Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобри резултати, препорачуваме да користите понова верзија на вашиот прелистувач (или да го исклучите режимот за компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стајлинг или JavaScript.
Црвениот женшен се користи во традиционалната азиска медицина стотици години.Во оваа студија, ја проценивме способноста на четири типа црвен женшен (кинески црвен женшен, корејски црвен женшен А, корејски црвен женшен Б и корејски црвен женшен Ц) одгледувани во различни региони да го инхибираат формирањето и растот на белите дробови предизвикани од канцероген тумори.Беше спроведен тест на бензо(а)пирен (B(a)P) на глувци A/J, а беше откриено дека корејскиот црвен женшен Б е најефикасен во намалувањето на оптоварувањето на туморот меѓу четирите сорти црвени женшен.Дополнително, ја анализиравме содржината на различни женсенозиди (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5) во четири екстракти од црвен женшен и откривме дека корејскиот црвен женшен Б има највисоките нивоа на ginsenoside Rg3 (G-Rg3), што сугерира дека G-Rg3 може да игра важна улога во неговата терапевтска ефикасност.Оваа работа покажува дека G-Rg3 има релативно ниска биорасположивост.Меѓутоа, кога G-Rg3 беше истовремено администриран со P-gp инхибиторот верапамил, одливот на G-Rg3 во Caco-2 клетките беше намален, стапката на интестинална апсорпција на G-Rg3 беше зголемена кај модел на стаорец и G-Rg3 беше зголемен.Во клетките на Caco-2, одливот на Rg3 се намалува, а нивото на концентрацијата на Rg3 се намалува.G-Rg3 е зголемен во цревата и плазмата, а неговата способност да спречи тумори е исто така подобрена во модел на стаорец на B(a)P-индуцирана туморигенеза.Исто така, откривме дека G-Rg3 ја намалува цитотоксичноста предизвикана од B(a)P и формирањето на ДНК аддукт во човечките белодробни клетки и ја обнови експресијата и активноста на ензимите од фаза II преку патеката Nrf2, што може да биде поврзано со потенцијалниот механизам на дејство на G инхибиција -Rg3..За појавата на тумори на белите дробови.Нашата студија покажува потенцијално важна улога за G-Rg3 во таргетирање на белодробните тумори кај моделите на глувци.Оралната биорасположивост на овој женсенозид е подобрена со таргетирање на P-гликопротеинот, дозволувајќи и на молекулата да има антиканцерогени ефекти.
Најчестиот тип на рак на белите дробови е неситноклеточниот карцином на белите дробови (NSCLC), кој е една од водечките причини за смртни случаи од рак во Кина и Северна Америка1,2.Главниот фактор кој го зголемува ризикот од развој на неситноклеточен карцином на белите дробови е пушењето.Чадот од цигарите содржи повеќе од 60 канцерогени, вклучувајќи бензо(а)пирен (B(a)P), нитрозамини и радиоактивни изотопи од распаѓањето на радон.3 Полицикличните ароматични јаглеводороди B(a)P се главната причина за токсичност во цигарите чад.По изложување на B(a)P, цитохром P450 го претвора во B(a)P-7,8-дихидродиол-9,10-епоксид (BPDE), кој реагира со ДНК за да формира БПДЕ-ДНК адукт 4. Дополнително, овие адуктите индуцираат туморигенеза на белите дробови кај глувци со туморски стадиум и хистопатологија слична на туморите на човечките бели дробови5.Оваа карактеристика го прави моделот на рак на белите дробови индуциран од B(a)P соодветен систем за евалуација на соединенија со можни антиканцерогени својства.
Една можна стратегија за спречување на развојот на рак на белите дробови кај високоризичните групи, особено пушачите, е употребата на хемопревентивни средства за да се потисне развојот на интраепителните неопластични лезии и со тоа да се спречи нивната последователна прогресија до малигнитет.Студиите на животни покажуваат дека различните хемопревентивни агенси се ефикасни6.Нашиот претходен извештај7 ги истакна добрите превентивни ефекти на црвениот женшен врз ракот на белите дробови.Оваа билка со векови се користи во традиционалната азиска медицина за продолжување на животот и здравјето, и е документирано дека има антитуморни ефекти8.
Активниот фактор на женшен е женсенозид, кој се користи како композитен маркер за да се оцени квалитетот на екстрактите од женшен.Квантитативната анализа на суровите екстракти од женшен обично вклучува употреба на неколку женсенозиди, вклучувајќи RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 и Rc9,10.Гинсенозидите имаат мала клиничка употреба поради нивната многу лоша орална биорасположивост11.Иако механизмот за оваа лоша биорасположивост не е јасен, одливот на ginsenosides предизвикан од P-гликопротеин (P-gp)12 може да биде причина.P-gp е еден од најважните транспортери на ефлукс во суперсемејството на касети за врзување на АТП, кој ја користи енергијата на хидролизата на АТП за ослободување на интрацелуларни супстанции во надворешната средина.P-gp транспортерите обично се широко дистрибуирани во цревата, бубрезите, црниот дроб и крвно-мозочната бариера13.P-gp игра клучна улога во интестиналната апсорпција, а инхибицијата на P-gp ја зголемува оралната апсорпција и достапноста на некои антиканцерогени лекови12,14.Примери на инхибитори кои претходно се користеле во литературата се верапамил и циклоспорин А15.Оваа работа вклучува воспоставување систем на глушец за проучување на ракот на белите дробови предизвикан од B(a)P за да се оцени способноста на различни екстракти од црвен женшен од Кина и Кореја да влијаат на малигнитет.Екстрактите беа индивидуално анализирани за да се идентификуваат специфичните гинсенозиди кои можат да влијаат на канцерогенезата.Потоа се користеше верапамил за да се таргетира P-gp и да се подобри оралната биорасположивост и терапевтската ефикасност на гинсенозидите кои таргетираат рак.
