Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk hasil terbaik, kami mengesyorkan menggunakan versi penyemak imbas anda yang lebih baharu (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan tapak tanpa penggayaan atau JavaScript.
Ginseng merah telah digunakan dalam perubatan tradisional Asia selama beratus-ratus tahun.Dalam kajian ini, kami menilai keupayaan empat jenis ginseng merah (ginseng merah Cina, ginseng merah Korea A, ginseng merah Korea B, dan ginseng merah Korea C) yang ditanam di kawasan yang berbeza untuk menghalang pembentukan dan pertumbuhan paru-paru yang disebabkan oleh karsinogen. tumor.Ujian benzo(a)pyrene (B(a)P) telah dijalankan ke atas tikus A/J, dan ginseng merah Korea B didapati paling berkesan dalam mengurangkan beban tumor di antara empat jenis ginseng merah.Di samping itu, kami menganalisis kandungan pelbagai ginsenosides (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 dan Rg5) dalam empat ekstrak ginseng merah dan mendapati bahawa ginseng merah Korea B mempunyai ginsenoside Rg3 (G-Rg3) yang paling tinggi, menunjukkan bahawa G-Rg3 mungkin memainkan peranan penting dalam keberkesanan terapeutiknya.Kerja ini menunjukkan bahawa G-Rg3 mempunyai bioavailabiliti yang agak rendah.Walau bagaimanapun, apabila G-Rg3 ditadbir bersama dengan verapamil perencat P-gp, efluks G-Rg3 ke dalam sel Caco-2 telah berkurangan, kadar penyerapan usus G-Rg3 telah meningkat dalam model tikus, dan G-Rg3 telah meningkat.Dalam sel Caco-2, aliran keluar Rg3 berkurangan, dan tahap kepekatan Rg3 berkurangan.G-Rg3 meningkat dalam usus dan plasma, dan keupayaannya untuk mencegah tumor juga dipertingkatkan dalam model tikus tumorigenesis yang disebabkan oleh B (a) P.Kami juga mendapati bahawa G-Rg3 mengurangkan sitotoksisiti yang disebabkan oleh B (a) P dan pembentukan tambahan DNA dalam sel paru-paru manusia, dan memulihkan ekspresi dan aktiviti enzim fasa II melalui laluan Nrf2, yang mungkin berkaitan dengan mekanisme tindakan yang berpotensi perencatan G -Rg3..Mengenai kejadian tumor paru-paru.Kajian kami menunjukkan peranan yang berpotensi penting untuk G-Rg3 dalam menyasarkan tumor paru-paru dalam model tetikus.Ketersediaan hayati oral ginsenoside ini dipertingkatkan dengan mensasarkan P-glikoprotein, membolehkan molekul memberikan kesan antikanser.
Jenis kanser paru-paru yang paling biasa ialah kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC), yang merupakan salah satu punca utama kematian kanser di China dan Amerika Utara1,2.Faktor utama yang meningkatkan risiko mendapat kanser paru-paru bukan sel kecil ialah merokok.Asap rokok mengandungi lebih daripada 60 karsinogen, termasuk benzo(a)pirena (B(a)P), nitrosamin, dan isotop radioaktif daripada pereputan radon.3 Hidrokarbon aromatik polisiklik B(a)P adalah punca utama ketoksikan dalam rokok. asap.Apabila terdedah kepada B(a)P, cytochrome P450 menukarkannya kepada B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE), yang bertindak balas dengan DNA untuk membentuk BPDE-DNA adduct 4. Selain itu, ini adducts mendorong tumorigenesis paru-paru pada tikus dengan peringkat tumor dan histopatologi yang serupa dengan tumor paru-paru manusia5.Ciri ini menjadikan model kanser paru-paru yang disebabkan oleh B(a)P sebagai sistem yang sesuai untuk menilai sebatian yang mungkin mempunyai sifat antikanser.
Satu strategi yang mungkin untuk mencegah perkembangan kanser paru-paru dalam kumpulan berisiko tinggi, terutamanya perokok, adalah penggunaan agen kemopreventif untuk menyekat perkembangan lesi neoplastik intraepithelial dan dengan itu menghalang perkembangan seterusnya kepada keganasan.Kajian haiwan menunjukkan bahawa pelbagai agen kemopreventif berkesan6.Laporan kami sebelum ini7 menyerlahkan kesan pencegahan yang baik ginseng merah pada kanser paru-paru.Herba ini telah digunakan selama berabad-abad dalam perubatan tradisional Asia untuk memanjangkan hayat dan kesihatan, dan telah didokumenkan mempunyai kesan antitumor8.
Faktor aktif ginseng ialah ginsenoside, yang digunakan sebagai penanda komposit untuk menilai kualiti ekstrak ginseng.Analisis kuantitatif ekstrak ginseng mentah biasanya melibatkan penggunaan beberapa ginsenosides, termasuk RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5, dan Rc9,10.Ginsenosides mempunyai sedikit kegunaan klinikal kerana bioavailabiliti oral yang sangat lemah11.Walaupun mekanisme untuk bioavailabiliti yang lemah ini tidak jelas, pengeluaran ginsenosides yang disebabkan oleh P-glycoprotein (P-gp)12 mungkin menjadi punca.P-gp ialah salah satu pengangkut efluks yang paling penting dalam superfamili pengangkut kaset pengikat ATP, yang menggunakan tenaga hidrolisis ATP untuk melepaskan bahan intraselular ke dalam persekitaran luaran.Pengangkut P-gp biasanya diedarkan secara meluas dalam penghalang usus, buah pinggang, hati dan darah-otak13.P-gp memainkan peranan penting dalam penyerapan usus, dan perencatan P-gp meningkatkan penyerapan oral dan ketersediaan beberapa ubat antikanser12,14.Contoh perencat yang digunakan sebelum ini dalam kesusasteraan ialah verapamil dan cyclosporine A15.Kerja ini melibatkan penubuhan sistem tetikus untuk mengkaji kanser paru-paru yang disebabkan oleh B (a) P untuk menilai keupayaan ekstrak ginseng merah yang berbeza dari China dan Korea untuk menjejaskan keganasan.Ekstrak telah dianalisis secara individu untuk mengenal pasti ginsenosides tertentu yang boleh menjejaskan karsinogenesis.Verapamil kemudiannya digunakan untuk menyasarkan P-gp dan meningkatkan bioavailabiliti oral dan keberkesanan terapeutik ginsenosides yang menyasarkan kanser.
