Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt, heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste resultaten raden wij u aan een nieuwere versie van uw browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, geven we de site in de tussentijd weer zonder stijl of JavaScript.
Rode ginseng wordt al honderden jaren in de traditionele Aziatische geneeskunde gebruikt.In deze studie evalueerden we het vermogen van vier soorten rode ginseng (Chinese rode ginseng, Koreaanse rode ginseng A, Koreaanse rode ginseng B en Koreaanse rode ginseng C), gekweekt in verschillende regio’s, om de vorming en groei van door kankerverwekkende stoffen geïnduceerde longkanker te remmen. tumoren.Er werd een benzo(a)pyreen (B(a)P)-test uitgevoerd op A/J-muizen, en Koreaanse rode ginseng B bleek het meest effectief te zijn in het verminderen van de tumorlast onder de vier rode ginseng-variëteiten.Daarnaast analyseerden we de inhoud van verschillende ginsenosiden (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 en Rg5) in vier rode ginseng-extracten en ontdekten dat Koreaanse rode ginseng B de hoogste niveaus van ginsenoside Rg3 (G-Rg3), wat erop wijst dat G-Rg3 een belangrijke rol kan spelen in de therapeutische werkzaamheid ervan.Dit werk laat zien dat G-Rg3 een relatief lage biologische beschikbaarheid heeft.Wanneer G-Rg3 echter gelijktijdig werd toegediend met de P-gp-remmer verapamil, nam de efflux van G-Rg3 naar Caco-2-cellen af, nam de snelheid van intestinale absorptie van G-Rg3 toe in een rattenmodel en nam G-Rg3 toe. was toegenomen.In Caco-2-cellen neemt de uitstroom van Rg3 af en neemt het niveau van de Rg3-concentratie af.G-Rg3 is verhoogd in de darmen en het plasma, en het vermogen ervan om tumoren te voorkomen wordt ook versterkt in een rattenmodel van door B(a)P geïnduceerde tumorigenese.We ontdekten ook dat G-Rg3 de door B(a)P geïnduceerde cytotoxiciteit en de vorming van DNA-adducten in menselijke longcellen verminderde, en de expressie en activiteit van fase II-enzymen herstelde via de Nrf2-route, wat mogelijk verband houdt met het potentiële werkingsmechanisme. van G-remming -Rg3..Over het voorkomen van longtumoren.Onze studie toont een potentieel belangrijke rol aan voor G-Rg3 bij het richten op longtumoren in muismodellen.De orale biologische beschikbaarheid van deze ginsenoside wordt verbeterd door zich te richten op P-glycoproteïne, waardoor het molecuul kankerbestrijdende effecten kan uitoefenen.
Het meest voorkomende type longkanker is niet-kleincellige longkanker (NSCLC), een van de belangrijkste oorzaken van sterfgevallen door kanker in China en Noord-Amerika1,2.De belangrijkste factor die het risico op het ontwikkelen van niet-kleincellige longkanker verhoogt, is roken.Sigarettenrook bevat meer dan 60 kankerverwekkende stoffen, waaronder benzo(a)pyreen (B(a)P), nitrosaminen en radioactieve isotopen afkomstig van het verval van radon.3 Polycyclische aromatische koolwaterstoffen B(a)P zijn de belangrijkste oorzaak van toxiciteit in sigaretten. rook.Bij blootstelling aan B(a)P zet cytochroom P450 het om in B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE), dat reageert met DNA om BPDE-DNA-adduct 4 te vormen. adducten induceren longtumorigenese bij muizen met een tumorstadium en histopathologie vergelijkbaar met menselijke longtumoren5.Deze eigenschap maakt het door B(a)P geïnduceerde longkankermodel een geschikt systeem voor het evalueren van verbindingen met mogelijke kankerbestrijdende eigenschappen.
Eén mogelijke strategie om de ontwikkeling van longkanker bij risicogroepen, vooral rokers, te voorkomen, is het gebruik van chemopreventieve middelen om de ontwikkeling van intra-epitheliale neoplastische laesies te onderdrukken en daardoor de daaropvolgende progressie naar maligniteit te voorkomen.Uit dierstudies blijkt dat verschillende chemopreventieve middelen effectief zijn6.Ons vorige rapport7 benadrukte de goede preventieve effecten van rode ginseng op longkanker.Dit kruid wordt al eeuwenlang in de traditionele Aziatische geneeskunde gebruikt om het leven en de gezondheid te verlengen, en er is gedocumenteerd dat het antitumorale effecten heeft8.