Механизмот со кој сапонините од женшен вршат терапевтски ефекти врз канцерогенезата останува нејасен.Истражувањата покажаа дека различните гинсенозиди можат да го намалат оштетувањето на ДНК предизвикано од канцерогени со намалување на оксидативниот стрес и активирање на ензимите за детоксикација во фаза II, со што се спречува оштетувањето на клетките.Глутатион С-трансфераза (GST) е типичен ензим од фаза II кој е потребен за да се намали оштетувањето на ДНК предизвикано од канцерогени17.Факторот 2 (Nrf2) поврзан со нуклеарниот еритроид 2 (Nrf2) е важен фактор на транскрипција кој ја регулира редокс хомеостазата и го активира изразувањето на ензимите од фаза II и цитопротективните антиоксидантни одговори18.Нашата студија, исто така, ги испита ефектите на идентификуваните гинсенозиди врз намалувањето на цитотоксичноста индуцирана од B(a)P и формирањето на аддукт на BPDE-DNA, како и поттикнување на ензими од фаза II со модулирање на патеката Nrf2 во нормалните клетки на белите дробови.
Воспоставувањето на модел на глушец за рак индуциран од B(a)P е во согласност со претходната работа5.Слика 1А го прикажува експерименталниот дизајн на 20-неделен третман на модел на рак на глушец, индуциран од B(a)P, вода (контрола), екстракт од кинески црвен женшен (CRG), екстракт од корејски црвен женшен А (KRGA) и корејско црвено женшен.Екстракт Б (KRGB) и екстракт од корејски црвен женшен Ц (KRGC).По 20 недели третман со црвен женшен, глувците беа жртвувани со асфиксија на CO2.Слика 1Б покажува макроскопски тумори на белите дробови кај животни третирани со различни видови црвен женшен, а Слика 1C покажува репрезентативна светлосна микрографија на примерок од тумор.Туморскиот товар на животните третирани со KRGB (1,5 ± 0,35) беше помал од оној на контролните животни (0,82 ± 0,2, P <0,05), како што е прикажано на Слика 1Д.Просечниот степен на инхибиција на оптоварувањето на туморот беше 45%.Други тестирани екстракти од црвен женшен не покажаа толку значајни промени во оптоварувањето на туморот (P > 0,05).Не беа забележани очигледни несакани ефекти кај моделот на глушец во текот на 20 недели третман со црвен женшен, вклучително и без промена во телесната тежина (податоците не се прикажани) и без токсичност на црниот дроб или бубрезите (слика 1E,F).
Екстрактот од црвен женшен го третира развојот на тумор на белите дробови кај глувците A/J.(А) Експериментален дизајн.(Б) Големи белодробни тумори кај модел на глушец.Туморите се означени со стрелки.a: Кинеска група со црвен женшен.б: група А на корејски црвен женшен.в: Корејски црвен женшен група Б. г: корејски црвен женшен група В. г: Контролна група.(В) Светлосен микрограф кој покажува тумор на белите дробови.Зголемување: 100. б: 400. (Г) Туморско оптоварување во групата екстракт од црвен женшен.(Д) Плазма нивоа на ензимот на црниот дроб АЛТ.(F) Плазма нивоа на бубрежниот ензим Cr.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација.*P <0,05.
Екстрактите од црвениот женшен идентификувани во оваа студија беа анализирани со тандемска спектрометрија на маса со течна хроматографија (UPLC-MS/MS) за квантифицирање на следните женсенозиди: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5.Условите UPLC и MS што се користат за мерење на аналитите беа опишани во претходниот извештај19.UPLC-MS/MS хроматограми од четири екстракти од црвен женшен се прикажани на слика 2А.Имаше значајни разлики во вкупната содржина на женсенозид, со највисока вкупна содржина на женсенозид во CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Слика 2Б).При евалуација на поединечни гинсенозиди (слика 2C), KRGB покажа највисоко ниво на G-Rg3 во споредба со другите ginsenosides (58,33 ± 3,81 μmol/L за G-Rg3s и 41,56 ± 2,88 μmol/L за G-Rg3r).L).црвен тип женшен (P <0,001).G-Rg3 се јавува како пар стереоизомери G-Rg3r и G-Rg3s, кои се разликуваат во положбата на хидроксилната група на јаглерод 20 (сл. 2D).Резултатите укажуваат дека G-Rg3r или G-Rg3 може да имаат важен антиканцероген потенцијал во модел на глувче од рак индуциран од B(a)P.
Содржина на женсенозиди во различни екстракти од црвен женшен.(А) UPLC-MS/MS хроматограми од четири екстракти од црвен женшен.(Б) Проценка на вкупната содржина на женсенозид во наведените екстракти.(В) Откривање на поединечни женсенозиди во означени екстракти.(Г) Структури на стереоизомерите на гинсенозид G-Rg3r и G-Rg3s.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација на тројно определување.***P <0,001.
