždegimą 16, 33, o tai gali būti pagrindinis B (a) P sukeltos naviko atsiradimo prevencijos mechanizmas.Kai kurios ataskaitos rodo, kad B(a)P sukeltas genotoksiškumas gali būti sumažintas moduliuojant II fazės fermentus, kad susidarytų BPDE-DNR34.GST yra tipiškas II fazės fermentas, kuris slopina BPDE-DNR adukto susidarymą skatindamas GSH prisijungimą prie BPDE ir taip sumažindamas B(a)P35 sukeltą DNR pažeidimą.Mūsų rezultatai rodo, kad gydymas G-Rg3 sumažina B (a) P sukeltą citotoksiškumą ir BPDE-DNR aduktų susidarymą hEL ląstelėse ir atkuria GST ekspresiją ir aktyvumą in vitro.Tačiau šio poveikio nebuvo, nesant Nrf2, o tai rodo, kad G-Rg3 sukelia citoprotekcinį poveikį per Nrf2 kelią.Nrf2 yra pagrindinis II fazės detoksikacijos fermentų transkripcijos faktorius, skatinantis ksenobiotikų klirensą36.Nrf2 kelio aktyvinimas sukelia citoprotekciją ir sumažina audinių pažeidimą37.Be to, keli pranešimai patvirtino Nrf2, kaip naviko slopintojo, vaidmenį kancerogenezėje38.Mūsų tyrimas rodo, kad Nrf2 kelio indukcija G-Rg3 vaidina svarbų reguliuojantį vaidmenį B (a) P sukeltame genotoksiškume, nes sukelia B (a) P detoksikaciją aktyvindamas II fazės fermentus, taip slopindamas navikogenezės procesą.
Mūsų darbas atskleidžia raudonojo ženšenio potencialą užkertant kelią B (a) P sukeltam plaučių vėžiui pelėms, dalyvaujant ginsenozidui G-Rg3.Prastas šios molekulės biologinis prieinamumas per burną apsunkina jos klinikinį taikymą.Tačiau šis tyrimas pirmą kartą parodo, kad G-Rg3 yra P-gp substratas, o P-gp inhibitoriaus skyrimas padidina G-Rg3 biologinį prieinamumą in vitro ir in vivo.G-Rg3 sumažina B (a) P sukeltą citotoksiškumą reguliuodamas Nrf2 kelią, kuris gali būti galimas jo prevencinės funkcijos mechanizmas.Mūsų tyrimas patvirtina ginsenozido G-Rg3 potencialą plaučių vėžio profilaktikai ir gydymui.
Šešių savaičių A/J pelių patelės (20 ± 1 g) ir 7 savaičių Wistar žiurkių patinai (250 ± 20 g) buvo gauti iš The Jackson Laboratory (Bar Harbor, JAV) ir Uhano zoologijos instituto.Universitetas (Uhanas, Kinija).Kinijos tipo kultūros rinkimo centras (Uhanas, Kinija) suteikė mums Caco-2 ir hEL ląstelių.Sigma-Aldrich (Sent Luisas, JAV) yra B(a)P ir trikaprino šaltinis.Išgryninti ginsenozidai G-Rg3r ir G-Rg3s, dimetilsulfoksidas (DMSO), CellTiter-96 proliferacijos tyrimo rinkinys (MTS), verapamilis, minimali esminė terpė (MEM) ir galvijų vaisiaus serumas (FBS) buvo įsigyti iš Chengdu Must Bio-Technology. .Co., Ltd.(Čengdu, Kinija).QIAamp DNR mini rinkinys ir BPDE-DNA addukto ELISA rinkinys buvo įsigyti iš Qiagen (Stanfordas, CA, JAV) ir Cell Biolabs (San Diegas, CA, JAV).GST aktyvumo tyrimo rinkinys ir viso baltymo tyrimo rinkinys (standartinis BCA metodas) buvo įsigyti iš Solarbio (Pekinas, Kinija).Visi raudonojo ženšenio ekstraktai saugomi Mingyu Laboratory 7. Honkongo baptistų universitetas (Honkongas, Kinija) ir Korėjos vėžio centras (Seulas, Korėja) yra komerciniai CRG ekstrakto ir įvairių Korėjos kilmės įvairių raudonųjų ženšenio ekstraktų (įskaitant KRGA, KRGB) šaltiniai. ir KRGC).Raudonasis ženšenis gaminamas iš 6 metų senumo šviežio ženšenio šaknų.Raudonojo ženšenio ekstraktas gaunamas tris kartus plaunant ženšenį vandeniu, po to vandeninį ekstraktą koncentruojant ir galiausiai džiovinant žemoje temperatūroje, kad būtų gauti ženšenio ekstrakto milteliai.Antikūnai (anti-Nrf2, anti-GST ir β-aktinas), krienų peroksidaze konjuguotas anti-triušio imunoglobulinas G (IgG), transfekcijos reagentas, kontrolinė siRNR ir Nrf2 siRNR buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). .), JAV).