De actieve factor van ginseng is ginsenoside, dat wordt gebruikt als een samengestelde marker om de kwaliteit van ginseng-extracten te evalueren.Kwantitatieve analyse van ruwe ginseng-extracten omvat doorgaans het gebruik van verschillende ginsenosiden, waaronder RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 en Rc9,10.Ginsenosides hebben weinig klinisch nut vanwege hun zeer slechte orale biologische beschikbaarheid11.Hoewel het mechanisme voor deze slechte biologische beschikbaarheid niet duidelijk is, kan de uitstroom van ginsenosiden veroorzaakt door P-glycoproteïne (P-gp)12 de oorzaak zijn.P-gp is een van de belangrijkste effluxtransporters in de superfamilie van ATP-bindende cassettetransporters, die de energie van ATP-hydrolyse gebruikt om intracellulaire stoffen vrij te geven in de externe omgeving.P-gp-transporters zijn doorgaans wijdverspreid in de darm-, nier-, lever- en bloed-hersenbarrière13.P-gp speelt een cruciale rol bij de absorptie in de darmen, en remming van P-gp verhoogt de orale absorptie en beschikbaarheid van sommige geneesmiddelen tegen kanker12,14.Voorbeelden van eerder in de literatuur gebruikte remmers zijn verapamil en cyclosporine A15.Dit werk omvat het opzetten van een muissysteem voor het bestuderen van door B(a)P geïnduceerde longkanker om het vermogen van verschillende rode ginseng-extracten uit China en Korea om maligniteiten te beïnvloeden te evalueren.De extracten werden individueel geanalyseerd om specifieke ginsenosiden te identificeren die de carcinogenese kunnen beïnvloeden.Verapamil werd vervolgens gebruikt om P-gp te targeten en de orale biologische beschikbaarheid en therapeutische werkzaamheid van op kanker gerichte ginsenosiden te verbeteren.
Het mechanisme waarmee ginseng-saponinen therapeutische effecten uitoefenen op carcinogenese blijft onduidelijk.Onderzoek heeft aangetoond dat verschillende ginsenosiden DNA-schade veroorzaakt door kankerverwekkende stoffen kunnen verminderen door oxidatieve stress te verminderen en fase II-ontgiftingsenzymen te activeren, waardoor celbeschadiging wordt voorkomen.Glutathion S-transferase (GST) is een typisch fase II-enzym dat nodig is om DNA-schade veroorzaakt door kankerverwekkende stoffen te verminderen17.Nucleaire erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) is een belangrijke transcriptiefactor die de redox-homeostase reguleert en de expressie van fase II-enzymen en cytoprotectieve antioxidantreacties activeert.Onze studie onderzocht ook de effecten van geïdentificeerde ginsenosiden op het verminderen van door B(a)P geïnduceerde cytotoxiciteit en de vorming van BPDE-DNA-adducten, evenals het induceren van fase II-enzymen door de Nrf2-route in normale longcellen te moduleren.
Het opzetten van een muismodel van door B(a)P geïnduceerde kanker komt overeen met eerder werk5.Figuur 1A toont het experimentele ontwerp van een 20 weken durende behandeling van een muizenkankermodel geïnduceerd door B(a)P, water (controle), Chinese rode ginseng-extract (CRG), Koreaanse rode ginseng-extract A (KRGA) en Koreaanse rode ginseng. ginseng.Extract B (KRGB) en Koreaanse rode ginseng-extract C (KRGC).Na 20 weken behandeling met rode ginseng werden de muizen opgeofferd door verstikking met CO2.Figuur 1B toont macroscopische longtumoren bij dieren die zijn behandeld met verschillende soorten rode ginseng, en Figuur 1C toont een representatieve lichtmicrofoto van een tumormonster.De tumorlast van met KRGB behandelde dieren (1,5 ± 0,35) was lager dan die van controledieren (0,82 ± 0,2, P <0,05), zoals weergegeven in Figuur 1D.De gemiddelde mate van remming van de tumorbelasting was 45%.Andere geteste extracten van rode ginseng vertoonden niet zulke significante veranderingen in de tumorlast (P > 0,05).Er werden geen duidelijke bijwerkingen waargenomen in het muismodel gedurende 20 weken behandeling met rode ginseng, waaronder geen verandering in lichaamsgewicht (gegevens niet getoond) en geen lever- of niertoxiciteit (Figuur 1E,F).
