Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai iegūtu vislabākos rezultātus, ieteicams izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stila vai JavaScript.
Sarkanais žeņšeņs ir izmantots tradicionālajā Āzijas medicīnā simtiem gadu.Šajā pētījumā mēs novērtējām četru veidu sarkanā žeņšeņa (Ķīnas sarkanā žeņšeņa, Korejas sarkanā žeņšeņa A, Korejas sarkanā žeņšeņa B un Korejas sarkanā žeņšeņa C), kas audzēti dažādos reģionos, spēju kavēt kancerogēnu izraisītu plaušu veidošanos un augšanu. audzēji.Ar A/J pelēm tika veikts benzo(a)pirēna (B(a)P) tests, un tika konstatēts, ka Korejas sarkanais žeņšeņs B ir visefektīvākais audzēja slodzes mazināšanā starp četrām sarkanā žeņšeņa šķirnēm.Turklāt mēs analizējām dažādu žeņšeņosīdu (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 un Rg5) saturu četros sarkanā žeņšeņa ekstraktos un atklājām, ka Korejas sarkanajam žeņšeņam B ir. visaugstākais ginsenosīda Rg3 (G-Rg3) līmenis, kas liecina, ka G-Rg3 var būt nozīmīga loma tā terapeitiskajā iedarbībā.Šis darbs parāda, ka G-Rg3 ir salīdzinoši zema bioloģiskā pieejamība.Tomēr, ja G-Rg3 tika ievadīts kopā ar P-gp inhibitoru verapamilu, G-Rg3 izplūde Caco-2 šūnās tika samazināta, G-Rg3 absorbcijas ātrums zarnās palielinājās žurku modelī un G-Rg3. tika palielināts.Caco-2 šūnās samazinās Rg3 aizplūšana un samazinās Rg3 koncentrācijas līmenis.G-Rg3 ir palielināts zarnās un plazmā, un tā spēja novērst audzējus ir uzlabota arī B (a) P izraisītas audzēja ģenēzes žurku modelī.Mēs arī atklājām, ka G-Rg3 samazināja B (a) P izraisītu citotoksicitāti un DNS adduktu veidošanos cilvēka plaušu šūnās un atjaunoja II fāzes enzīmu ekspresiju un aktivitāti caur Nrf2 ceļu, kas var būt saistīts ar iespējamo darbības mehānismu. no G inhibīcijas -Rg3..Par plaušu audzēju rašanos.Mūsu pētījums parāda G-Rg3 potenciāli svarīgo lomu plaušu audzēju mērķēšanai peles modeļos.Šī ginsenozīda perorālā biopieejamība tiek uzlabota, mērķējot uz P-glikoproteīnu, ļaujot molekulai iedarboties pret vēzi.
Visizplatītākais plaušu vēža veids ir nesīkšūnu plaušu vēzis (NSCLC), kas ir viens no galvenajiem vēža izraisīto nāves gadījumu cēloņiem Ķīnā un Ziemeļamerikā1,2.Galvenais faktors, kas palielina nesīkšūnu plaušu vēža attīstības risku, ir smēķēšana.Cigarešu dūmi satur vairāk nekā 60 kancerogēnu, tostarp benzo(a)pirēnu (B(a)P), nitrozamīnus un radona sabrukšanas radītos radioaktīvos izotopus.3 Policikliskie aromātiskie ogļūdeņraži B(a)P ir galvenais cigarešu toksicitātes cēlonis. dūmi.Iedarbojoties ar B(a)P, citohroms P450 pārvērš to par B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksīdu (BPDE), kas reaģē ar DNS, veidojot BPDE-DNS aduktu 4. Turklāt šie addukti inducē plaušu audzēju ģenēzi pelēm ar audzēja stadiju un histopatoloģiju, kas līdzīga cilvēka plaušu audzējiem5.Šī funkcija padara B (a) P izraisītu plaušu vēža modeli par piemērotu sistēmu savienojumu ar iespējamām pretvēža īpašībām novērtēšanai.
Viena no iespējamām stratēģijām, lai novērstu plaušu vēža attīstību augsta riska grupās, īpaši smēķētājiem, ir ķīmijpreventīvu līdzekļu lietošana, lai nomāktu intraepitēlija neoplastisku bojājumu attīstību un tādējādi novērstu to turpmāku progresēšanu ļaundabīgā audzējā.Pētījumi ar dzīvniekiem liecina, ka dažādi ķīmiski profilaktiski līdzekļi ir efektīvi6.Mūsu iepriekšējā ziņojumā7 tika uzsvērta sarkanā žeņšeņa labā profilaktiskā ietekme uz plaušu vēzi.Šis augs ir izmantots gadsimtiem ilgi tradicionālajā Āzijas medicīnā, lai pagarinātu dzīvi un veselību, un tam ir dokumentēta pretvēža iedarbība8.
Žeņšeņa aktīvais faktors ir žeņsenozīds, ko izmanto kā saliktu marķieri, lai novērtētu žeņšeņa ekstraktu kvalitāti.Neapstrādātu žeņšeņa ekstraktu kvantitatīvā analīze parasti ietver vairāku ginsenosīdu izmantošanu, tostarp RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 un Rc9,10.Ginsenosīdus klīniski izmanto maz, jo tie ir ļoti vāji iekšķīgi lietojami11.Lai gan šīs sliktās biopieejamības mehānisms nav skaidrs, iemesls var būt P-glikoproteīna (P-gp)12 izraisītā ginsenozīdu izplūde.P-gp ir viens no svarīgākajiem izplūdes transportētājiem ATP saistošo kasešu transportētāju superģimenē, kas izmanto ATP hidrolīzes enerģiju, lai ārējā vidē izdalītu intracelulāras vielas.P-gp transportētāji parasti ir plaši izplatīti zarnu, nieru, aknu un hematoencefālisko barjerā13.P-gp ir izšķiroša nozīme uzsūkšanās procesā zarnās, un P-gp inhibīcija palielina dažu pretvēža zāļu perorālo uzsūkšanos un pieejamību12,14.Iepriekš literatūrā lietoto inhibitoru piemēri ir verapamils un ciklosporīns A15.Šis darbs ietver peles sistēmas izveidi B (a) P izraisīta plaušu vēža pētīšanai, lai novērtētu dažādu sarkano žeņšeņa ekstraktu no Ķīnas un Korejas spēju ietekmēt ļaundabīgos audzējus.Ekstrakti tika atsevišķi analizēti, lai noteiktu specifiskus ginsenosīdus, kas var ietekmēt kanceroģenēzi.Pēc tam verapamilu izmantoja, lai mērķētu uz P-gp un uzlabotu uz vēzi vērstu ginsenozīdu perorālo bioloģisko pieejamību un terapeitisko efektivitāti.