Mekanisme di mana saponin ginseng memberi kesan terapeutik terhadap karsinogenesis masih tidak jelas.Penyelidikan telah menunjukkan bahawa pelbagai ginsenosides boleh mengurangkan kerosakan DNA yang disebabkan oleh karsinogen dengan mengurangkan tekanan oksidatif dan mengaktifkan enzim detoksifikasi fasa II, dengan itu menghalang kerosakan sel.Glutathione S-transferase (GST) ialah enzim fasa II tipikal yang diperlukan untuk mengurangkan kerosakan DNA yang disebabkan oleh karsinogen17.Faktor 2 berkaitan erythroid nuklear 2 (Nrf2) ialah faktor transkripsi penting yang mengawal homeostasis redoks dan mengaktifkan ekspresi enzim fasa II dan tindak balas antioksidan sitoprotektif18.Kajian kami juga mengkaji kesan ginsenosida yang dikenal pasti pada mengurangkan sitotoksisiti yang disebabkan oleh B (a) P dan pembentukan tambahan BPDE-DNA, serta mendorong enzim fasa II dengan memodulasi laluan Nrf2 dalam sel paru-paru normal.
Penubuhan model tetikus kanser yang disebabkan oleh B(a)P adalah konsisten dengan kerja sebelumnya5.Rajah 1A menunjukkan reka bentuk eksperimen rawatan 20 minggu model kanser tikus yang disebabkan oleh B(a)P, air (kawalan), ekstrak ginseng merah Cina (CRG), ekstrak ginseng merah Korea A (KRGA), dan merah Korea ginseng.Ekstrak B (KRGB) dan Ekstrak Ginseng Merah Korea C (KRGC).Selepas 20 minggu rawatan ginseng merah, tikus telah dikorbankan oleh sesak nafas CO2.Rajah 1B menunjukkan tumor paru-paru makroskopik dalam haiwan yang dirawat dengan pelbagai jenis ginseng merah, dan Rajah 1C menunjukkan mikrograf cahaya yang mewakili sampel tumor.Beban tumor haiwan yang dirawat KRGB (1.5 ± 0.35) adalah lebih rendah daripada haiwan kawalan (0.82 ± 0.2, P <0.05), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1D.Tahap purata perencatan beban tumor ialah 45%.Ekstrak ginseng merah lain yang diuji tidak menunjukkan perubahan ketara dalam beban tumor (P > 0.05).Tiada kesan sampingan yang jelas diperhatikan dalam model tetikus selama 20 minggu rawatan ginseng merah, termasuk tiada perubahan dalam berat badan (data tidak ditunjukkan) dan tiada ketoksikan hati atau buah pinggang (Rajah 1E, F).
Ekstrak ginseng merah merawat perkembangan tumor paru-paru dalam tikus A/J.(A) Reka bentuk eksperimen.(B) Tumor paru-paru besar dalam model tetikus.Tumor ditunjukkan oleh anak panah.a: Kumpulan ginseng merah Cina.b: kumpulan A ginseng merah Korea.c: Kumpulan ginseng merah Korea B. d: Kumpulan ginseng merah Korea C. d: Kumpulan kawalan.(C) Mikrograf cahaya menunjukkan tumor paru-paru.Pembesaran: 100. b: 400. (D) Beban tumor dalam kumpulan ekstrak ginseng merah.(E) Tahap plasma enzim hati ALT.(F) Tahap plasma enzim buah pinggang Cr.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai.*P <0.05.
Ekstrak ginseng merah yang dikenal pasti dalam kajian ini dianalisis oleh spektrometri jisim tandem kromatografi cecair berprestasi ultra (UPLC-MS/MS) untuk mengukur ginsenosida berikut: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3 , Rh2, F1, Rk1 dan Rg5.Keadaan UPLC dan MS yang digunakan untuk mengukur analit telah diterangkan dalam laporan sebelumnya19.Kromatogram UPLC-MS/MS bagi empat ekstrak ginseng merah ditunjukkan dalam Rajah 2A.Terdapat perbezaan yang ketara dalam jumlah kandungan ginsenoside, dengan jumlah kandungan ginsenoside tertinggi dalam CRG (590.27 ± 41.28 μmol/L) (Rajah 2B).Apabila menilai ginsenosida individu (Rajah 2C), KRGB menunjukkan paras tertinggi G-Rg3 berbanding ginsenosida lain (58.33 ± 3.81 μmol/L untuk G-Rg3s dan 41.56 ± 2.88 μmol/L untuk G -Rg3r).L).jenis ginseng merah (P <0.001).G-Rg3 berlaku sebagai sepasang stereoisomer G-Rg3r dan G-Rg3s, yang berbeza dalam kedudukan kumpulan hidroksil pada karbon 20 (Rajah 2D).Keputusan menunjukkan bahawa G-Rg3r atau G-Rg3 mungkin mempunyai potensi antikanser yang penting dalam model tikus kanser yang disebabkan oleh B (a) P.