Студијата UPLC-MS/MS бараше квантификација на ginsenosides во примероците од цревата и крвта по 20 недели од третманот.Третманот со KRGB покажа присуство на само 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 во крвта.Не беа откриени преостанати гинсенозиди, што укажува на лоша орална биорасположивост и затоа намалена изложеност на овие женсенозиди.
Клеточната линија на аденокарцином на дебелото црево Caco-2 е морфолошки и биохемиски слична на човечките цревни епителни клетки, покажувајќи ја нејзината корисност во проценувањето на транспортот на ентероцитите низ цревната епителна бариера.Оваа анализа беше заснована на претходна студија 20 .На сликите 3A,B,C,D,E,F се прикажани репрезентативни слики на трансцелуларен транспорт на G-Rg3r и G-Rg3 со користење на Caco-2 монослоен модел.Трансцелуларниот транспорт на G-Rg3r или G-Rg3 преку Caco-2 монослоеви од базолатералната до апикалната страна (Pb-a) беше значително повисок отколку од апикалната до базолатералната страна (Pa-b).За G-Rg3r, средната вредност на Pa-b беше 0,38 ± 0,06, што се зголеми на 0,73 ± 0,06 по третман со 50 μmol/L верапамил и на 1,14 ± 0,09 по третман со 100 μmol/L верапамил (p <0,01 и p <0,01 соодветно Слика 2).3А).Набљудувањата за G-Rg3 следеа слична шема (сл. 3B), а резултатите покажаа дека третманот со верапамил го подобрува транспортот на G-Rg3r и G-Rg3.Третманот со верапамил, исто така, резултираше со значително намалување на просечните соодноси на ефлукс на Pb-a и G-Rg3r и G-Rg3s (Слика 3C,D,E,F), што покажува дека третманот со верапамил ја намалува содржината на ginsenoside во клетките на Caco-2..
Трансцелуларен транспорт на G-Rg3 во Caco-2 монослоеви и интестинална апсорпција во анализа на перфузија на стаорци.(А) Pa-b вредност на групата G-Rg3r во Caco-2 монослој.(Б) Pa-b вредност на G-Rg3s групите во Caco-2 монослој.(C) Вредност на Pb на групата G-Rg3r во Caco-2 монослој.(Г) Вредност на Pb на групите G-Rg3s во Caco-2 монослој.(Д) Однос на принос на групите G-Rg3r во Caco-2 монослој.(F) Сооднос на принос на G-Rg3 групи во Caco-2 монослој.(Г) Процент на интестинална апсорпција на G-Rg3r во анализа на перфузија кај стаорци.(H) Процент на интестинална апсорпција на G-Rg3 во анализа на перфузија кај стаорци.Пропустливоста и апсорпцијата беа споредени без додавање на верапамил.Податоците се изразуваат како просечна ± стандардна девијација на пет независни експерименти.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Во согласност со претходната работа20, беше извршена ортотопска интестинална перфузија на стаорци за да се утврди дали апсорпцијата на G-Rg3 во цревата се зголемува по третманот со верапамил.Сликите 3G,H покажуваат репрезентативни тестови за перфузија за да се процени процентот на интестинална апсорпција на G-Rg3r и G-Rg3 кај стаорци со модел на рак во текот на горенаведените временски периоди.Почетниот процент на слаб навлегување на G-Rg3r од приближно 10% се зголеми на повеќе од 20% по третман со 50 μM верапамил и на повеќе од 25% по третман со 100 μM верапамил.Слично на тоа, G-Rg3, кој имаше првично навлегување од 10%, исто така покажа врв од над 20% по третман со 50 μM верапамил и скоро 30% по третман со 100 μM верапамил, што укажува на тоа дека инхибицијата на P-gp со верапамил ја подобрува цревна Г-апсорпција Rg3 кај глувчешки модел на рак на белите дробови.
Според горенаведениот метод, глувците со модел на рак индуцирани од B(a)P беа случајно поделени во шест групи, како што е прикажано на Слика 4А.Не се забележани значително губење на тежината или клинички знаци на токсичност во групата за третман на G-Rg3 во споредба со контролната група (податоци не се прикажани).По 20 недели третман, белите дробови на секој глушец беа собрани.Слика 4Б покажува макроскопски тумори на белите дробови кај глувци во горенаведените групи за третман, а Слика 4C покажува репрезентативна светлосна микрографија на репрезентативен тумор.Во однос на оптоварувањето на туморот во секоја група (слика 4D), вредностите за глувците третирани со G-Rg3r и G-Rg3s беа 0,75 ± 0,29 mm3 и 0,81 ± 0,30 mm3, соодветно, додека вредностите за Г глувците третирани со -Rg3s беа 1,63 соодветно ±0,40 mm3.контролни глувци (p <0,001), што покажува дека третманот со G-Rg3 го намалува оптоварувањето на туморот кај глувците.Администрацијата на верапамил дополнително го подобри ова намалување: вредностите кај верапамил + G-Rg3r се намалија од 0,75 ± 0,29 mm3 на 0,33 ± 0,25 mm3 (p <0,01), а вредностите за верапамил + од 0,81 ± 0,30 mm3 се намалија на 0,81 ± 0,30 mm3 на mm3 кај глувци третирани со G. -Rg3s (p <0,05), што покажува дека верапамил може да го подобри инхибиторниот ефект на G-Rg3 врз туморигенезата.Оптоварувањето на туморот не покажа значајни разлики помеѓу контролната група и групата верапамил, групата G-Rg3r и групата G-Rg3s и групата верапамил+G-Rg3r и групата верапамил+G-Rg3s.Покрај тоа, немаше значителни токсичности на црниот дроб или бубрезите поврзани со евалуираните третмани (Слика 4E,F).