Mehānisms, ar kuru žeņšeņa saponīniem ir terapeitiska iedarbība uz kanceroģenēzi, joprojām nav skaidrs.Pētījumi liecina, ka dažādi ginsenosīdi var samazināt DNS bojājumus, ko izraisa kancerogēni, samazinot oksidatīvo stresu un aktivizējot II fāzes detoksikācijas enzīmus, tādējādi novēršot šūnu bojājumus.Glutationa S-transferāze (GST) ir tipisks II fāzes enzīms, kas nepieciešams, lai samazinātu kancerogēnu izraisītus DNS bojājumus17.Ar nukleāro eritroīdu 2 saistītais faktors 2 (Nrf2) ir svarīgs transkripcijas faktors, kas regulē redoksu homeostāzi un aktivizē II fāzes enzīmu ekspresiju un citoprotektīvas antioksidantu atbildes reakcijas18.Mūsu pētījumā tika pārbaudīta arī identificēto ginsenosīdu ietekme uz B (a) P izraisītas citotoksicitātes samazināšanu un BPDE-DNS adduktu veidošanos, kā arī II fāzes enzīmu inducēšana, modulējot Nrf2 ceļu normālās plaušu šūnās.
B (a) P izraisīta vēža peles modeļa izveide atbilst iepriekšējam darbam5.1.A attēlā parādīts eksperimentālais plānojums 20 nedēļu ārstēšanai ar peles vēža modeli, ko izraisīja B(a)P, ūdens (kontrole), Ķīnas sarkanā žeņšeņa ekstrakts (CRG), Korejas sarkanā žeņšeņa ekstrakts A (KRGA) un Korejas sarkanais. žeņšeņs.Ekstrakts B (KRGB) un Korejas sarkanā žeņšeņa ekstrakts C (KRGC).Pēc 20 nedēļu ilgas sarkanā žeņšeņa ārstēšanas peles tika nogalinātas ar CO2 nosmakšanu.1.B attēlā parādīti makroskopiski plaušu audzēji dzīvniekiem, kas ārstēti ar dažāda veida sarkano žeņšeņu, un 1.C attēlā parādīts reprezentatīvs audzēja parauga gaismas mikrogrāfs.Ar KRGB ārstēto dzīvnieku audzēju slodze (1, 5 ± 0, 35) bija zemāka nekā kontroles dzīvniekiem (0, 82 ± 0, 2, P < 0, 05), kā parādīts 1.D attēlā.Vidējā audzēja slodzes inhibīcijas pakāpe bija 45%.Citi pārbaudītie sarkanā žeņšeņa ekstrakti neuzrādīja tik nozīmīgas audzēja slodzes izmaiņas (P > 0,05).Peles modelī 20 nedēļu ilgas sarkanā žeņšeņa terapijas laikā netika novērotas acīmredzamas blakusparādības, tostarp ķermeņa svara izmaiņas (dati nav parādīti) un aknu vai nieru toksicitāte (1. E, F attēls).
Sarkanā žeņšeņa ekstrakts ārstē plaušu audzēju attīstību A/J pelēm.(A) Eksperimentālais dizains.(B) Lieli plaušu audzēji peles modelī.Audzēji ir norādīti ar bultiņām.a: Ķīnas sarkanā žeņšeņa grupa.b: Korejas sarkanā žeņšeņa A grupa.c: Korejas sarkanā žeņšeņa grupa B. d: Korejas sarkanā žeņšeņa grupa C. d: Kontroles grupa.(C) Gaismas mikrogrāfs, kas parāda plaušu audzēju.Palielinājums: 100. b: 400. (D) Audzēja slodze sarkanā žeņšeņa ekstrakta grupā.(E) aknu enzīma ALT līmenis plazmā.(F) Nieru enzīma Cr līmenis plazmā.Dati ir izteikti kā vidējā ± standartnovirze.*P <0,05.
Šajā pētījumā identificētie sarkanā žeņšeņa ekstrakti tika analizēti ar ultraefektīvās šķidruma hromatogrāfijas tandēma masas spektrometriju (UPLC-MS/MS), lai kvantitatīvi noteiktu šādus ginsenosīdus: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 un Rg5.UPLC un MS apstākļi, kas izmantoti analītu mērīšanai, tika aprakstīti iepriekšējā ziņojumā19.Četru sarkanā žeņšeņa ekstraktu UPLC-MS/MS hromatogrammas ir parādītas 2.A attēlā.Bija būtiskas atšķirības kopējā ginsenosīda saturā ar augstāko kopējo ginsenosīda saturu CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (2.B attēls).Novērtējot atsevišķus ginsenosīdus (2.C attēls), KRGB uzrādīja augstāko G-Rg3 līmeni salīdzinājumā ar citiem ginsenosīdiem (58,33 ± 3,81 μmol/L G-Rg3 un 41,56 ± 2,88 μmol/L G -Rg3r).sarkanā žeņšeņa tips (P < 0,001).G-Rg3 sastopams kā stereoizomēru pāris G-Rg3r un G-Rg3s, kas atšķiras ar hidroksilgrupas stāvokli pie oglekļa atoma 20 (att. 2D).Rezultāti liecina, ka G-Rg3r vai G-Rg3 var būt nozīmīgs pretvēža potenciāls B (a) P izraisītā vēža peles modelī.