Rode ginseng-extract behandelt de ontwikkeling van longtumoren bij A/J-muizen.(A) Experimenteel ontwerp.(B) Grote longtumoren in een muismodel.Tumoren worden aangegeven met pijlen.a: Chinese rode ginsenggroep.b: groep A van Koreaanse rode ginseng.c: Koreaanse rode ginsenggroep B. d: Koreaanse rode ginsenggroep C. d: Controlegroep.(C) Lichtmicrofoto van een longtumor.Vergroting: 100. b: 400. (D) Tumorbelasting in de rode ginseng-extractgroep.(E) Plasmaspiegels van het leverenzym ALT.(F) Plasmaspiegels van het nierenzym Cr.Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking.*P <0,05.
De in dit onderzoek geïdentificeerde rode ginseng-extracten werden geanalyseerd met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (UPLC-MS/MS) om de volgende ginsenosiden te kwantificeren: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 en Rg5.De UPLC- en MS-omstandigheden die werden gebruikt om de analyten te meten, werden beschreven in een eerder rapport .UPLC-MS/MS-chromatogrammen van vier rode ginseng-extracten worden getoond in Figuur 2A.Er waren significante verschillen in het totale ginsenosidegehalte, met het hoogste totale ginsenosidegehalte in CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figuur 2B).Bij het evalueren van individuele ginsenosiden (Figuur 2C) vertoonde KRGB het hoogste niveau van G-Rg3 vergeleken met andere ginsenosiden (58,33 ± 3,81 μmol/L voor G-Rg3s en 41,56 ± 2,88 μmol/L voor G-Rg3r).L).rode ginseng-type (P <0,001).G-Rg3 komt voor als een paar stereo-isomeren G-Rg3r en G-Rg3s, die verschillen in de positie van de hydroxylgroep op koolstof 20 (figuur 2D).De resultaten geven aan dat G-Rg3r of G-Rg3 een belangrijk antikankerpotentieel kunnen hebben in een B(a)P-geïnduceerd kankermuismodel.
Gehalte aan ginsenosiden in verschillende extracten van rode ginseng.(A) UPLC-MS/MS-chromatogrammen van vier rode ginseng-extracten.(B) Schatting van het totale ginsenosidegehalte in de aangegeven extracten.(C) Detectie van individuele ginsenosiden in gelabelde extracten.(D) Structuren van ginsenoside-stereo-isomeren G-Rg3r en G-Rg3s.Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van bepalingen in drievoud.***P <0,001.
Het UPLC-MS/MS-onderzoek vereiste de kwantificering van ginsenosides in darm- en bloedmonsters na twintig weken behandeling.Behandeling met KRGB toonde de aanwezigheid van slechts 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 in het bloed aan.Er werden geen resterende ginsenosiden gedetecteerd, wat wijst op een slechte orale biologische beschikbaarheid en daarom een verminderde blootstelling aan deze ginsenosiden.