Оптоварување на туморот по третман со G-Rg3 и плазма или интестинални нивоа на G-Rg3r и G-Rg3 во наведените групи.(А) Експериментален дизајн.(Б) Макроскопски тумори во модел на глушец.Туморите се означени со стрелки.a: G-Rg3r.б: G-Rg3s.в: G-Rg3r во комбинација со верапамил.г: G-Rg3 во комбинација со верапамил.г: верапамил.д: контрола.(В) Оптичка микрографија на туморот при зголемување.Одговор: 100x.б: 400X.(Г) Ефектот на третманот со G-Rg3 + верапамил врз оптоварувањето на туморот кај глувците A/J.(Д) Плазма нивоа на ензимот на црниот дроб АЛТ.(F) Плазма нивоа на бубрежниот ензим Cr.(Г) Плазма нивоа на G-Rg3r или G-Rg3 од наведените групи.(H) Нивоа на G-Rg3r или G-Rg3s во цревата на наведените групи.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација на тројно определување.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Нивоата на G-Rg3 кај глувците со модел на рак предизвикани од B(a)P беа оценети со UPLC-MS/MS по 20-неделен период на третман според методот опишан во делот Методи.На сликите 4G и H се прикажани нивоата на G-Rg3 во плазмата и цревата, соодветно.Нивоата на G-Rg3r во плазмата беа 0,44 ± 0,32 μmol/L и се зголемија на 1,17 ± 0,47 μmol/L со истовремена администрација на верапамил (p <0,001), додека нивоата на G-Rg3r во цревата беа 0,53 ± 0,08 µg/l.Кога се комбинира со верапамил, g се зголеми на 1,35 ± 0,13 μg/g (p <0,001).За G-Rg3, резултатите следеа слична шема, што укажува дека третманот со верапамил ја зголеми оралната биорасположивост на G-Rg3 кај A/J глувците.
Анализата за одржливост на клетките беше искористена за да се оцени цитотоксичноста на B(a)P и G-Rg3 на hEL клетките.Цитотоксичноста индуцирана од B(a)P во hEL клетките е прикажана на Слика 5А, додека нетоксичните својства на G-Rg3r и G-Rg3 се прикажани на сликите 5A и 5B.5B, C. За да се оцени цитопротективниот ефект на G-Rg3, B(a)P беше ко-администриран со различни концентрации на G-Rg3r или G-Rg3 во hEL клетките.Како што е прикажано на слика 5D, G-Rg3r во концентрации од 5 μM, 10 μM и 20 μM ја врати одржливоста на клетките на 58,3%, 79,3% и 77,3%, соодветно.Слични резултати може да се видат и во групата G-Rg3s.Кога концентрациите на G-Rg3 беа 5 µM, 10 µM и 20 µM, одржливоста на клетките беше вратена на 58,3%, 72,7% и 76,7%, соодветно (Слика 5E).).Присуството на адукти на BPDE-DNA беше мерено со помош на комплет ELISA.Нашите резултати покажаа дека нивоата на аддуктот на БПДЕ-ДНК беа зголемени во групата третирана со Б(а)Р во споредба со контролната група, но во споредба со ко-третманот со G-Rg3, нивоата на аддуктот на БПДЕ-ДНК во групата Б(а)Р Б во третираната група, нивоата на ДНК аддукти беа значително намалени.Резултатите од третманот само со B(a)P се прикажани на Слика 5F (1,87 ± 0,33 наспроти 3,77 ± 0,42 за G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 наспроти 3,77 ± 0,42 за G-Rg3s, p <0,0).
Одржливост на клетките и формирање на аддукт на BPDE-DNA во hEL клетки третирани со G-Rg3 и B(a)P.(А) Одржливост на hEL клетки третирани со B(a)P.(Б) Одржливост на hEL клетки третирани со G-Rg3r.(В) Одржливост на hEL клетки третирани со G-Rg3.(Г) Одржливост на hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3r.(Д) Одржливост на hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3.(F) Нивоа на BPDE-DNA аддукт во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација на тројно определување.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Експресијата на ензимот GST беше откриена по ко-третман со 10 μM B(a)P и 10 μM G-Rg3r или G-Rg3s.Нашите резултати покажаа дека B(a)P ја потисна експресијата на GST (59,7 ± 8,2% во групата G-Rg3r и 39 ± 4,5% во групата G-Rg3s), а B(a)P беше поврзана со или со G-Rg3r , или со G-Rg3r, или со G-Rg3r.Заедничкиот третман со G-Rg3s го врати изразот на GST.GST изразување (103,7 ± 15,5% во групата G-Rg3r и 110 ± 11,1% во групата G-Rg3s, p <0,05 и p <0,001, соодветно, Сл. 6A, B и C).Активноста на GST беше проценета со помош на комплет за анализа на активност.Нашите резултати покажаа дека групата со комбиниран третман имаше повисока активност на GST во споредба со групата само B(a)P (96,3 ± 6,6% наспроти 35,7 ± 7,8% во групата G-Rg3r наспроти 92,3 ± 6,5 во групата G-Rg3r ).% наспроти 35,7 ± 7,8% во групата G-Rg3s, p <0,001, Слика 6Д).