Kandungan ginsenosides dalam pelbagai ekstrak ginseng merah.(A) Kromatogram UPLC-MS/MS daripada empat ekstrak ginseng merah.(B) Anggaran jumlah kandungan ginsenoside dalam ekstrak yang ditunjukkan.(C) Pengesanan ginsenosides individu dalam ekstrak berlabel.(D) Struktur stereoisomer ginsenoside G-Rg3r dan G-Rg3s.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai penentuan tiga kali ganda.***P <0.001.
Kajian UPLC-MS/MS memerlukan kuantifikasi ginsenosides dalam sampel usus dan darah selepas 20 minggu rawatan.Rawatan dengan KRGB menunjukkan kehadiran hanya 0.0063 ± 0.0005 μg/ml Rg5 dalam darah.Tiada ginsenosides yang tinggal dikesan, menunjukkan bioavailabiliti oral yang lemah dan oleh itu mengurangkan pendedahan kepada ginsenosides ini.
Barisan sel adenokarsinoma kolon Caco-2 secara morfologi dan biokimia serupa dengan sel epitelium usus manusia, menunjukkan kegunaannya dalam menilai pengangkutan enterosit merentasi halangan epitelium usus.Analisis ini berdasarkan kajian terdahulu 20 .Rajah 3A, B, C, D, E, F menunjukkan imej perwakilan pengangkutan transselular G-Rg3r dan G-Rg3 menggunakan model monolayer Caco-2.Pengangkutan transselular G-Rg3r atau G-Rg3 merentasi monolayers Caco-2 dari sisi basolateral ke sisi apikal (Pb-a) adalah jauh lebih tinggi daripada dari sisi apikal ke sisi basolateral (Pa-b).Bagi G-Rg3r, nilai purata Pa-b ialah 0.38 ± 0.06, yang meningkat kepada 0.73 ± 0.06 selepas rawatan dengan 50 μmol/L verapamil dan kepada 1.14 ± 0.09 selepas rawatan dengan 100 μmol/L verapamil (p < 0.01, 0.01 dan 0.01 masing-masing;3A).Pemerhatian untuk G-Rg3 mengikuti corak yang sama (Rajah 3B), dan keputusan menunjukkan bahawa rawatan verapamil meningkatkan pengangkutan G-Rg3r dan G-Rg3.Rawatan verapamil juga mengakibatkan penurunan ketara dalam nisbah efluks Pb-a dan G-Rg3r dan G-Rg3s yang ketara (Rajah 3C,D,E,F), menunjukkan bahawa rawatan verapamil mengurangkan kandungan ginsenoside dalam sel efluks Caco-2..
Pengangkutan transselular G-Rg3 dalam monolayers Caco-2 dan penyerapan usus dalam ujian perfusi tikus.(A) Nilai Pa-b kumpulan G-Rg3r dalam monolayer Caco-2.(B) Nilai Pa-b kumpulan G-Rg3s dalam monolayer Caco-2.(C) Nilai Pb kumpulan G-Rg3r dalam monolayer Caco-2.(D) Nilai Pb kumpulan G-Rg3s dalam monolayer Caco-2.(E) Nisbah hasil kumpulan G-Rg3r dalam satu lapisan Caco-2.(F) Nisbah hasil kumpulan G-Rg3 dalam satu lapisan Caco-2.(G) Peratusan penyerapan usus G-Rg3r dalam ujian perfusi dalam tikus.(H) Peratusan penyerapan usus G-Rg3 dalam ujian perfusi dalam tikus.Kebolehtelapan dan penyerapan dibandingkan tanpa penambahan verapamil.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai bagi lima eksperimen bebas.*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
Selaras dengan kerja terdahulu20, perfusi usus ortotopik tikus dilakukan untuk menentukan sama ada penyerapan G-Rg3 dalam usus meningkat selepas rawatan verapamil.Angka 3G, H menunjukkan ujian perfusi perwakilan untuk menilai peratusan penyerapan usus G-Rg3r dan G-Rg3 dalam tikus model kanser dalam tempoh masa di atas.Peratusan awal pengambilan G-Rg3r yang lemah kira-kira 10% meningkat kepada lebih daripada 20% selepas rawatan dengan 50 μM verapamil dan kepada lebih daripada 25% selepas rawatan dengan 100 μM verapamil.Begitu juga, G-Rg3, yang mempunyai pengambilan awal sebanyak 10%, juga menunjukkan puncak lebih daripada 20% selepas rawatan dengan 50 μM verapamil dan hampir 30% selepas rawatan dengan 100 μM verapamil, menunjukkan bahawa perencatan P-gp oleh verapamil meningkatkan Rg3 penyerapan G usus dalam model tetikus kanser paru-paru.
Mengikut kaedah di atas, tikus model kanser yang disebabkan oleh B (a) P telah dibahagikan secara rawak kepada enam kumpulan, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A.Tiada penurunan berat badan yang ketara atau tanda-tanda ketoksikan klinikal diperhatikan dalam kumpulan rawatan G-Rg3 berbanding kumpulan kawalan (data tidak ditunjukkan).Selepas 20 minggu rawatan, paru-paru setiap tetikus dikumpulkan.Rajah 4B menunjukkan tumor paru-paru makroskopik pada tikus dalam kumpulan rawatan di atas, dan Rajah 4C menunjukkan mikrograf cahaya perwakilan tumor perwakilan.Mengenai beban tumor dalam setiap kumpulan (Rajah 4D), nilai untuk tikus yang dirawat dengan G-Rg3r dan G-Rg3s ialah 0.75 ± 0.29 mm3 dan 0.81 ± 0.30 mm3, masing-masing, manakala nilai untuk G Tikus dirawat. dengan -Rg3s ialah 1.63 masing-masing ±0.40 mm3.tikus kawalan (p <0.001), menunjukkan bahawa rawatan G-Rg3 mengurangkan beban tumor pada tikus.Pentadbiran verapamil meningkatkan lagi pengurangan ini: nilai dalam tikus verapamil+ G-Rg3r menurun daripada 0.75 ± 0.29 mm3 kepada 0.33 ± 0.25 mm3 (p <0.01), dan nilai untuk verapamil+ daripada 0.81 ± 0.30 mm3 menurun kepada 0.81 ± 0.30 mm3 mm3 dalam tikus yang dirawat G. -Rg3s (p <0.05), menunjukkan bahawa verapamil boleh meningkatkan kesan perencatan G-Rg3 pada tumorigenesis.Beban tumor tidak menunjukkan perbezaan yang ketara antara kumpulan kawalan dan kumpulan verapamil, kumpulan G-Rg3r dan kumpulan G-Rg3s, dan kumpulan verapamil+G-Rg3r dan kumpulan verapamil+G-Rg3s.Selain itu, tiada ketoksikan hati atau buah pinggang yang ketara yang berkaitan dengan rawatan yang dinilai (Rajah 4E, F).