De colonadenocarcinoomcellijn Caco-2 is morfologisch en biochemisch vergelijkbaar met menselijke darmepitheelcellen, wat het nut ervan aantoont bij het beoordelen van enterocytentransport door de darmepitheelbarrière.Deze analyse was gebaseerd op een eerder onderzoek 20 .Figuren 3A, B, C, D, E, F tonen representatieve beelden van transcellulair transport van G-Rg3r en G-Rg3 met behulp van een Caco-2 monolaagmodel.Transcellulair transport van G-Rg3r of G-Rg3 door Caco-2 monolagen van de basolaterale naar apicale zijde (Pb-a) was significant hoger dan van de apicale naar basolaterale zijde (Pa-b).Voor G-Rg3r was de gemiddelde Pa-b-waarde 0,38 ± 0,06, die toenam tot 0,73 ± 0,06 na behandeling met 50 μmol/l verapamil en tot 1,14 ± 0,09 na behandeling met 100 μmol/l verapamil (p < 0,01 en 0,001, respectievelijk; Figuur 2).3A).Waarnemingen voor G-Rg3 volgden een soortgelijk patroon (Fig. 3B) en de resultaten toonden aan dat behandeling met verapamil het transport van G-Rg3r en G-Rg3 verbeterde.Behandeling met verapamil resulteerde ook in een significante afname van de gemiddelde Pb-a- en G-Rg3r- en G-Rg3s-effluxverhoudingen (Figuur 3C, D, E, F), wat aangeeft dat behandeling met verapamil het ginsenosidegehalte in Caco-2-effluxcellen vermindert..
Transcellulair transport van G-Rg3 in Caco-2-monolagen en intestinale absorptie in een perfusietest bij ratten.(A) Pa-b-waarde van de G-Rg3r-groep in Caco-2-monolaag.(B) Pa-b-waarde van G-Rg3s-groepen in Caco-2-monolaag.(C) Pb-waarde van de G-Rg3r-groep in Caco-2-monolaag.(D) Pb-waarde van G-Rg3s-groepen in Caco-2-monolaag.(E) Opbrengstverhouding van G-Rg3r-groepen in een Caco-2-monolaag.(F) Opbrengstverhouding van G-Rg3-groepen in een Caco-2-monolaag.(G) Percentage darmabsorptie van G-Rg3r in een perfusietest bij ratten.(H) Percentage darmabsorptie van G-Rg3 in een perfusietest bij ratten.De permeabiliteit en absorptie werden vergeleken zonder toevoeging van verapamil.Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie van vijf onafhankelijke experimenten.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
In overeenstemming met eerder werk 20 werd orthotope darmperfusie van ratten uitgevoerd om te bepalen of de absorptie van G-Rg3 in de darm toeneemt na behandeling met verapamil.Figuren 3G,H tonen representatieve perfusietesten om het percentage darmabsorptie van G-Rg3r en G-Rg3 bij kankermodelratten gedurende de bovengenoemde tijdsperioden te evalueren.Het aanvankelijke percentage zwakke G-Rg3r-opname van ongeveer 10% nam toe tot meer dan 20% na behandeling met 50 μM verapamil en tot meer dan 25% na behandeling met 100 μM verapamil.Op dezelfde manier vertoonde G-Rg3, dat een initiële opname van 10% had, ook een piek van meer dan 20% na behandeling met 50 μM verapamil en bijna 30% na behandeling met 100 μM verapamil, wat suggereert dat remming van P-gp door verapamil de intestinale G-absorptie Rg3 in een muismodel van longkanker.
Volgens de bovenstaande methode werden door B(a)P geïnduceerde kankermodelmuizen willekeurig verdeeld in zes groepen, zoals weergegeven in Figuur 4A.Er werden geen significant gewichtsverlies of klinische tekenen van toxiciteit waargenomen in de G-Rg3-behandelingsgroep vergeleken met de controlegroep (gegevens niet getoond).Na 20 weken behandeling werden de longen van elke muis verzameld.Figuur 4B toont macroscopische longtumoren bij muizen in de bovengenoemde behandelingsgroepen, en Figuur 4C toont een representatieve lichtmicrofoto van een representatieve tumor.Wat betreft de tumorlast in elke groep (Fig. 4D), waren de waarden voor muizen behandeld met G-Rg3r en G-Rg3s respectievelijk 0,75 ± 0,29 mm3 en 0,81 ± 0,30 mm3, terwijl de waarden voor behandelde G-muizen met -Rg3s waren respectievelijk 1,63 ±0,40 mm3.controlemuizen (p <0,001), wat aangeeft dat behandeling met G-Rg3 de tumorlast bij muizen verminderde.Toediening van verapamil versterkte deze reductie nog verder: waarden bij verapamil+ G-Rg3r muizen daalden van 0,75 ± 0,29 mm3 naar 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), en waarden voor verapamil+ van 0,81 ± 0,30 mm3 daalden naar 0,29 ± 0,21 mm3 in met G.-Rg3s behandelde muizen (p <0,05), wat aangeeft dat verapamil het remmende effect van G-Rg3 op tumorigenese kan versterken.De tumorlast vertoonde geen significante verschillen tussen de controlegroep en de verapamilgroep, de G-Rg3r-groep en de G-Rg3s-groep, en de verapamil+G-Rg3r-groep en de verapamil+G-Rg3s-groep.Bovendien waren er geen significante lever- of niertoxiciteiten geassocieerd met de geëvalueerde behandelingen (Figuur 4E,F).