Експресија на GST и Nrf2 во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3.(А) Откривање на изразување на GST со вестерн blotting.(Б) Квантитативна експресија на GST во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3r.(В) Квантитативна експресија на GST во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3s.(Г) GST активност во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3.(Д) Откривање на Nrf2 изразување со вестерн blotting.(F) Квантитативна експресија на Nrf2 во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3r.(Г) Квантитативна експресија на Nrf2 во hEL клетки третирани со B(a)P и G-Rg3s.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација на тројно определување.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
За да се разјаснат патиштата вклучени во супресија со посредство на G-Rg3 на туморигенезата индуцирана од B(a)P, експресијата на Nrf2 беше проценета со Western blotting.Како што е прикажано на сликите 6E,F,G, во споредба со контролната група, само нивото на Nrf2 во групата за третман со B(a)P беше намалено;сепак, во споредба со групата за третман со B(a)P, нивоата на B(a) Nrf2 во групата PG-Rg3 беа зголемени (106 ± 9,5% за G-Rg3r наспроти 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6, 2% за G-Rg3r наспроти 41 ± 9,8% за G-Rg3s, p <0,01).
Ја потврдивме превентивната улога на Nrf2 со потиснување на експресијата на Nrf2 користејќи специфична мала интерферирачка РНК (siRNA).Нокдаун Nrf2 беше потврден со вестерн blotting (сл. 7A,B).Како што е прикажано на сликите 7C,D, ко-третманот на hEL клетките со B(a)P и G-Rg3 резултираше со намалување на бројот на BPDE-DNA адукти (1,47 ± 0,21) во споредба со третманот со B(a)P сам во контролната група siRNA.) G-Rg3r беше 4,13 ± 0,49, G-Rg3s беше 1,8 ± 0,32 и 4,1 ± 0,57, p <0,01).Сепак, инхибиторниот ефект на G-Rg3 врз формирањето на BPDE-DNA беше укинат со соборувањето на Nrf2.Во групата siNrf2, немаше значајна разлика во формирањето на аддукт на BPDE-DNA помеѓу заедничкиот третман со B(a)P и G-Rg3 и само третманот со B(a)P (3,0 ± 0,21 за G-Rg3r наспроти 3,56 ± 0,32 ).за G-Rg3r наспроти 3,6 за G-Rg3s наспроти ±0,45 наспроти 4,0±0,37, p > 0,05).
Ефект на соборувањето на Nrf2 врз формирањето на аддукт на BPDE-DNA во hEL клетките.(А) Нокдаун Nrf2 беше потврден со вестерн blotting.(Б) Квантификација на интензитетот на опсегот Nrf2.(В) Ефект на соборувањето на Nrf2 врз нивоата на аддуктот на BPDE-DNA во hEL клетките третирани со B(a)P и G-Rg3r.(Д) Ефект на соборувањето на Nrf2 врз нивоата на аддуктот на BPDE-DNA во hEL клетките третирани со B(a)P и G-Rg3.Податоците се изразуваат како средна вредност ± стандардна девијација на тројно определување.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Оваа студија ги процени превентивните ефекти на различни екстракти од црвен женшен на модел на глушец на B(a)P-индуциран рак на белите дробови, а третманот со KRGB значително го намали оптоварувањето на туморот.Имајќи предвид дека G-Rg3 има најголема содржина во овој екстракт од женшен, проучена е важната улога на овој женсенозид во инхибиција на туморигенезата.И G-Rg3r и G-Rg3 (два епимери на G-Rg3) значително го намалија оптоварувањето на туморот во модел на глушец на B(a)P-индуциран карцином.G-Rg3r и G-Rg3 имаат антиканцерогени ефекти со индуцирање апоптоза на клетките на туморот21, инхибирање на растот на туморот22, запирање на клеточниот циклус23 и влијание на ангиогенезата24.Исто така, се покажа дека G-Rg3 ја инхибира клеточната метастаза25, а способноста на G-Rg3 да ги подобри ефектите на хемотерапијата и радиотерапијата е документирана26,27.Poon et al покажаа дека третманот со G-Rg3 може да ги намали генотоксичните ефекти на B(a)P28.Оваа студија го покажува терапевтскиот потенцијал на G-Rg3 во таргетирање на канцерогените молекули на животната средина и спречување на рак.
И покрај нивниот добар профилактички потенцијал, лошата орална биорасположивост на ginsenosides претставува предизвик за клиничката употреба на овие молекули.Фармакокинетската анализа на орална администрација на женсенозиди кај стаорци покажа дека неговата биорасположивост е сè уште помала од 5%29.Овие тестови покажаа дека по 20-неделниот период на третман, само нивоата на Rg5 во крвта се намалија.Иако основниот механизам на лошата биорасположивост останува да се разјасни, се смета дека P-gp е вклучен во одливот на ginsenosides.Оваа работа за прв пат покажа дека администрацијата на верапамил, блокатор на P-gp, ја зголемува оралната биорасположивост на G-Rg3r и G-Rg3s.Така, ова откритие сугерира дека G-Rg3r и G-Rg3s делуваат како супстрати на P-gp за да го регулираат неговиот одлив.