Caco2 ir hEL ląstelės buvo kultivuojamos 100 mm2 ląstelių kultūros lėkštelėse su MEM, turinčia 10% FBS, 37 °C temperatūroje drėgnoje 5% CO2 atmosferoje.Norint nustatyti gydymo sąlygų poveikį, hEL ląstelės buvo inkubuojamos su skirtingomis B (a) P ir G-Rg3 koncentracijomis MEM 48 valandas.Ląstelės gali būti toliau analizuojamos arba renkamos, kad būtų paruošti ekstraktai be ląstelių.
Visus eksperimentus patvirtino Huazhongo mokslo ir technologijos universiteto Tongji medicinos koledžo Eksperimentinių gyvūnų etikos komitetas (patvirtinimo Nr. 2019; registracijos Nr. 4587TH).Visi eksperimentai buvo atlikti pagal atitinkamas gaires ir reglamentus, o tyrimas buvo atliktas pagal Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) gaires.Aštuonių savaičių A / J pelėms pirmą kartą intraperitoniniu būdu buvo sušvirkšta B (a) P trikaprino tirpale (100 mg / kg, 0, 2 ml).Po savaitės pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į kontrolines ir skirtingas gydymo grupes, po 15 pelių kiekvienoje grupėje ir zonduojamos kartą per dieną.Po 20 gydymo savaičių gyvūnai buvo nužudyti dėl CO2 asfiksijos.Plaučiai buvo surinkti ir fiksuoti 24 valandas.Paviršinių navikų skaičius ir atskirų navikų dydžiai buvo kiekybiškai įvertinti kiekvienam plaučiui, naudojant išardantį mikroskopą.Naviko tūrio įverčiai (V) buvo apskaičiuoti naudojant šią išraišką: V (mm3) = 4/3πr3, kur r yra naviko skersmuo.Grynoji visų naviko tūrių suma pelių plaučiuose sudarė bendrą naviko tūrį, o vidutinis bendras naviko tūris kiekvienoje grupėje – naviko apkrova.Viso kraujo ir žarnyno mėginiai buvo paimti ir laikomi –80 °C temperatūroje UPLC-MS/MS nustatymui.Buvo surinktas serumas ir automatinis chemijos analizatorius buvo naudojamas alanino aminotransferazės (ALT) ir kreatinino (Cr) kiekiui serume analizuoti, siekiant įvertinti kepenų ir inkstų funkciją.
Paimti mėginiai buvo išimti iš šaldymo saugyklos, atšildyti, pasverti ir sudėti į mėgintuvėlius, kaip aprašyta aukščiau.Į jį buvo pridėta 0,5 μM phlorizin (vidinis standartas) 0,8 ml metanolio tirpalo.Tada audinys buvo homogenizuotas naudojant „Tissue-Tearor“, o homogenatas perkeltas į 1, 5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį.Mišinys centrifuguojamas 15 500 aps./min. greičiu 15 minučių.Pašalinus 1,0 ml supernatanto, išdžiovinkite azotu.Regeneracijai panaudoti du šimtai mikrolitrų metanolio.Kraujas surenkamas ir apdorojamas vienoje linijoje ir naudojamas kaip atskaitos taškas atliekant visus matavimus.
24 šulinėlių Transwell plokštelės buvo pasėtos su 1, 0 × 105 Caco-2 ląstelių vienoje duobutėje, kad būtų galima įvertinti galimą G-Rg3 transportavimo padidėjimą pridedant verapamilio.Po 3 savaičių kultivavimo ląstelės buvo plaunamos HBSS ir iš anksto inkubuojamos 37 ° C temperatūroje.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s arba mišinio su 50 arba 100 μM verapamiliu) buvo švirkščiama į bazolaterinę arba viršūninę vienasluoksnio sluoksnio pusę, o į kitą - 600 μL HBSS tirpalo. pusėje.Nurodytu laiku (0, 15, 30, 45, 60, 90 ir 120 minučių) surinkite 100 µl auginimo terpės ir įpilkite 100 µl HBSS, kad užpildytumėte šį tūrį.Mėginiai buvo laikomi –4 °C temperatūroje iki aptikimo UPLC-MS/MS.Išraiška Papp = dQ/(dT × A × C0) naudojama tariamam vienakrypčiui viršūniniam ir bazolateriniam pralaidumui įvertinti ir atvirkščiai (atitinkamai Pa-b ir Pb-a);dQ/dT yra koncentracijos pokytis, A (0,6 cm2) yra monosluoksnio paviršiaus plotas, o C0 yra pradinė donoro koncentracija.Ištekėjimo santykis apskaičiuojamas kaip Pb-a/Pa-b, kuris parodo tiriamojo vaisto ištekėjimo greitį.