Tumorbelasting na behandeling met G-Rg3 en G-Rg3r- en G-Rg3-waarden in plasma of darmen in de aangegeven groepen.(A) Experimenteel ontwerp.(B) Macroscopische tumoren in een muismodel.Tumoren worden aangegeven met pijlen.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r in combinatie met verapamil.d: G-Rg3 in combinatie met verapamil.d: Verapamil.e: controle.(C) Optische microfoto van de tumor bij vergroting.Antwoord: 100x.b: 400X.(D) Effect van behandeling met G-Rg3 + verapamil op de tumorbelasting bij A/J-muizen.(E) Plasmaspiegels van het leverenzym ALT.(F) Plasmaspiegels van het nierenzym Cr.(G) Plasmaniveaus van G-Rg3r of G-Rg3 van de aangegeven groepen.(H) Niveaus van G-Rg3r of G-Rg3s in de darmen van de aangegeven groepen.Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van bepalingen in drievoud.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3-niveaus in de B(a)P-geïnduceerde kankermodelmuizen werden beoordeeld met UPLC-MS/MS na een behandelingsperiode van 20 weken volgens de methode beschreven in de sectie Methoden.Figuren 4G en H tonen respectievelijk plasma- en darm-G-Rg3-niveaus.De plasma-G-Rg3r-waarden waren 0,44 ± 0,32 μmol/l en namen toe tot 1,17 ± 0,47 μmol/l bij gelijktijdige toediening van verapamil (p < 0,001), terwijl de intestinale G-Rg3r-waarden 0,53 ± 0,08 µg/l waren.In combinatie met verapamil nam de g toe tot 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Voor G-Rg3 volgden de resultaten een soortgelijk patroon, wat aangeeft dat behandeling met verapamil de orale biologische beschikbaarheid van G-Rg3 bij A/J-muizen verhoogde.
Er werd een cellevensvatbaarheidstest gebruikt om de cytotoxiciteit van B(a)P en G-Rg3 op hEL-cellen te evalueren.De cytotoxiciteit geïnduceerd door B(a)P in hEL-cellen wordt getoond in Figuur 5A, terwijl de niet-toxische eigenschappen van G-Rg3r en G-Rg3 worden getoond in Figuren 5A en 5B.5B, C. Om het cytoprotectieve effect van G-Rg3 te evalueren, werd B(a)P gelijktijdig toegediend met verschillende concentraties G-Rg3r of G-Rg3 in hEL-cellen.Zoals weergegeven in Figuur 5D herstelde G-Rg3r bij concentraties van 5 μM, 10 μM en 20 μM de levensvatbaarheid van de cellen tot respectievelijk 58,3%, 79,3% en 77,3%.Soortgelijke resultaten zijn ook te zien in de G-Rg3s-groep.Toen de concentraties van G-Rg3s 5 µM, 10 µM en 20 µM waren, werd de levensvatbaarheid van de cellen hersteld tot respectievelijk 58,3%, 72,7% en 76,7% (Figuur 5E).).De aanwezigheid van BPDE-DNA-adducten werd gemeten met behulp van een ELISA-kit.Onze resultaten toonden aan dat de BPDE-DNA-adductniveaus verhoogd waren in de met B(a)P behandelde groep vergeleken met de controlegroep, maar vergeleken met de gelijktijdige behandeling met G-Rg3 waren de BPDE-DNA-adductniveaus in de B(a)P-groep hoger. B in de behandelde groep waren de DNA-adductniveaus significant verlaagd.De resultaten van de behandeling met alleen B(a)P worden weergegeven in Figuur 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 voor G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 voor G-Rg3s, p < 0,001).