Оваа работа покажува дека комбинираниот третман со верапамил ја зголемува оралната биорасположивост на G-Rg3 кај глувчешки модел на рак на белите дробови.Овој наод е поддржан од зголемен цревен трансцелуларен транспорт на G-Rg3 при блокада на P-gp, со што се зголемува неговата апсорпција.Анализите во клетките на Caco2 покажаа дека третманот со верапамил го намалува одливот на G-Rg3r и G-Rg3s додека ја подобрува пропустливоста на мембраната.Студијата на Јанг и сор.Студиите покажаа дека третманот со циклоспорин А (друг блокатор на P-gp) ја зголемува биорасположивоста на ginsenoside Rh2 од основната вредност од 1%20 на повеќе од 30%.Соединенијата на гинсенозидите K и Rg1 исто така покажаа слични резултати30,31.Кога верапамил и циклоспорин А беа истовремено администрирани, одливот на соединението К во клетките на Caco-2 беше значително намален од 26,6 на помалку од 3, додека неговите интрацелуларни нивоа се зголемија за 40 пати30.Во присуство на верапамил, нивоата на Rg1 се зголемија во епителните клетки на белите дробови на стаорец, што укажува на улога на P-gp во ефлуксот на женсенозид, како што е прикажано од Менг и сор.31.Сепак, верапамилот го немаше истиот ефект врз одливот на некои гинсенозиди (како што се Rg1, F1, Rh1 и Re), што покажува дека тие не се засегнати од P-gp супстратите, како што е прикажано од Liang et al.32 .Оваа опсервација може да биде поврзана со вклучување на други транспортери и алтернативни структури на ginsenoside.
Механизмот на превентивниот ефект на G-Rg3 врз ракот е нејасен.Претходните студии покажаа дека G-Rg3 спречува оштетување на ДНК и апоптоза преку намалување на оксидативниот стрес и воспаление16,33, што може да биде основниот механизам за спречување на туморигенезата индуцирана од B(a)P.Некои извештаи покажуваат дека генотоксичноста индуцирана од B(a)P може да се намали со модулирање на ензимите од фаза II за да се формира BPDE-DNA34.GST е типичен ензим од фаза II кој го инхибира формирањето на аддукт на BPDE-DNA преку промовирање на врзувањето на GSH за BPDE, а со тоа го намалува оштетувањето на ДНК предизвикано од B(a)P35.Нашите резултати покажуваат дека третманот со G-Rg3 ја намалува цитотоксичноста индуцирана од B(a)P и формирањето на аддукт на BPDE-DNA во hEL клетките и ја обновува експресијата и активноста на GST ин витро.Сепак, овие ефекти беа отсутни во отсуство на Nrf2, што сугерира дека G-Rg3 индуцира цитопротективни ефекти преку патеката Nrf2.Nrf2 е главен фактор на транскрипција за ензимите за детоксикација во фаза II што го промовира клиренсот на ксенобиотиците36.Активирањето на патеката Nrf2 индуцира цитопротекција и го намалува оштетувањето на ткивото37.Покрај тоа, неколку извештаи ја поддржаа улогата на Nrf2 како супресор на тумор во канцерогенезата38.Нашата студија покажува дека индукцијата на патеката Nrf2 со G-Rg3 игра важна регулаторна улога во генотоксичноста индуцирана од B(a)P со тоа што предизвикува детоксикација на B(a)P преку активирање на ензимите од фаза II, а со тоа го инхибира процесот на туморигенеза.
Нашата работа го открива потенцијалот на црвениот женшен во спречувањето на B(a)P-индуцираниот рак на белите дробови кај глувците преку важното вклучување на ginsenoside G-Rg3.Лошата орална биорасположивост на оваа молекула ја попречува нејзината клиничка примена.Сепак, оваа студија за прв пат покажува дека G-Rg3 е супстрат на P-gp, а администрацијата на P-gp инхибитор ја зголемува биорасположивоста на G-Rg3 in vitro и in vivo.G-Rg3 ја намалува цитотоксичноста индуцирана од B(a)P преку регулирање на патеката Nrf2, што може да биде потенцијален механизам за неговата превентивна функција.Нашата студија го потврдува потенцијалот на ginsenoside G-Rg3 за превенција и третман на рак на белите дробови.