Žensenozīdu saturs dažādos sarkanā žeņšeņa ekstraktos.(A) Četru sarkanā žeņšeņa ekstraktu UPLC-MS/MS hromatogrammas.(B) Kopējā ginsenosīda satura novērtējums norādītajos ekstraktos.(C) Atsevišķu ginsenosīdu noteikšana marķētos ekstraktos.(D) Ginsenosīda stereoizomēru G-Rg3r un G-Rg3s struktūras.Datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi no trīskāršām noteikšanām.***P <0,001.
UPLC-MS/MS pētījumā bija nepieciešams kvantitatīvi noteikt ginsenozīdu daudzumu zarnu un asins paraugos pēc 20 nedēļu ilgas ārstēšanas.Ārstēšana ar KRGB parādīja tikai 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 klātbūtni asinīs.Atlikušie ginsenosīdi netika atklāti, kas liecina par sliktu perorālo biopieejamību un tādējādi samazinātu šo ginsenosīdu iedarbību.
Resnās zarnas adenokarcinomas šūnu līnija Caco-2 ir morfoloģiski un bioķīmiski līdzīga cilvēka zarnu epitēlija šūnām, parādot tās lietderību, novērtējot enterocītu transportu caur zarnu epitēlija barjeru.Šīs analīzes pamatā bija agrāks pētījums 20 .Attēlos 3A, B, C, D, E, F ir parādīti reprezentatīvi G-Rg3r un G-Rg3 transcelulārā transporta attēli, izmantojot Caco-2 monoslāņa modeli.G-Rg3r vai G-Rg3 transcelulārā transportēšana caur Caco-2 monoslāņiem no bazolaterālās uz apikālo pusi (Pb-a) bija ievērojami augstāka nekā no apikālās uz bazolaterālo pusi (Pa-b).G-Rg3r vidējā Pa-b vērtība bija 0,38 ± 0,06, kas palielinājās līdz 0,73 ± 0,06 pēc apstrādes ar 50 μmol/L verapamilu un līdz 1,14 ± 0,09 pēc apstrādes ar 100 μmol/L verapamilu (p < ,0,01 un 0,01 attiecīgi 2. attēls).3A).G-Rg3 novērojumi sekoja līdzīgam modelim (3.B att.), un rezultāti parādīja, ka ārstēšana ar verapamilu uzlaboja G-Rg3r un G-Rg3 transportēšanu.Ārstēšana ar verapamilu arī izraisīja ievērojamu vidējo Pb-a un G-Rg3r un G-Rg3 izplūdes attiecību samazināšanos (3.C, D, E, F attēls), norādot, ka ārstēšana ar verapamilu samazina ginsenosīda saturu Caco-2 izplūdes šūnās..
G-Rg3 transcelulārais transports Caco-2 monoslāņos un absorbcija zarnās žurku perfūzijas testā.(A) G-Rg3r grupas Pa-b vērtība Caco-2 monoslānī.(B) G-Rg3s grupu Pa-b vērtība Caco-2 monoslānī.(C) G-Rg3r grupas Pb vērtība Caco-2 monoslānī.(D) G-Rg3s grupu Pb vērtība Caco-2 monoslānī.(E) G-Rg3r grupu iznākuma attiecība Caco-2 monoslānī.(F) G-Rg3 grupu iznākuma attiecība Caco-2 monoslānī.(G) G-Rg3r absorbcijas zarnās procentuālā daļa perfūzijas testā žurkām.(H) G-Rg3 absorbcijas zarnās procentuālā daļa perfūzijas testā žurkām.Caurlaidību un uzsūkšanos salīdzināja bez verapamila pievienošanas.Dati ir izteikti kā piecu neatkarīgu eksperimentu vidējā ± standarta novirze.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Saskaņā ar iepriekšējo darbu20 tika veikta žurku ortotopiskā zarnu perfūzija, lai noteiktu, vai pēc ārstēšanas ar verapamilu palielinās G-Rg3 uzsūkšanās zarnās.Attēli 3G, H parāda reprezentatīvus perfūzijas testus, lai novērtētu G-Rg3r un G-Rg3 absorbcijas zarnās procentuālo daudzumu vēža modeļa žurkām iepriekšminētajos laika periodos.Sākotnējais vājā G-Rg3r uzņemšanas procents aptuveni 10% apmērā palielinājās līdz vairāk nekā 20% pēc apstrādes ar 50 μM verapamilu un līdz vairāk nekā 25% pēc apstrādes ar 100 μM verapamilu.Tāpat G-Rg3, kura sākotnējā uzņemšana bija 10%, arī pēc apstrādes ar 50 μM verapamilu uzrādīja maksimumu virs 20% un gandrīz 30% pēc apstrādes ar 100 μM verapamilu, kas liecina, ka verapamila izraisītā P-gp inhibīcija pastiprina. zarnu G absorbcija Rg3 plaušu vēža peles modelī.