Beban tumor selepas rawatan G-Rg3 dan plasma atau tahap G-Rg3r dan G-Rg3 usus dalam kumpulan yang ditunjukkan.(A) Reka bentuk eksperimen.( B ) Tumor makroskopik dalam model tetikus.Tumor ditunjukkan oleh anak panah.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r dalam kombinasi dengan verapamil.d: G-Rg3 dalam kombinasi dengan verapamil.d: Verapamil.e: kawalan.(C) Mikrograf optik tumor pada pembesaran.Jawapan: 100x.b: 400X.(D) Kesan rawatan G-Rg3 + verapamil pada beban tumor dalam tikus A / J.(E) Tahap plasma enzim hati ALT.(F) Tahap plasma enzim buah pinggang Cr.(G) Tahap plasma G-Rg3r atau G-Rg3 daripada kumpulan yang ditunjukkan.(H) Tahap G-Rg3r atau G-Rg3s dalam usus kumpulan yang ditunjukkan.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai penentuan tiga kali ganda.*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
Tahap G-Rg3 dalam tikus model kanser yang disebabkan oleh B (a) P telah dinilai oleh UPLC-MS / MS selepas tempoh rawatan 20 minggu mengikut kaedah yang diterangkan dalam bahagian Kaedah.Rajah 4G dan H menunjukkan plasma dan paras G-Rg3 usus, masing-masing.Tahap G-Rg3r plasma ialah 0.44 ± 0.32 μmol/L dan meningkat kepada 1.17 ± 0.47 μmol/L dengan pemberian verapamil serentak (p < 0.001), manakala paras G-Rg3r usus ialah 0.53 ± 0.08 µg.Apabila digabungkan dengan verapamil, g meningkat kepada 1.35 ± 0.13 μg/g (p < 0.001).Untuk G-Rg3, hasilnya mengikuti corak yang sama, menunjukkan bahawa rawatan verapamil meningkatkan bioavailabiliti oral G-Rg3 dalam tikus A / J.
Ujian daya maju sel digunakan untuk menilai sitotoksisiti B (a) P dan G-Rg3 pada sel hEL.Sitotoksisiti yang disebabkan oleh B(a)P dalam sel hEL ditunjukkan dalam Rajah 5A, manakala sifat tidak toksik G-Rg3r dan G-Rg3 ditunjukkan dalam Rajah 5A dan 5B.5B, C. Untuk menilai kesan sitoprotektif G-Rg3, B(a)P ditadbir bersama dengan pelbagai kepekatan G-Rg3r atau G-Rg3 ke dalam sel hEL.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5D, G-Rg3r pada kepekatan 5 μM, 10 μM, dan 20 μM memulihkan daya maju sel masing-masing kepada 58.3%, 79.3%, dan 77.3%.Keputusan yang sama juga boleh dilihat dalam kumpulan G-Rg3s.Apabila kepekatan G-Rg3s ialah 5 µM, 10 µM dan 20 µM, daya maju sel telah dipulihkan kepada 58.3%, 72.7% dan 76.7%, masing-masing (Rajah 5E).).Kehadiran tambahan BPDE-DNA diukur menggunakan kit ELISA.Keputusan kami menunjukkan bahawa tahap tambahan BPDE-DNA meningkat dalam kumpulan yang dirawat B (a) P berbanding dengan kumpulan kawalan, tetapi berbanding dengan rawatan bersama G-Rg3, tahap tambahan BPDE-DNA dalam kumpulan B (a) P B dalam kumpulan yang dirawat, tahap tambahan DNA telah dikurangkan dengan ketara.Keputusan rawatan dengan B(a)P sahaja ditunjukkan dalam Rajah 5F (1.87 ± 0.33 vs. 3.77 ± 0.42 untuk G-Rg3r, 1.93 ± 0.48 vs. 3.77 ± 0.42 untuk G -Rg3s, p < 0.001).