Шестнеделни женски A/J глувци (20 ± 1 g) и машки Wistar стаорци стари 7 недели (250 ± 20 g) беа добиени од Лабораторијата Џексон (Бар Харбор, САД) и Институтот за зоологија во Вухан.Универзитет (Вухан, Кина).Кинескиот центар за собирање култура на типови (Вухан, Кина) ни обезбеди клетки Caco-2 и hEL.Сигма-Олдрич (Сент Луис, САД) е извор на B(a)P и трикаприн.Прочистените гинсенозиди G-Rg3r и G-Rg3s, диметил сулфоксид (DMSO), комплет за анализа за пролиферација CellTiter-96 (MTS), верапамил, минимален есенцијален медиум (MEM) и серум од фетусот говеда (FBS) се купени од Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Ченгду, Кина).Мини комплетот QIAamp DNA и комплетот BPDE-DNA аддуктна ELISA беа купени од Qiagen (Стенфорд, Калифорнија, САД) и Cell Biolabs (Сан Диего, Калифорнија, САД).Комплет за анализа на активноста на GST и комплет за анализа на вкупниот протеин (стандарден BCA метод) беа купени од Solarbio (Пекинг, Кина).Сите екстракти од црвен женшен се чуваат во лабораторијата Мингју 7. Баптистичкиот универзитет во Хонг Конг (Хонг Конг, Кина) и Центарот за рак на Кореја (Сеул, Кореја) се комерцијални извори на екстракт од ЦРГ и разни екстракти од црвен женшен од различно корејско потекло (вклучувајќи ги КРГА, КРГБ и КРГЦ).Црвениот женшен е направен од корените на 6-годишниот свеж женшен.Екстрактот од црвен женшен се добива со миење на женшен со вода три пати, потоа концентрирање на водениот екстракт и на крајот сушење на ниска температура за да се добие екстракт од женшен во прав.Антитела (анти-Nrf2, анти-GST и β-актин), имуноглобулин G (IgG) конјугиран со пероксидаза од рен, реагенс за трансфекција, контролна siRNA и Nrf2 siRNA беа купени од биотехнологијата Санта Круз (Санта Круз, Калифорнија) .), САД).
Caco2 и hEL клетките беа култивирани во садови за клеточна култура од 100 mm2 со MEM што содржи 10% FBS на 37 °C во навлажнета атмосфера од 5% CO2.За да се одреди ефектот на условите за третман, hEL-клетките беа инкубирани со различни концентрации на B(a)P и G-Rg3 во MEM за 48 часа.Клетките може дополнително да се анализираат или собираат за да се подготват екстракти без клетки.
Сите експерименти беа одобрени од Комитетот за етика на експериментални животни на Медицинскиот колеџ Тонџи, Универзитетот за наука и технологија Хуажонг (Одобрение бр. 2019; регистрација бр. 4587TH).Сите експерименти беа извршени во согласност со релевантните упатства и прописи, а студијата беше спроведена во согласност со упатствата за Истражување на животни: Известување за In Vivo Experiments (ARRIVE).На глувците A/J стари осум недели прво им беше интраперитонеално инјектирана B(a)P во раствор на трикаприн (100 mg/kg, 0,2 ml).По една недела, глувците беа случајно поделени во контролни групи и различни групи за третман, по 15 глувци во секоја група и беа земени еднаш дневно.По 20 недели од третманот, животните беа жртвувани со асфиксија на CO2.Белите дробови беа собрани и фиксирани 24 часа.Бројот на површни тумори и индивидуалните големини на туморот беа квантифицирани за секое белодробно крило под дисекциски микроскоп.Проценките за волуменот на туморот (V) беа пресметани со користење на следниов израз: V (mm3) = 4/3πr3, каде што r е дијаметарот на туморот.Нето збирот на сите волумени на туморот во белите дробови на глувците го претставуваше вкупниот волумен на туморот, а просечниот вкупен волумен на туморот во секоја група го претставуваше оптоварувањето на туморот.Примероците од целата крв и цревата беа собрани и складирани на -80°C за определување UPLC-MS/MS.Беше собран серум и се користеше автоматски хемиски анализатор за анализа на нивоата на аланин аминотрансфераза (ALT) и серумски креатинин (Cr) за да се процени функцијата на црниот дроб и бубрезите.
Собраните примероци беа отстранети од ладно складирање, одмрзнати, измерени и ставени во цевки како што е опишано погоре.На ова беше додаден 0,5 μM флоризин (внатрешен стандард) во 0,8 ml раствор на метанол.Ткивото потоа беше хомогенизирано со користење на Tissue-Tearor и хомогенатот последователно беше префрлен во микроцентрифуга цевка од 1,5 ml.Смесата се центрифугира на 15500 вртежи во минута 15 минути.Откако ќе се извади 1,0 ml од супернатантот, се суши со азот.Двесте микролитри метанол беа искористени за обновување.Крвта се собира и обработува на една линија и се користи како референца за сите мерења.
Трансвел плочите од 24 бунари беа засеани со 1,0 × 105 Caco-2 клетки по бунар за да се оцени потенцијалното подобрување на транспортот на G-Rg3 со додавање на верапамил.По 3 недели култура, клетките беа измиени со HBSS и преинкубирани на 37°C.400 μL од 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, или мешавина со 50 или 100 μM верапамил) беа инјектирани на базолатералната или апикалната страна на монослојот, а 600 μL раствор на HBSS беа додадени на другиот страна.Соберете 100 µl културен медиум во одредените времиња (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути) и додадете 100 µl HBSS за да го дополните овој волумен.Примероците беа складирани на -4 °C до откривање со UPLC-MS/MS.Изразот Papp = dQ/(dT × A × C0) се користи за квантифицирање на очигледната еднонасочна апикална и базолатерална пропустливост и обратно (Pa-b и Pb-a, соодветно);dQ/dT е промената на концентрацијата, A (0,6 cm2) е површината на еднослојот, а C0 е почетната донорска концентрација.Односот на ефлукс се пресметува како Pb-a/Pa-b, што ја претставува стапката на одлив на испитуваниот лек.