Saskaņā ar iepriekš minēto metodi B (a) P izraisītas vēža modeļa peles tika nejauši sadalītas sešās grupās, kā parādīts 4.A attēlā.G-Rg3 terapijas grupā, salīdzinot ar kontroles grupu, netika novērots būtisks svara zudums vai klīniskas toksicitātes pazīmes (dati nav parādīti).Pēc 20 nedēļu ilgas ārstēšanas katras peles plaušas tika savāktas.4B attēlā parādīti makroskopiski plaušu audzēji pelēm iepriekš minētajās ārstēšanas grupās, un 4C attēlā parādīts reprezentatīva audzēja gaismas mikrogrāfs.Attiecībā uz audzēja slodzi katrā grupā (4. D attēls) vērtības pelēm, kas tika ārstētas ar G-Rg3r un G-Rg3, bija attiecīgi 0,75 ± 0,29 mm3 un 0,81 ± 0,30 mm3, savukārt vērtības G-pelēm, kuras tika ārstētas. ar -Rg3s bija attiecīgi 1,63 ±0,40 mm3.kontroles pelēm (p <0,001), norādot, ka ārstēšana ar G-Rg3 samazināja audzēja slodzi pelēm.Verapamila ievadīšana vēl vairāk pastiprināja šo samazinājumu: verapamils+ G-Rg3r pelēm vērtības samazinājās no 0,75 ± 0,29 mm3 līdz 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), un verapamila+ vērtības no 0,81 ± 0,30 mm2 samazinājās līdz 1,9. mm3 ar G. -Rg3s ārstētām pelēm (p < 0,05), kas norāda, ka verapamils var pastiprināt G-Rg3 inhibējošo iedarbību uz audzēja ģenēzi.Audzēja slodze neuzrādīja būtiskas atšķirības starp kontroles grupu un verapamila grupu, G-Rg3r grupu un G-Rg3s grupu, kā arī verapamila + G-Rg3r grupu un verapamila + G-Rg3s grupu.Turklāt ar novērtēto ārstēšanu nebija nozīmīgas aknu vai nieru toksicitātes (attēls 4E, F).
Audzēja slodze pēc G-Rg3 ārstēšanas un G-Rg3r un G-Rg3 līmenis plazmā vai zarnās norādītajās grupās.(A) Eksperimentālais dizains.(B) Makroskopiski audzēji peles modelī.Audzēji ir norādīti ar bultiņām.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r kombinācijā ar verapamilu.d: G-Rg3 kombinācijā ar verapamilu.d: Verapamils.e: kontrole.(C) audzēja optiskā mikrogrāfija palielinājumā.Atbilde: 100x.b: 400X.(D) G-Rg3 + verapamila ārstēšanas ietekme uz audzēja slodzi A / J pelēm.(E) aknu enzīma ALT līmenis plazmā.(F) Nieru enzīma Cr līmenis plazmā.(G) Norādīto grupu G-Rg3r vai G-Rg3 līmenis plazmā.(H) G-Rg3r vai G-Rg3 līmenis norādīto grupu zarnās.Datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi no trīskāršām noteikšanām.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3 līmenis B(a)P izraisīta vēža modeļa pelēm tika novērtēts ar UPLC-MS/MS pēc 20 nedēļu ārstēšanas perioda saskaņā ar metodi, kas aprakstīta sadaļā Metodes.Attēlos 4G un H parādīts attiecīgi plazmas un zarnu G-Rg3 līmenis.G-Rg3r līmenis plazmā bija 0,44 ± 0,32 μmol/L un palielinājās līdz 1,17 ± 0,47 μmol/L, vienlaikus lietojot verapamilu (p < 0,001), savukārt G-Rg3r līmenis zarnās bija 0,53 ± 0,08 µg/l.Kombinācijā ar verapamilu g palielinājās līdz 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Attiecībā uz G-Rg3 rezultāti bija līdzīgi, norādot, ka ārstēšana ar verapamilu palielināja G-Rg3 perorālo biopieejamību A/J pelēm.
Lai novērtētu B (a) P un G-Rg3 citotoksicitāti uz hEL šūnām, tika izmantots šūnu dzīvotspējas tests.B(a)P izraisītā citotoksicitāte hEL šūnās ir parādīta 5.A attēlā, savukārt G-Rg3r un G-Rg3 netoksiskās īpašības ir parādītas 5.A un 5.B attēlā.5B, C. Lai novērtētu G-Rg3 citoprotektīvo efektu, B(a)P hEL šūnās tika ievadīts kopā ar dažādām G-Rg3r vai G-Rg3 koncentrācijām.Kā parādīts 5.D attēlā, G-Rg3r koncentrācijās 5 μM, 10 μM un 20 μM atjaunoja šūnu dzīvotspēju attiecīgi līdz 58,3%, 79,3% un 77,3%.Līdzīgus rezultātus var redzēt arī G-Rg3s grupā.Kad G-Rg3 koncentrācija bija 5 µM, 10 µM un 20 µM, šūnu dzīvotspēja tika atjaunota attiecīgi līdz 58,3%, 72,7% un 76,7% (attēls 5E).).BPDE-DNS aduktu klātbūtne tika mērīta, izmantojot ELISA komplektu.Mūsu rezultāti parādīja, ka BPDE-DNS adduktu līmenis bija paaugstināts B(a)P ārstētajā grupā, salīdzinot ar kontroles grupu, bet, salīdzinot ar G-Rg3 vienlaicīgu ārstēšanu, BPDE-DNS adduktu līmenis B(a)P grupā. B apstrādātajā grupā DNS adduktu līmenis tika ievērojami samazināts.Ārstēšanas ar B(a)P tikai rezultāti ir parādīti 5.F attēlā (1,87 ± 0,33 pret 3,77 ± 0,42 G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 pret 3,77 ± 0,42 G -Rg3s, p < 0,001).
Šūnu dzīvotspēja un BPDE-DNS aduktu veidošanās hEL šūnās, kas apstrādātas ar G-Rg3 un B(a)P.(A) ar B(a)P apstrādāto hEL šūnu dzīvotspēja.(B) ar G-Rg3r apstrādāto hEL šūnu dzīvotspēja.(C) ar G-Rg3 apstrādāto hEL šūnu dzīvotspēja.(D) ar B(a)P un G-Rg3r apstrādāto hEL šūnu dzīvotspēja.(E) ar B(a)P un G-Rg3 apstrādātu hEL šūnu dzīvotspēja.(F) BPDE-DNS addukta līmeņi hEL šūnās, kas apstrādātas ar B(a)P un G-Rg3.Datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi no trīskāršām noteikšanām.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST enzīma ekspresija tika konstatēta pēc vienlaicīgas apstrādes ar 10 μM B (a) P un 10 μM G-Rg3r vai G-Rg3s.Mūsu rezultāti parādīja, ka B(a)P nomāca GST ekspresiju (59,7 ± 8,2% G-Rg3r grupā un 39 ± 4,5% G-Rg3s grupā), un B(a)P bija saistīts ar jebkuru no G-Rg3r. , vai ar G-Rg3r, vai ar G-Rg3r.Kopīga ārstēšana ar G-Rg3 atjaunoja GST ekspresiju.GST ekspresija (103,7 ± 15,5% G-Rg3r grupā un 110 ± 11,1% G-Rg3s grupā, attiecīgi p < 0,05 un p < 0,001, 6.A, B un C att.).GST aktivitāte tika novērtēta, izmantojot aktivitātes testa komplektu.Mūsu rezultāti parādīja, ka kombinētās terapijas grupai bija augstāka GST aktivitāte, salīdzinot ar tikai B(a)P grupu (96,3 ± 6,6% pret 35,7 ± 7,8% G-Rg3r grupā pret 92,3 ± 6,5 G-Rg3r grupā). ).% pret 35,7 ± 7,8% G-Rg3s grupā, p < 0,001, 6.D attēls).