Levensvatbaarheid van de cellen en vorming van BPDE-DNA-adducten in hEL-cellen behandeld met G-Rg3 en B(a)P.(A) Levensvatbaarheid van hEL-cellen behandeld met B(a)P.(B) Levensvatbaarheid van hEL-cellen behandeld met G-Rg3r.(C) Levensvatbaarheid van hEL-cellen behandeld met G-Rg3.(D) Levensvatbaarheid van hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3r.(E) Levensvatbaarheid van hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3.(F) Niveaus van BPDE-DNA-adduct in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3.Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van bepalingen in drievoud.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST-enzymexpressie werd gedetecteerd na gelijktijdige behandeling met 10 μM B(a)P en 10 μM G-Rg3r of G-Rg3s.Onze resultaten toonden aan dat B(a)P de GST-expressie onderdrukte (59,7 ± 8,2% in de G-Rg3r-groep en 39 ± 4,5% in de G-Rg3s-groep), en dat B(a)P geassocieerd was met beide met G-Rg3r. , of met G-Rg3r, of met G-Rg3r.Gelijktijdige behandeling met G-Rg3s herstelde de GST-expressie.GST-expressie (103,7 ± 15,5% in de G-Rg3r-groep en 110 ± 11,1% in de G-Rg3s-groep, respectievelijk p <0,05 en p <0,001, Fig. 6A, B en C).GST-activiteit werd beoordeeld met behulp van een activiteitstestkit.Onze resultaten toonden aan dat de combinatiebehandelingsgroep een hogere GST-activiteit had vergeleken met de groep met alleen B(a)P (96,3 ± 6,6% versus 35,7 ± 7,8% in de G-Rg3r-groep versus 92,3 ± 6,5 in de G-Rg3r-groep ).% versus 35,7 ± 7,8% in de G-Rg3s-groep, p < 0,001, figuur 6D).
Expressie van GST en Nrf2 in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3.(A) Detectie van GST-expressie door Western-blotting.(B) Kwantitatieve expressie van GST in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3r.(C) Kwantitatieve expressie van GST in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3s.(D) GST-activiteit in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3.(E) Detectie van Nrf2-expressie door Western-blotting.(F) Kwantitatieve expressie van Nrf2 in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3r.(G) Kwantitatieve expressie van Nrf2 in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3s.Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van bepalingen in drievoud.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Om de routes die betrokken zijn bij door G-Rg3 gemedieerde onderdrukking van door B(a)P geïnduceerde tumorigenese op te helderen, werd de Nrf2-expressie beoordeeld door Western-blotting.Zoals getoond in Figuren 6E,F,G was, vergeleken met de controlegroep, alleen het niveau van Nrf2 in de B(a)P-behandelingsgroep verlaagd;vergeleken met de B(a)P-behandelingsgroep waren de B(a) Nrf2-niveaus in de PG-Rg3-groep echter verhoogd (106 ± 9,5% voor G-Rg3r versus 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% voor G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% voor G-Rg3s, p < 0,01).