Машките стаорци од Вистар биле гладни 24 часа, пиеле само вода и биле анестезирани со интравенска инјекција од 3,5% раствор на пентобарбитал.Интубираната силиконска цевка го има крајот на дуоденумот како влез и крајот на илеумот како излез.Користете перисталтичка пумпа за пумпање на влезот со 10 µM G-Rg3r или G-Rg3s во изотоничен HBSS со брзина на проток од 0,1 ml/min.Ефектот на верапамил беше оценет со додавање на 50 μM или 100 μM од соединението на 10 μM G-Rg3r или G-Rg3s.UPLC-MS/MS беше изведена на екстракти за перфузија собрани во временските точки 60, 90, 120 и 150 минути по почетокот на перфузијата.Процентот на апсорпција се квантифицира со формулата % апсорпција = (1 – Cout/Cin) × 100%;концентрацијата на G-Rg3 на излезот и влезот е изразена со Cout и Cin, соодветно.
hEL клетките беа засеани во плочи со 96 бунари со густина од 1 × 104 клетки по бунар и третирани со B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) или G-Rg3 растворен во DMSO .Лековите потоа беа разредени со медиум за култура до различни концентрации (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) во текот на 48 часа.Со користење на комерцијално достапен комплет за анализа на MTS, клетките беа подложени на стандарден протокол и потоа беа измерени со помош на читач на микроплоча на 490 nm.Нивото на одржливост на клетките на групите третирани заедно со B(a)P (10 μM) и G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) беше оценето според горенаведениот метод и споредено со нетретираната група.
hEL-клетките беа засеани во плочи со 6 бунари со густина од 1 × 105 клетки/бунар и беа третирани со 10 μMB(a) P во присуство или отсуство на 10 μM G-Rg3.По 48 часа третман, ДНК беше извлечена од hEL клетките со користење на QIAamp DNA Mini Kit според протоколот на производителот.Формирањето на BPDE-DNA адукти беше откриено со користење на комплет ELISA за аддуктирање на BPDE-DNA.Релативните нивоа на аддуктот на BPDE-DNA беа измерени со помош на читач на микроплоча со мерење на апсорпција на 450 nm.
hEL-клетките беа засеани во плочи со 96 бунари со густина од 1 × 104 клетки по бунар и третирани со 10 μMB(a) P во отсуство или присуство на 10 μM G-Rg3 за 48 часа.Активноста на GST беше измерена со помош на комерцијален комплет за анализа на активноста на GST според протоколот на производителот.Релативната активација на GST беше измерена со апсорпција на 450 nm со помош на читач на микроплочи.
hEL-клетките беа измиени со ладен PBS и потоа се лизираа со користење на пуфер за анализа на радиоимунопреципитација што содржи инхибитори на протеаза и инхибитори на фосфатаза.По квантификацијата на протеините со користење на комплет за анализа на вкупниот протеин, 30 μg протеин во секој примерок беа одвоени со 12% SDS-PAGE и пренесени во PVDF мембрана со електрофореза.Мембраните беа блокирани со 5% обезмастено млеко и инкубирани со примарни антитела преку ноќ на 4°C.По инкубацијата со секундарни антитела конјугирани со пероксидаза од рен, додадени се реагенси за зголемена хемилуминисценција за да се визуелизира сигналот за врзување.Интензитетот на секоја протеинска лента беше квантифициран со помош на софтверот ImageJ.
Софтверот GraphPad Prism 7.0 беше користен за анализа на сите податоци, изразени како средна вредност ± стандардна девијација.Варијацијата помеѓу групите за третман беше оценета со помош на Студентски t тест или еднонасочна анализа на варијансата, со P вредност <0,05 што укажува на статистичка значајност.
Сите податоци добиени или анализирани во текот на оваа студија се вклучени во оваа објавена статија и дополнителни информативни датотеки.
Торе, Лос Анџелес, Сигел, РЛ и Џемал, А. Статистика за рак на белите дробови.прилог.Истечен.лек.биологија.893, 1-19 (2016).
Hecht, S. Тутунски канцерогени, нивните биомаркери и канцер предизвикан од тутун.Нат.Капелан на ракот.3, 733-744 (2003).
Phillips, DH и Venitt, S. ДНК и протеински адукти во човечки ткива кои произлегуваат од изложеност на чад од тутун.интернационалноста.J. Рак.131, 2733-2753 (2012).
Јанг Ј., Ванг Ј., Танг К., Лубет РА и Ју М. Ефект на Houttuynia cordata и силибинин врз туморигенезата на белите дробови индуцирана од бензо(а) пирен кај глувците А/Ј.Рак 7, 1053-1057 (2005).
Танг, В. и сор.Антиканцероген природен производ изолиран од кинески медицински материјали.вилицата.лек.6, 27 (2011).
Јанг, Ј. и сор.Ефикасноста на полифенонот Е, црвениот женшен и рапамицинот врз туморигенезата на белите дробови индуцирана од бензо(а) пирен кај глувците A/J.Рак 8, 52-58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS и Yuan, KS Red, вклучување во терапија за рак.вилицата.Џ. Нут.лек.14, 7-16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS и Gao, L. Ginsenosides во корените и листовите на американскиот женшен.J. Agric.Хемија на храна.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA и Yuan KS Фармакологија на женшен: многу компоненти и многу ефекти.биохемија.фармакологија.58, 1685–1693 (1999).
Време на објавување: 17-ти септември 2023 година