GST un Nrf2 ekspresija hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3.(A) GST ekspresijas noteikšana ar Western blotēšanu.(B) GST kvantitatīvā ekspresija hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3r.(C) GST kvantitatīva ekspresija hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3.(D) GST aktivitāte hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3.(E) Nrf2 ekspresijas noteikšana ar Western blotēšanu.(F) Nrf2 kvantitatīvā ekspresija hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3r.(G) Nrf2 kvantitatīvā ekspresija hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3.Datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi no trīskāršām noteikšanām.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Lai noskaidrotu ceļus, kas saistīti ar G-Rg3 izraisītu B (a) P izraisītas audzēja ģenēzes nomākšanu, Nrf2 ekspresija tika novērtēta ar Western blotēšanu.Kā parādīts 6E, F, G attēlā, salīdzinot ar kontroles grupu, tikai Nrf2 līmenis B(a)P terapijas grupā bija pazemināts;tomēr, salīdzinot ar B(a)P terapijas grupu, B(a) Nrf2 līmenis PG-Rg3 grupā bija paaugstināts (106 ± 9,5% G-Rg3r pret 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2% G-Rg3r pret 41 ± 9,8% G-Rg3s, p < 0,01).
Mēs apstiprinājām Nrf2 profilaktisko lomu, nomācot Nrf2 ekspresiju, izmantojot specifisku mazu traucējošu RNS (siRNS).Nrf2 notriekšana tika apstiprināta ar Western blotēšanu (7.A, B att.).Kā parādīts 7C un D attēlā, hEL šūnu vienlaicīga apstrāde ar B(a)P un G-Rg3 izraisīja BPDE-DNS adduktu skaita samazināšanos (1,47 ± 0,21), salīdzinot ar ārstēšanu ar B(a)P. tikai kontroles siRNS grupā.) G-Rg3r bija 4,13 ± 0,49, G-Rg3s bija 1,8 ± 0,32 un 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Tomēr G-Rg3 inhibējošā iedarbība uz BPDE-DNS veidošanos tika atcelta ar Nrf2 notriekšanu.SiNrf2 grupā nebija būtiskas atšķirības BPDE-DNS adduktu veidošanā starp B(a)P un G-Rg3 vienlaicīgu ārstēšanu un tikai B(a)P ārstēšanu (3,0 ± 0,21 G-Rg3r pret 3,56 ± 0,32). ).G-Rg3r pret 3,6 G-Rg3s pret ±0,45 pret 4,0±0,37, p > 0,05).
Nrf2 notriekšanas ietekme uz BPDE-DNS adduktu veidošanos hEL šūnās.(A) Nrf2 notriekšana tika apstiprināta ar Western blotēšanu.(B) Nrf2 joslas intensitātes noteikšana.(C) Nrf2 notriekšanas ietekme uz BPDE-DNS addukta līmeni hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3r.(D) Nrf2 notriekšanas ietekme uz BPDE-DNS adduktu līmeni hEL šūnās, kas apstrādātas ar B (a) P un G-Rg3.Datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi no trīskāršām noteikšanām.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Šajā pētījumā tika novērtēta dažādu sarkano žeņšeņa ekstraktu profilaktiskā ietekme uz B (a) P izraisīta plaušu vēža peles modeli, un KRGB ārstēšana ievērojami samazināja audzēja slodzi.Ņemot vērā, ka G-Rg3 satur visaugstāko saturu šajā žeņšeņa ekstraktā, ir pētīta šī ginsenosīda svarīgā loma audzēja ģenēzes inhibēšanā.Gan G-Rg3r, gan G-Rg3 (divi G-Rg3 epimēri) ievērojami samazināja audzēja slodzi B (a) P izraisīta vēža peles modelī.G-Rg3r un G-Rg3 iedarbojas pret vēzi, izraisot audzēja šūnu apoptozi21, kavējot audzēja augšanu22, apturot šūnu ciklu23 un ietekmējot angiogenēzi24.Ir pierādīts, ka G-Rg3 arī inhibē šūnu metastāzes25, un ir dokumentēta G-Rg3 spēja uzlabot ķīmijterapijas un staru terapijas ietekmi 26, 27.Poon et al pierādīja, ka ārstēšana ar G-Rg3 var samazināt B (a) P28 genotoksisko iedarbību.Šis pētījums parāda G-Rg3 terapeitisko potenciālu, mērķējot uz vides kancerogēnām molekulām un novēršot vēzi.
Neskatoties uz to labo profilaktisko potenciālu, ginsenozīdu sliktā perorālā biopieejamība rada izaicinājumu šo molekulu klīniskai lietošanai.Perorālas ginsenozīdu lietošanas farmakokinētiskā analīze žurkām parādīja, ka tā biopieejamība joprojām ir mazāka par 5%29.Šie testi parādīja, ka pēc 20 nedēļu ārstēšanas perioda tikai Rg5 līmenis asinīs samazinājās.Lai gan sliktas biopieejamības pamatā esošais mehānisms vēl nav noskaidrots, tiek uzskatīts, ka P-gp ir iesaistīts ginsenozīdu izplūdē.Šis darbs pirmo reizi parādīja, ka verapamila, P-gp blokatora, ievadīšana palielina G-Rg3r un G-Rg3 perorālo biopieejamību.Tādējādi šis atklājums liecina, ka G-Rg3r un G-Rg3 darbojas kā P-gp substrāti, lai regulētu tā izplūdi.