Wistar žiurkių patinai buvo nevalgę 24 valandas, gėrė tik vandenį ir anestezavo į veną 3,5% pentobarbitalio tirpalo injekcija.Intubuoto silikoninio vamzdelio įėjimas yra dvylikapirštės žarnos galas, o išėjimas – klubinės žarnos galas.Naudokite peristaltinį siurblį, kad į įvadą siurbtumėte 10 µM G-Rg3r arba G-Rg3s izotoniniame HBSS, esant 0,1 ml/min srauto greičiui.Verapamilio poveikis buvo įvertintas pridedant 50 μM arba 100 μM junginio į 10 μM G-Rg3r arba G-Rg3s.UPLC-MS/MS buvo atlikta su perfuzijos ekstraktais, surinktais 60, 90, 120 ir 150 minučių nuo perfuzijos pradžios.Absorbcijos procentinė dalis kiekybiškai apskaičiuojama pagal formulę absorbcija % = (1 – Cout/Cin) × 100 %;G-Rg3 koncentracija išleidimo ir įleidimo angoje išreiškiama atitinkamai Cout ir Cin.
hEL ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 1 × 104 ląstelės, ir apdorotos B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) arba G-Rg3, ištirpintu DMSO. .Tada vaistai buvo praskiedžiami auginimo terpe iki įvairių koncentracijų (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) per 48 valandas.Naudojant komerciškai prieinamą MTS tyrimo rinkinį, ląstelėms buvo taikomas standartinis protokolas, o po to matuojamas naudojant mikroplokštelių skaitytuvą esant 490 nm.B(a)P (10 μM) ir G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) kartu apdorotų grupių ląstelių gyvybingumo lygis buvo įvertintas aukščiau nurodytu metodu ir lyginamas su negydyta grupe.
hEL ląstelės buvo pasėtos į 6 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 1 × 105 ląstelės / duobutėje, ir apdorotos 10 μMB (a) P, kai yra 10 μM G-Rg3 arba jo nėra.Po 48 valandų gydymo DNR buvo išskirta iš hEL ląstelių naudojant QIAamp DNA Mini Kit pagal gamintojo protokolą.BPDE-DNR aduktų susidarymas buvo aptiktas naudojant BPDE-DNR aduktų ELISA rinkinį.Santykinis BPDE-DNR adukto lygis buvo išmatuotas naudojant mikroplokštelių skaitytuvą, matuojant absorbciją esant 450 nm.
hEL ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 1 × 104 ląstelių viename šulinyje, ir 48 valandas apdorotos 10 μMB (a) P, kai nėra arba yra 10 μM G-Rg3.GST aktyvumas buvo matuojamas naudojant komercinį GST aktyvumo tyrimo rinkinį pagal gamintojo protokolą.Santykinis GST aktyvavimas buvo matuojamas pagal absorbciją esant 450 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.
hEL ląstelės buvo plaunamos lediniu PBS ir po to lizuojamos naudojant radioimunoprecipitacijos tyrimo buferį, kuriame yra proteazės inhibitorių ir fosfatazės inhibitorių.Po baltymų kiekybinio įvertinimo naudojant viso baltymo tyrimo rinkinį, 30 μg baltymų kiekviename mėginyje buvo atskirta 12% SDS-PAGE ir perkelta į PVDF membraną elektroforezės būdu.Membranos buvo užblokuotos 5% nugriebto pieno ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje.Po inkubacijos su krienų peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais buvo pridėta sustiprintų chemiliuminescencinių reagentų, kad būtų galima vizualizuoti prisijungimo signalą.Kiekvienos baltymų juostos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant ImageJ programinę įrangą.
GraphPad Prism 7.0 programinė įranga buvo naudojama visiems duomenims, išreikštiems vidurkiu ± standartinis nuokrypis, analizuoti.Skirtumas tarp gydymo grupių buvo įvertintas naudojant Stjudento t testą arba vienpusę dispersijos analizę, kai P reikšmė <0,05 rodo statistinį reikšmingumą.
Visi šio tyrimo metu gauti arba išanalizuoti duomenys yra įtraukti į šį paskelbtą straipsnį ir papildomos informacijos failus.
Torre, LA, Siegel, RL ir Jemal, A. Plaučių vėžio statistika.prieveiksmis.Baigėsi galiojimo laikas.vaistas.biologija.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tabako kancerogenai, jų biomarkeriai ir tabako sukeltas vėžys.Nat.Vėžio kapelionas.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH ir Venitt, S. DNR ir baltymų aduktai žmogaus audiniuose, atsirandantys dėl tabako dūmų poveikio.tarptautiškumas.J. Vėžys.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA ir Yu M. Houttuynia cordata ir silibinino poveikis benzo (a) pireno sukeltai plaučių naviko atsiradimui A / J pelėse.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. ir kt.Natūralus priešvėžinis produktas, išskirtas iš Kinijos vaistinių medžiagų.žandikaulis.vaistas.6, 27 (2011).
Yang, Y. ir kt.Polifenono E, raudonojo ženšenio ir rapamicino veiksmingumas benzo (a) pireno sukeltai plaučių navikogenezei A / J pelėms.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS ir Yuan, KS Red, dalyvavimas vėžio terapijoje.žandikaulis.J. Nutt.vaistas.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS ir Gao, L. Ginsenosides amerikinio ženšenio šaknyse ir lapuose.J. Agrič.Maisto chemija.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA ir Yuan KS Ženšenio farmakologija: daug komponentų ir daug poveikių.biochemija.farmakologija.58, 1685–1693 (1999).
Paskelbimo laikas: 2023-09-17