Daya maju sel dan pembentukan tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL yang dirawat dengan G-Rg3 dan B(a)P.(A) Daya maju sel hEL yang dirawat dengan B(a)P.(B) Daya maju sel hEL yang dirawat dengan G-Rg3r.(C) Daya maju sel hEL yang dirawat dengan G-Rg3.(D) Daya maju sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3r.(E) Daya maju sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3.(F) Tahap penambahan BPDE-DNA dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai penentuan tiga kali ganda.*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
Ekspresi enzim GST dikesan selepas rawatan bersama dengan 10 μM B (a) P dan 10 μM G-Rg3r atau G-Rg3s.Keputusan kami menunjukkan bahawa B (a) P menindas ekspresi GST (59.7 ± 8.2% dalam kumpulan G-Rg3r dan 39 ± 4.5% dalam kumpulan G-Rg3s), dan B (a) P dikaitkan dengan sama ada dengan G-Rg3r , atau dengan G-Rg3r, atau dengan G-Rg3r.Rawatan bersama dengan G-Rg3s memulihkan ekspresi GST.Ungkapan GST (103.7 ± 15.5% dalam kumpulan G-Rg3r dan 110 ± 11.1% dalam kumpulan G-Rg3s, p <0.05 dan p <0.001, masing-masing, Rajah 6A, B, dan C).Aktiviti GST dinilai menggunakan kit ujian aktiviti.Keputusan kami menunjukkan bahawa kumpulan rawatan gabungan mempunyai aktiviti GST yang lebih tinggi berbanding kumpulan B(a)P sahaja (96.3 ± 6.6% vs. 35.7 ± 7.8% dalam kumpulan G-Rg3r vs. 92.3 ± 6.5 dalam kumpulan G-Rg3r ).% vs 35.7 ± 7.8% dalam kumpulan G-Rg3s, p <0.001, Rajah 6D).
Ungkapan GST dan Nrf2 dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3.(A) Pengesanan ungkapan GST dengan penghapusan Barat.(B) Ekspresi kuantitatif GST dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3r.(C) Ekspresi kuantitatif GST dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3s.(D) Aktiviti GST dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3.(E) Pengesanan ungkapan Nrf2 oleh Western blotting.(F) Ekspresi kuantitatif Nrf2 dalam sel hEL yang dirawat dengan B (a) P dan G-Rg3r.(G) Ekspresi kuantitatif Nrf2 dalam sel hEL yang dirawat dengan B (a) P dan G-Rg3s.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai penentuan tiga kali ganda.*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
Untuk menjelaskan laluan yang terlibat dalam penindasan G-Rg3-pengantara tumorigenesis yang disebabkan oleh B (a) P, ekspresi Nrf2 dinilai oleh penghapusan Barat.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6E, F, G, berbanding dengan kumpulan kawalan, hanya tahap Nrf2 dalam kumpulan rawatan B (a) P telah menurun;bagaimanapun, berbanding dengan kumpulan rawatan B(a)P, tahap B(a) Nrf2 dalam kumpulan PG-Rg3 telah meningkat (106 ± 9.5% untuk G-Rg3r berbanding 51.3 ± 6.8%, 117 ± 6. 2% untuk G-Rg3r lwn. 41 ± 9.8% untuk G-Rg3s, p < 0.01).
Kami mengesahkan peranan pencegahan Nrf2 dengan menekan ekspresi Nrf2 menggunakan RNA gangguan kecil tertentu (siRNA).Nrf2 knockdown telah disahkan oleh Western blotting (Rajah 7A, B).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7C, D, rawatan bersama sel hEL dengan B(a)P dan G-Rg3 mengakibatkan pengurangan bilangan penambahan BPDE-DNA (1.47 ± 0.21) berbanding rawatan dengan B(a)P sahaja dalam kumpulan siRNA kawalan.) G-Rg3r ialah 4.13 ± 0.49, G-Rg3s ialah 1.8 ± 0.32 dan 4.1 ± 0.57, p <0.01).Walau bagaimanapun, kesan perencatan G-Rg3 pada pembentukan BPDE-DNA telah dimansuhkan oleh Nrf2 knockdown.Dalam kumpulan siNrf2, tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam pembentukan tambahan BPDE-DNA antara rawatan bersama B(a)P dan G-Rg3 dan rawatan B(a)P sahaja (3.0 ± 0.21 untuk G-Rg3r vs. 3.56 ± 0.32 ).untuk G-Rg3r berbanding 3.6 untuk G-Rg3s berbanding ±0.45 berbanding 4.0±0.37, p > 0.05).
Kesan ketukan Nrf2 pada pembentukan tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL.(A) Ketukan Nrf2 telah disahkan oleh penghapusan Barat.(B) Kuantifikasi keamatan jalur Nrf2.(C) Kesan ketukan Nrf2 pada tahap tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3r.(D) Kesan ketukan Nrf2 pada tahap tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL yang dirawat dengan B(a)P dan G-Rg3.Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai penentuan tiga kali ganda.*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001.
Kajian ini menilai kesan pencegahan pelbagai ekstrak ginseng merah pada model tetikus kanser paru-paru yang disebabkan oleh B (a) P, dan rawatan KRGB mengurangkan beban tumor dengan ketara.Memandangkan G-Rg3 mempunyai kandungan tertinggi dalam ekstrak ginseng ini, peranan penting ginsenoside ini dalam menghalang tumorigenesis telah dikaji.Kedua-dua G-Rg3r dan G-Rg3 (dua epimer G-Rg3) mengurangkan beban tumor dengan ketara dalam model tetikus kanser yang disebabkan oleh B (a) P.G-Rg3r dan G-Rg3 memberikan kesan antikanser dengan mendorong apoptosis sel tumor21, menghalang pertumbuhan tumor22, menangkap kitaran sel23 dan menjejaskan angiogenesis24.G-Rg3 juga telah ditunjukkan untuk menghalang metastasis selular25, dan keupayaan G-Rg3 untuk meningkatkan kesan kemoterapi dan radioterapi telah didokumenkan26,27.Poon et al menunjukkan bahawa rawatan G-Rg3 boleh mengurangkan kesan genotoksik B(a)P28.Kajian ini menunjukkan potensi terapeutik G-Rg3 dalam menyasarkan molekul karsinogenik persekitaran dan mencegah kanser.