Šis darbs parāda, ka kombinēta ārstēšana ar verapamilu palielina G-Rg3 perorālo biopieejamību plaušu vēža peles modelī.Šo konstatējumu apstiprina palielināts G-Rg3 zarnu transcelulārais transports pēc P-gp blokādes, tādējādi palielinot tā uzsūkšanos.Pārbaudes Caco2 šūnās parādīja, ka ārstēšana ar verapamilu samazināja G-Rg3r un G-Rg3 izplūdi, vienlaikus uzlabojot membrānas caurlaidību.Yang et al pētījums.Pētījumi liecina, ka ārstēšana ar ciklosporīnu A (citu P-gp blokatoru) palielina ginsenosīda Rh2 biopieejamību no sākotnējās vērtības 1%20 līdz vairāk nekā 30%.Ginsenosīdu savienojumi K un Rg1 arī uzrādīja līdzīgus rezultātus30, 31.Lietojot vienlaikus verapamilu un ciklosporīnu A, savienojuma K izplūde Caco-2 šūnās tika ievērojami samazināta no 26,6 līdz mazāk nekā 3, savukārt tā intracelulārais līmenis palielinājās 40 reizes30.Verapamila klātbūtnē Rg1 līmenis paaugstinājās žurku plaušu epitēlija šūnās, kas liecina par P-gp lomu ginsenosīda izplūdē, kā liecina Meng et al.31.Tomēr verapamilam nebija tādas pašas ietekmes uz dažu ginsenozīdu (piemēram, Rg1, F1, Rh1 un Re) izplūdi, norādot, ka tos neietekmē P-gp substrāti, kā liecina Liang et al.32 .Šis novērojums var būt saistīts ar citu transportētāju un alternatīvu ginsenosīda struktūru iesaistīšanos.
G-Rg3 profilaktiskās ietekmes uz vēzi mehānisms nav skaidrs.Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka G-Rg3 novērš DNS bojājumus un apoptozi, samazinot oksidatīvo stresu un iekaisumu 16, 33, kas var būt B (a) P izraisītas audzēja ģenēzes novēršanas pamatā.Daži ziņojumi liecina, ka B (a) P izraisīto genotoksicitāti var samazināt, modulējot II fāzes enzīmus, veidojot BPDE-DNS34.GST ir tipisks II fāzes enzīms, kas inhibē BPDE-DNS aduktu veidošanos, veicinot GSH saistīšanos ar BPDE, tādējādi samazinot B(a)P35 izraisītos DNS bojājumus.Mūsu rezultāti liecina, ka ārstēšana ar G-Rg3 samazina B (a) P izraisītu citotoksicitāti un BPDE-DNS adduktu veidošanos hEL šūnās un atjauno GST ekspresiju un aktivitāti in vitro .Tomēr šīs ietekmes nebija, ja nebija Nrf2, kas liecina, ka G-Rg3 izraisa citoprotektīvu iedarbību caur Nrf2 ceļu.Nrf2 ir galvenais II fāzes detoksikācijas enzīmu transkripcijas faktors, kas veicina ksenobiotiku klīrensu36.Nrf2 ceļa aktivizēšana izraisa citoprotekciju un samazina audu bojājumus37.Turklāt vairāki ziņojumi ir atbalstījuši Nrf2 lomu kā audzēja nomācēju kanceroģenēzē38.Mūsu pētījums parāda, ka Nrf2 ceļa indukcijai ar G-Rg3 ir svarīga regulējoša loma B (a) P izraisītā genotoksicitātē, izraisot B (a) P detoksikāciju, aktivizējot II fāzes enzīmus, tādējādi kavējot audzēja ģenēzes procesu.
Mūsu darbs atklāj sarkanā žeņšeņa potenciālu, lai novērstu B (a) P izraisītu plaušu vēzi pelēm, būtiski iesaistot ginsenoside G-Rg3.Šīs molekulas sliktā perorālā bioloģiskā pieejamība kavē tās klīnisko pielietojumu.Tomēr šis pētījums pirmo reizi parāda, ka G-Rg3 ir P-gp substrāts, un P-gp inhibitora ievadīšana palielina G-Rg3 biopieejamību in vitro un in vivo.G-Rg3 samazina B (a) P izraisīto citotoksicitāti, regulējot Nrf2 ceļu, kas var būt potenciāls mehānisms tā preventīvajai funkcijai.Mūsu pētījums apstiprina ginsenoside G-Rg3 potenciālu plaušu vēža profilaksē un ārstēšanā.
Sešas nedēļas vecas A/J peļu mātītes (20 ± 1 g) un 7 nedēļas vecas Wistar žurku tēviņš (250 ± 20 g) tika iegūtas no Džeksonas laboratorijas (Bar Harbor, ASV) un Uhaņas Zooloģijas institūta.Universitāte (Uhaņa, Ķīna).Ķīniešu tipa kultūras kolekcijas centrs (Uhaņa, Ķīna) mums nodrošināja Caco-2 un hEL šūnas.Sigma-Aldrich (St. Louis, ASV) ir B(a)P un trikaprīna avots.Attīrīti ginsenosīdi G-Rg3r un G-Rg3s, dimetilsulfoksīds (DMSO), CellTiter-96 proliferācijas testa komplekts (MTS), verapamils, minimālā būtiskā barotne (MEM) un liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāti no Chengdu Must Bio-Technology. .Co., Ltd.(Čendu, Ķīna).QIAamp DNS mini komplekts un BPDE-DNS adukta ELISA komplekts tika iegādāts no Qiagen (Stenforda, Kalifornija, ASV) un Cell Biolabs (Sandjego, CA, ASV).GST aktivitātes testa komplekts un kopējā proteīna testa komplekts (standarta BCA metode) tika iegādāti no Solarbio (Pekina, Ķīna).Visi sarkanā žeņšeņa ekstrakti tiek glabāti Mingyu Laboratory 7. Honkongas baptistu universitāte (Honkonga, Ķīna) un Korejas vēža centrs (Seula, Koreja) ir CRG ekstrakta un dažādu korejiešu izcelsmes dažādu sarkano žeņšeņa ekstraktu (tostarp KRGA, KRGB) komerciāli avoti. un KRGC).Sarkanais žeņšeņs ir izgatavots no 6 gadus veca svaiga žeņšeņa saknēm.Sarkanā žeņšeņa ekstraktu iegūst, trīs reizes mazgājot žeņšeņu ar ūdeni, pēc tam koncentrējot ūdens ekstraktu un visbeidzot žāvējot zemā temperatūrā, lai iegūtu žeņšeņa ekstrakta pulveri.Antivielas (anti-Nrf2, anti-GST un β-aktīns), mārrutku peroksidāzi konjugēts anti-trušu imūnglobulīns G (IgG), transfekcijas reaģents, kontroles siRNS un Nrf2 siRNS tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). .), ASV).
Caco2 un hEL šūnas tika kultivētas 100 mm2 šūnu kultūras traukos ar MEM, kas satur 10% FBS, 37 ° C mitrinātā atmosfērā ar 5% CO2.Lai noteiktu ārstēšanas apstākļu ietekmi, hEL šūnas tika inkubētas ar dažādām B (a) P un G-Rg3 koncentrācijām MEM 48 stundas.Šūnas var tālāk analizēt vai savākt, lai sagatavotu ekstraktus bez šūnām.
Visus eksperimentus apstiprināja Huazhong Zinātnes un tehnoloģijas universitātes Tongji Medicīnas koledžas Eksperimentālo dzīvnieku ētikas komiteja (apstiprinājuma Nr. 2019; reģistrācijas Nr. 4587TH).Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar attiecīgajām vadlīnijām un noteikumiem, un pētījums tika veikts saskaņā ar Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) vadlīnijām.Astoņas nedēļas vecām A / J pelēm vispirms intraperitoneāli injicēja B (a) P trikaprīna šķīdumā (100 mg / kg, 0, 2 ml).Pēc nedēļas peles tika nejauši sadalītas kontroles grupās un dažādās ārstēšanas grupās, katrā grupā bija 15 peles, un tām tika veikta barošana vienu reizi dienā.Pēc 20 nedēļu ilgas ārstēšanas dzīvnieki tika nogalināti ar CO2 asfiksiju.Plaušas tika savāktas un fiksētas 24 stundas.Virspusējo audzēju skaits un individuālie audzēju izmēri tika kvantificēti katrai plaušai ar sadalošo mikroskopu.Audzēja tilpuma aprēķini (V) tika aprēķināti, izmantojot šādu izteiksmi: V (mm3) = 4/3πr3, kur r ir audzēja diametrs.Visu audzēja tilpumu neto summa peļu plaušās atspoguļoja kopējo audzēja tilpumu, un vidējais kopējais audzēja tilpums katrā grupā atspoguļoja audzēja slodzi.Asins un zarnu paraugi tika savākti un uzglabāti -80 ° C temperatūrā UPLC-MS / MS noteikšanai.Serums tika savākts un automatizēts ķīmijas analizators tika izmantots, lai analizētu alanīna aminotransferāzes (ALT) un seruma kreatinīna (Cr) līmeni, lai novērtētu aknu un nieru darbību.
Savāktie paraugi tika izņemti no saldētavas, atkausēti, nosvērti un ievietoti mēģenēs, kā aprakstīts iepriekš.Tam tika pievienots 0,5 μM florizīns (iekšējais standarts) 0,8 ml metanola šķīduma.Pēc tam audus homogenizēja, izmantojot Tissue-Tearor, un pēc tam homogenātu pārnesa uz 1, 5 ml mikrocentrifūgas mēģeni.Maisījumu 15 minūtes centrifugēja pie 15 500 apgr./min.Pēc 1,0 ml supernatanta noņemšanas nosusina ar slāpekli.Reģenerācijai tika izmantoti divi simti mikrolitru metanola.Asinis tiek savāktas un apstrādātas vienā līnijā un tiek izmantotas kā atsauce visiem mērījumiem.
24 bedrīšu Transwell plates tika iesētas ar 1, 0 × 105 Caco-2 šūnām katrā iedobē, lai novērtētu iespējamo G-Rg3 transporta uzlabošanos, pievienojot verapamilu.Pēc 3 nedēļu kultivēšanas šūnas tika mazgātas ar HBSS un iepriekš inkubētas 37 ° C temperatūrā.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s vai maisījums ar 50 vai 100 μM verapamilu) tika injicēts monoslāņa bazolaterālajā vai apikālajā pusē, bet otram tika pievienots 600 μL HBSS šķīduma. pusē.Noteiktajos laikos (0, 15, 30, 45, 60, 90 un 120 minūtes) savāc 100 µl barotnes un pievieno 100 µl HBSS, lai papildinātu šo tilpumu.Paraugi tika uzglabāti -4 ° C temperatūrā līdz noteikšanai ar UPLC-MS/MS.Izteicienu Papp = dQ/(dT × A × C0) izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu šķietamo vienvirziena apikālo un bazolaterālo caurlaidību un otrādi (attiecīgi Pa-b un Pb-a);dQ/dT ir koncentrācijas izmaiņas, A (0,6 cm2) ir viena slāņa virsmas laukums, un C0 ir sākotnējā donora koncentrācija.Izplūdes koeficientu aprēķina kā Pb-a/Pa-b, kas atspoguļo pētāmās zāles izplūdes ātrumu.