Walaupun potensi profilaksisnya yang baik, bioavailabiliti oral yang lemah ginsenosides menimbulkan cabaran untuk penggunaan klinikal molekul ini.Analisis farmakokinetik pemberian oral ginsenosides pada tikus menunjukkan bahawa bioavailabilitinya masih kurang daripada 5%29.Ujian ini menunjukkan bahawa selepas tempoh rawatan 20 minggu, hanya paras darah Rg5 menurun.Walaupun mekanisme asas bioavailabiliti yang lemah masih perlu dijelaskan, P-gp dianggap terlibat dalam efluks ginsenosides.Kerja ini menunjukkan buat kali pertama bahawa pentadbiran verapamil, penyekat P-gp, meningkatkan bioavailabiliti oral G-Rg3r dan G-Rg3s.Oleh itu, penemuan ini menunjukkan bahawa G-Rg3r dan G-Rg3s bertindak sebagai substrat P-gp untuk mengawal efluksnya.
Kerja ini menunjukkan bahawa rawatan gabungan dengan verapamil meningkatkan bioavailabiliti oral G-Rg3 dalam model tetikus kanser paru-paru.Penemuan ini disokong oleh peningkatan pengangkutan transselular usus G-Rg3 apabila sekatan P-gp, dengan itu meningkatkan penyerapannya.Ujian dalam sel Caco2 menunjukkan bahawa rawatan verapamil mengurangkan efluks G-Rg3r dan G-Rg3s sambil meningkatkan kebolehtelapan membran.Kajian oleh Yang et al.Kajian telah menunjukkan bahawa rawatan dengan siklosporin A (penghalang P-gp lain) meningkatkan bioavailabiliti ginsenoside Rh2 daripada nilai asas 1%20 kepada lebih daripada 30%.Sebatian Ginsenosides K dan Rg1 juga menunjukkan keputusan yang sama30,31.Apabila verapamil dan cyclosporin A ditadbir bersama, efluks sebatian K dalam sel Caco-2 berkurangan dengan ketara daripada 26.6 kepada kurang daripada 3, manakala paras intraselularnya meningkat 40 kali ganda30.Dengan kehadiran verapamil, paras Rg1 meningkat dalam sel epitelium paru-paru tikus, mencadangkan peranan untuk P-gp dalam efluks ginsenoside, seperti yang ditunjukkan oleh Meng et al.31.Walau bagaimanapun, verapamil tidak mempunyai kesan yang sama pada pengeluaran beberapa ginsenosides (seperti Rg1, F1, Rh1 dan Re), menunjukkan bahawa mereka tidak terjejas oleh substrat P-gp, seperti yang ditunjukkan oleh Liang et al.32 .Pemerhatian ini mungkin berkaitan dengan penglibatan pengangkut lain dan struktur ginsenoside alternatif.
Mekanisme kesan pencegahan G-Rg3 terhadap kanser tidak jelas.Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa G-Rg3 menghalang kerosakan DNA dan apoptosis dengan mengurangkan tekanan oksidatif dan keradangan16, 33, yang mungkin menjadi mekanisme asas untuk mencegah tumorigenesis yang disebabkan oleh B (a) P.Beberapa laporan menunjukkan bahawa genotoksisiti yang disebabkan oleh B(a)P boleh dikurangkan dengan memodulasi enzim fasa II untuk membentuk BPDE-DNA34.GST ialah enzim fasa II tipikal yang menghalang pembentukan tambahan BPDE-DNA dengan menggalakkan pengikatan GSH kepada BPDE, dengan itu mengurangkan kerosakan DNA yang disebabkan oleh B(a)P35.Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan G-Rg3 mengurangkan sitotoksisiti yang disebabkan oleh B(a)P dan pembentukan tambahan BPDE-DNA dalam sel hEL dan memulihkan ekspresi dan aktiviti GST secara in vitro.Walau bagaimanapun, kesan ini tidak hadir jika tiada Nrf2, menunjukkan bahawa G-Rg3 mendorong kesan sitoprotektif melalui laluan Nrf2.Nrf2 ialah faktor transkripsi utama untuk enzim detoksifikasi fasa II yang menggalakkan pembersihan xenobiotik36.Pengaktifan laluan Nrf2 mendorong cytoprotection dan mengurangkan kerosakan tisu37.Selain itu, beberapa laporan telah menyokong peranan Nrf2 sebagai penindas tumor dalam karsinogenesis38.Kajian kami menunjukkan bahawa induksi laluan Nrf2 oleh G-Rg3 memainkan peranan pengawalseliaan penting dalam genotoksisiti yang disebabkan oleh B (a) P dengan menyebabkan detoksifikasi B (a) P dengan mengaktifkan enzim fasa II, dengan itu menghalang proses tumorigenesis.
Kerja kami mendedahkan potensi ginseng merah dalam mencegah kanser paru-paru yang disebabkan oleh B(a)P pada tikus melalui penglibatan penting ginsenoside G-Rg3.Bioavailabiliti oral yang lemah bagi molekul ini menghalang aplikasi klinikalnya.Walau bagaimanapun, kajian ini menunjukkan buat kali pertama bahawa G-Rg3 adalah substrat P-gp, dan pentadbiran perencat P-gp meningkatkan bioavailabiliti G-Rg3 in vitro dan in vivo.G-Rg3 mengurangkan sitotoksisiti yang disebabkan oleh B(a)P dengan mengawal selia laluan Nrf2, yang mungkin merupakan mekanisme yang berpotensi untuk fungsi pencegahannya.Kajian kami mengesahkan potensi ginsenoside G-Rg3 untuk pencegahan dan rawatan kanser paru-paru.