Wistar žurku tēviņi 24 stundas tika badā, dzēra tikai ūdeni un anestēzēja ar 3,5% pentobarbitāla šķīduma intravenozu injekciju.Intubētajai silikona caurulei ir divpadsmitpirkstu zarnas gals kā ieeja un ileuma gals kā izeja.Izmantojiet peristaltisko sūkni, lai sūknētu ieplūdi ar 10 µM G-Rg3r vai G-Rg3s izotoniskā HBSS ar plūsmas ātrumu 0,1 ml/min.Verapamila iedarbība tika novērtēta, pievienojot 50 μM vai 100 μM savienojuma 10 μM G-Rg3r vai G-Rg3s.UPLC-MS/MS tika veikta ar perfūzijas ekstraktiem, kas savākti laika punktos 60, 90, 120 un 150 minūtes pēc perfūzijas sākuma.Absorbcijas procentuālo daudzumu nosaka pēc formulas % absorbcija = (1 – Cout/Cin) × 100 %;G-Rg3 koncentrāciju izejā un ieplūdē izsaka attiecīgi ar Cout un Cin.
hEL šūnas tika iesētas 96 bedrīšu plāksnēs ar blīvumu 1 × 104 šūnas vienā iedobē un apstrādātas ar B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) vai G-Rg3, kas izšķīdināts DMSO. .Pēc tam zāles 48 stundu laikā atšķaida ar barotni līdz dažādām koncentrācijām (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM).Izmantojot komerciāli pieejamu MTS testa komplektu, šūnas tika pakļautas standarta protokolam un pēc tam tika mērītas, izmantojot mikroplašu lasītāju pie 490 nm.Ar B(a)P (10 μM) un G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) vienlaikus apstrādāto grupu šūnu dzīvotspējas līmenis tika novērtēts saskaņā ar iepriekš minēto metodi un salīdzināts ar neapstrādāto grupu.
hEL šūnas tika iesētas 6 bedrīšu plāksnēs ar blīvumu 1 × 105 šūnas/iedobē un apstrādātas ar 10 μMB (a) P 10 μM G-Rg3 klātbūtnē vai bez tās.Pēc 48 stundu ilgas apstrādes DNS tika ekstrahēta no hEL šūnām, izmantojot QIAamp DNA Mini Kit saskaņā ar ražotāja protokolu.BPDE-DNS adduktu veidošanās tika noteikta, izmantojot BPDE-DNS adduktu ELISA komplektu.Relatīvie BPDE-DNS addukta līmeņi tika mērīti, izmantojot mikroplašu lasītāju, mērot absorbciju pie 450 nm.
hEL šūnas tika iesētas 96 bedrīšu plāksnēs ar blīvumu 1 × 104 šūnas vienā iedobē un apstrādātas ar 10 μMB (a) P bez 10 μM G-Rg3 vai klātbūtnē 48 stundas.GST aktivitāte tika mērīta, izmantojot komerciālu GST aktivitātes testa komplektu saskaņā ar ražotāja protokolu.Relatīvā GST aktivācija tika mērīta ar absorbciju pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju.
hEL šūnas tika mazgātas ar ledus aukstu PBS un pēc tam lizētas, izmantojot radioimūnprecipitācijas testa buferi, kas satur proteāzes inhibitorus un fosfatāzes inhibitorus.Pēc proteīna kvantitatīvās noteikšanas, izmantojot kopējā proteīna testa komplektu, 30 μg proteīna katrā paraugā tika atdalīti ar 12% SDS-PAGE un pārnesti uz PVDF membrānu ar elektroforēzi.Membrānas tika bloķētas ar 5% vājpienu un inkubētas ar primārajām antivielām nakti 4 ° C temperatūrā.Pēc inkubācijas ar mārrutku peroksidāzes konjugētām sekundārajām antivielām tika pievienoti pastiprināti hemiluminiscences reaģenti, lai vizualizētu saistīšanās signālu.Katras proteīna joslas intensitāte tika noteikta, izmantojot ImageJ programmatūru.
GraphPad Prism 7.0 programmatūra tika izmantota, lai analizētu visus datus, kas izteikti kā vidējā ± standarta novirze.Atšķirības starp ārstēšanas grupām tika novērtētas, izmantojot Stjudenta t testu vai vienvirziena dispersijas analīzi ar P vērtību <0,05, kas norāda uz statistisko nozīmīgumu.
Visi šī pētījuma laikā iegūtie vai analizētie dati ir iekļauti šajā publicētajā rakstā un papildu informācijas failos.
Torre, LA, Siegel, RL un Jemal, A. Plaušu vēža statistika.apstākļa vārds.Beidzies derīguma termiņš.medicīna.bioloģija.893, 1–19 (2016).
Hehts, S. Tabakas kancerogēni, to biomarķieri un tabakas izraisīts vēzis.Nat.Vēža kapelāns.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH un Venitt, S. DNS un olbaltumvielu addukti cilvēka audos, kas rodas tabakas dūmu iedarbības rezultātā.internacionalitāte.J. Vēzis.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA un Yu M. Houttuynia cordata un silibinīna ietekme uz benzo (a) pirēna izraisītu plaušu audzēju veidošanos A / J pelēm.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Dabisks pretvēža produkts, kas izolēts no ķīniešu medicīnas materiāliem.žoklis.medicīna.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Polifenona E, sarkanā žeņšeņa un rapamicīna efektivitāte uz benzo (a) pirēna izraisītu plaušu audzēju veidošanos A / J pelēm.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS un Yuan, KS Red, iesaistīšanās vēža terapijā.žoklis.J. Nuts.medicīna.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS un Gao, L. Ginsenosides Amerikas žeņšeņa saknēs un lapās.J. Agric.Pārtikas ķīmija.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA un Yuan KS Žeņšeņa farmakoloģija: daudzi komponenti un daudzi efekti.bioķīmija.farmakoloģija.58, 1685–1693 (1999).
Publicēšanas laiks: 17. septembris 2023