Tikus A/J betina berusia enam minggu (20 ± 1 g) dan tikus Wistar jantan berusia 7 minggu (250 ± 20 g) diperoleh daripada Makmal Jackson (Bar Harbor, Amerika Syarikat) dan Institut Zoologi Wuhan.Universiti (Wuhan, China).Pusat Pengumpulan Budaya Jenis Cina (Wuhan, China) membekalkan kami dengan sel Caco-2 dan hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika Syarikat) ialah sumber B(a)P dan tricaprine.Ginsenosides G-Rg3r dan G-Rg3s yang telah disucikan, dimetil sulfoksida (DMSO), kit ujian proliferasi CellTiter-96 (MTS), verapamil, medium penting minimum (MEM), dan serum lembu janin (FBS) telah dibeli daripada Chengdu Must Bio-Technology. .Co.,Ltd.(Chengdu, China).Kit mini DNA QIAamp dan kit ELISA tambahan BPDE-DNA telah dibeli dari Qiagen (Stanford, CA, Amerika Syarikat) dan Cell Biolabs (San Diego, CA, Amerika Syarikat).Kit ujian aktiviti GST dan kit ujian jumlah protein (kaedah BCA standard) telah dibeli dari Solarbio (Beijing, China).Semua ekstrak ginseng merah disimpan di Makmal Mingyu 7. Universiti Baptist Hong Kong (Hong Kong, China) dan Pusat Kanser Korea (Seoul, Korea) adalah sumber komersial ekstrak CRG dan pelbagai ekstrak ginseng merah pelbagai asal Korea (termasuk KRGA, KRGB dan KRGC).Ginseng merah diperbuat daripada akar ginseng segar berusia 6 tahun.Ekstrak ginseng merah diperoleh dengan mencuci ginseng dengan air tiga kali, kemudian menumpukan ekstrak berair, dan akhirnya pengeringan pada suhu rendah untuk mendapatkan serbuk ekstrak ginseng.Antibodi (anti-Nrf2, anti-GST, dan β-actin), lobak pedas peroksidase-conjugated anti-arnab immunoglobulin G (IgG), reagen transfeksi, kawalan siRNA, dan Nrf2 siRNA telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Sel Caco2 dan hEL telah dibiakkan dalam hidangan kultur sel 100 mm2 dengan MEM yang mengandungi 10% FBS pada 37 ° C dalam suasana lembap sebanyak 5% CO2.Untuk menentukan kesan keadaan rawatan, sel hEL diinkubasi dengan kepekatan B (a) P dan G-Rg3 yang berbeza dalam MEM selama 48 jam.Sel boleh dianalisis atau dikumpul selanjutnya untuk menyediakan ekstrak bebas sel.
Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Eksperimen Kolej Perubatan Tongji, Universiti Sains dan Teknologi Huazhong (No. Kelulusan 2019; No. Pendaftaran 4587TH).Semua eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan dan peraturan yang berkaitan, dan kajian telah dijalankan mengikut garis panduan Penyelidikan Haiwan: Pelaporan Eksperimen In Vivo (TIBA).Tikus A/J berumur lapan minggu pertama kali disuntik secara intraperitoneal dengan B(a)P dalam larutan tricaprine (100 mg/kg, 0.2 ml).Selepas seminggu, tikus dibahagikan secara rawak kepada kumpulan kawalan dan kumpulan rawatan yang berbeza, 15 tikus dalam setiap kumpulan, dan digavage sekali sehari.Selepas 20 minggu rawatan, haiwan dikorbankan oleh asfiksia CO2.Paru-paru dikumpulkan dan diperbaiki selama 24 jam.Bilangan tumor cetek dan saiz tumor individu dikira untuk setiap paru-paru di bawah mikroskop membedah.Anggaran isipadu tumor (V) dikira menggunakan ungkapan berikut: V (mm3) = 4/3πr3, dengan r ialah diameter tumor.Jumlah bersih semua volum tumor dalam paru-paru tikus mewakili jumlah volum tumor, dan purata jumlah volum tumor dalam setiap kumpulan mewakili beban tumor.Sampel darah dan usus keseluruhan telah dikumpulkan dan disimpan pada suhu -80°C untuk penentuan UPLC-MS/MS.Serum dikumpulkan dan penganalisis kimia automatik digunakan untuk menganalisis tahap alanine aminotransferase (ALT) dan kreatinin serum (Cr) untuk menilai fungsi hati dan buah pinggang.
Sampel yang dikumpul dikeluarkan dari simpanan sejuk, dicairkan, ditimbang, dan dimasukkan ke dalam tiub seperti yang diterangkan di atas.Untuk ini ditambah 0.5 μM phlorizin (standard dalaman) dalam 0.8 ml larutan metanol.Tisu kemudian dihomogenkan menggunakan Tissue-Tearor dan homogenat kemudiannya dipindahkan ke tiub mikrosentrifuge 1.5 ml.Campuran diempar pada 15500 rpm selama 15 minit.Selepas mengeluarkan 1.0 ml supernatan, keringkan dengan nitrogen.Dua ratus mikroliter metanol digunakan untuk pemulihan.Darah dikumpul dan diproses pada satu baris dan digunakan sebagai rujukan untuk semua ukuran.
Plat Transwell 24-telaga telah disemai dengan 1.0 × 105 sel Caco-2 setiap telaga untuk menilai potensi peningkatan pengangkutan G-Rg3 dengan penambahan verapamil.Selepas 3 minggu kultur, sel telah dibasuh dengan HBSS dan prainkubasi pada suhu 37°C.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, atau campuran dengan 50 atau 100 μM verapamil) telah disuntik ke bahagian basolateral atau apikal monolayer, dan 600 μL larutan HBSS telah ditambah kepada yang lain. sebelah.Kumpulkan 100 µl medium kultur pada masa yang ditetapkan (0, 15, 30, 45, 60, 90 dan 120 minit) dan tambah 100 µl HBSS untuk membentuk isipadu ini.Sampel disimpan pada -4 ° C sehingga pengesanan oleh UPLC-MS / MS.Ungkapan Papp = dQ/(dT × A × C0) digunakan untuk mengukur kebolehtelapan apikal dan basolateral satu arah yang jelas dan sebaliknya (Pa-b dan Pb-a, masing-masing);dQ/dT ialah perubahan kepekatan, A (0.6 cm2) ialah luas permukaan lapisan tunggal, dan C0 ialah kepekatan penderma awal.Nisbah efluks dikira sebagai Pb-a/Pa-b, yang mewakili kadar efluks ubat kajian.
Tikus Wistar jantan dipuasakan selama 24 jam, hanya minum air, dan dibius dengan suntikan intravena 3.5% larutan pentobarbital.Tiub silikon diintubasi mempunyai hujung duodenum sebagai pintu masuk dan hujung ileum sebagai pintu keluar.Gunakan pam peristaltik untuk mengepam salur masuk dengan 10 µM G-Rg3r atau G-Rg3s dalam HBSS isotonik pada kadar aliran 0.1 ml/min.Kesan verapamil dinilai dengan menambahkan 50 μM atau 100 μM kompaun kepada 10 μM G-Rg3r atau G-Rg3s.UPLC-MS/MS dilakukan pada ekstrak perfusi yang dikumpul pada titik masa 60, 90, 120, dan 150 minit selepas permulaan perfusi.Peratusan penyerapan dikira dengan formula % penyerapan = (1 – Cout/Cin) × 100%;kepekatan G-Rg3 pada alur keluar dan masuk dinyatakan oleh Cout dan Cin, masing-masing.
Sel hEL telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan 1 × 104 sel setiap telaga dan dirawat dengan B (a) P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) atau G-Rg3 yang dibubarkan dalam DMSO .Ubat-ubatan tersebut kemudiannya dicairkan dengan medium kultur kepada pelbagai kepekatan (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) selama 48 jam.Menggunakan kit ujian MTS yang tersedia secara komersil, sel telah tertakluk kepada protokol standard dan kemudian diukur menggunakan pembaca plat mikro pada 490 nm.Tahap daya maju sel kumpulan yang dirawat bersama dengan B (a) P (10 μM) dan G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) dinilai mengikut kaedah di atas dan dibandingkan dengan kumpulan yang tidak dirawat.
Sel-sel hEL telah disemai dalam plat 6-telaga pada ketumpatan 1 × 105 sel/telaga dan dirawat dengan 10 μMB(a)P dengan kehadiran atau ketiadaan 10 μM G-Rg3.Selepas 48 jam rawatan, DNA telah diekstrak daripada sel hEL menggunakan Kit Mini DNA QIAamp mengikut protokol pengeluar.Pembentukan tambahan BPDE-DNA dikesan menggunakan kit ELISA tambahan BPDE-DNA.Tahap relatif tambahan BPDE-DNA diukur menggunakan pembaca plat mikro dengan mengukur penyerapan pada 450 nm.
Sel-sel hEL telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan 1 × 104 sel setiap telaga dan dirawat dengan 10 μMB (a) P dalam ketiadaan atau kehadiran 10 μM G-Rg3 selama 48 jam.Aktiviti GST diukur menggunakan kit ujian aktiviti GST komersial mengikut protokol pengilang.Pengaktifan GST relatif diukur dengan penyerapan pada 450 nm menggunakan pembaca plat mikro.
Sel hEL telah dibasuh dengan PBS sejuk ais dan kemudian dilisiskan menggunakan penimbal ujian radioimunopresipitasi yang mengandungi perencat protease dan perencat fosfatase.Selepas kuantifikasi protein menggunakan kit ujian protein jumlah, 30 μg protein dalam setiap sampel dipisahkan oleh 12% SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF oleh elektroforesis.Membran disekat dengan susu skim 5% dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4°C.Selepas pengeraman dengan antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak, reagen chemiluminescence yang dipertingkatkan telah ditambah untuk menggambarkan isyarat pengikat.Keamatan setiap jalur protein dikira menggunakan perisian ImageJ.
Perisian GraphPad Prism 7.0 digunakan untuk menganalisis semua data, dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai.Variasi antara kumpulan rawatan dinilai menggunakan ujian t Pelajar atau analisis varians sehala, dengan nilai P <0.05 menunjukkan kepentingan statistik.
Semua data yang diperoleh atau dianalisis semasa kajian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan fail maklumat tambahan.
Torre, LA, Siegel, RL dan Jemal, A. Statistik kanser paru-paru.adverba.Tamat tempoh.ubat.biologi.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Karsinogen tembakau, penanda bio mereka dan kanser yang disebabkan oleh tembakau.Nat.Pendeta kanser.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH dan Venitt, S. DNA dan penambahan protein dalam tisu manusia akibat daripada pendedahan kepada asap tembakau.antarabangsa.J. Kanser.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA dan Yu M. Kesan Houttuynia cordata dan silibinin pada tumorigenesis paru-paru yang disebabkan oleh benzo(a)pirena dalam tikus A/J.Kanser 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Produk semulajadi antikanser yang diasingkan daripada bahan perubatan Cina.Rahang.ubat.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Keberkesanan polifenon E, ginseng merah, dan rapamycin pada tumorigenesis paru-paru yang disebabkan oleh benzo(a)pirena dalam tikus A/J.Kanser 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS dan Yuan, KS Red, penglibatan dalam terapi kanser.Rahang.J. Nutt.ubat.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS dan Gao, L. Ginsenosides dalam akar dan daun ginseng Amerika.J. Agric.Kimia makanan.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA dan Yuan KS Farmakologi ginseng: banyak komponen dan banyak kesan.biokimia.farmakologi.58, 1685–1693 (1999).
Masa siaran: Sep-17-2023