We bevestigden de preventieve rol van Nrf2 door de expressie van Nrf2 te onderdrukken met behulp van specifiek klein interfererend RNA (siRNA).Nrf2-knockdown werd bevestigd door Western-blotting (Fig. 7A, B).Zoals weergegeven in Figuren 7C,D resulteerde gelijktijdige behandeling van hEL-cellen met B(a)P en G-Rg3 in een afname van het aantal BPDE-DNA-adducten (1,47 ± 0,21) vergeleken met behandeling met B(a)P alleen in de controlesiRNA-groep.) G-Rg3r was 4,13 ± 0,49, G-Rg3s was 1,8 ± 0,32 en 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Het remmende effect van G-Rg3 op de vorming van BPDE-DNA werd echter opgeheven door Nrf2-knockdown.In de siNrf2-groep was er geen significant verschil in de vorming van BPDE-DNA-adducten tussen gelijktijdige behandeling met B(a)P en G-Rg3 en behandeling met alleen B(a)P (3,0 ± 0,21 voor G-Rg3r versus 3,56 ± 0,32). ).voor G-Rg3r versus 3,6 voor G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Effect van Nrf2-knockdown op BPDE-DNA-adductvorming in hEL-cellen.(A) Nrf2-knockdown werd bevestigd door Western-blotting.(B) Kwantificering van de Nrf2-bandintensiteit.(C) Effect van Nrf2-knockdown op BPDE-DNA-adductniveaus in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3r.(D) Effect van Nrf2-knockdown op BPDE-DNA-adductniveaus in hEL-cellen behandeld met B(a)P en G-Rg3.Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van bepalingen in drievoud.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Deze studie evalueerde de preventieve effecten van verschillende rode ginseng-extracten op een muismodel van door B(a)P geïnduceerde longkanker, en KRGB-behandeling verminderde de tumorlast aanzienlijk.Gezien het feit dat G-Rg3 het hoogste gehalte heeft in dit ginsengextract, is de belangrijke rol van dit ginsenoside bij het remmen van tumorigenese onderzocht.Zowel G-Rg3r als G-Rg3 (twee epimeren van G-Rg3) verminderden de tumorlast significant in een muismodel van door B(a)P geïnduceerde kanker.G-Rg3r en G-Rg3 oefenen antikankereffecten uit door apoptose van tumorcellen te induceren, de tumorgroei te remmen, de celcyclus te stoppen en de angiogenese te beïnvloeden.Er is ook aangetoond dat G-Rg3 cellulaire metastasen remt25, en het vermogen van G-Rg3 om de effecten van chemotherapie en radiotherapie te versterken is gedocumenteerd26,27.Poon et al. hebben aangetoond dat behandeling met G-Rg3 de genotoxische effecten van B(a)P28 zou kunnen verminderen.Deze studie toont het therapeutische potentieel van G-Rg3 aan bij het richten van kankerverwekkende moleculen in het milieu en het voorkomen van kanker.
Ondanks hun goede profylactische potentieel vormt de slechte orale biologische beschikbaarheid van ginsenosiden een uitdaging voor het klinische gebruik van deze moleculen.Farmacokinetische analyse van orale toediening van ginsenosides bij ratten toonde aan dat de biologische beschikbaarheid nog steeds minder dan 5% bedraagt29.Uit deze tests bleek dat na de behandelingsperiode van 20 weken alleen de bloedspiegels van Rg5 daalden.Hoewel het onderliggende mechanisme van de slechte biologische beschikbaarheid nog moet worden opgehelderd, wordt aangenomen dat P-gp betrokken is bij de efflux van ginsenosiden.Dit werk toonde voor het eerst aan dat toediening van verapamil, een P-gp-blokker, de orale biologische beschikbaarheid van G-Rg3r en G-Rg3s verhoogt.Deze bevinding suggereert dus dat G-Rg3r en G-Rg3s fungeren als substraten van P-gp om de efflux ervan te reguleren.
Dit werk toont aan dat combinatiebehandeling met verapamil de orale biologische beschikbaarheid van G-Rg3 verhoogt in een muismodel voor longkanker.Deze bevinding wordt ondersteund door een verhoogd transcellulair transport van G-Rg3 in de darmen na P-gp-blokkade, waardoor de absorptie ervan toeneemt.Tests in Caco2-cellen toonden aan dat behandeling met verapamil de efflux van G-Rg3r en G-Rg3s verminderde en tegelijkertijd de membraanpermeabiliteit verbeterde.Een onderzoek van Yang et al.Studies hebben aangetoond dat behandeling met cyclosporine A (een andere P-gp-blokker) de biologische beschikbaarheid van ginsenoside Rh2 verhoogt van een uitgangswaarde van 1%20 tot meer dan 30%.Ginsenosideverbindingen K en Rg1 lieten ook vergelijkbare resultaten zien30,31.Wanneer verapamil en cyclosporine A gelijktijdig werden toegediend, werd de uitstroom van verbinding K in Caco-2-cellen significant verlaagd van 26,6 naar minder dan 3, terwijl de intracellulaire niveaus ervan 40-voudig toenamen30.In aanwezigheid van verapamil namen de Rg1-niveaus toe in epitheelcellen van de longen van ratten, wat een rol suggereert voor P-gp in de efflux van ginsenoside, zoals aangetoond door Meng et al.31.Verapamil had echter niet hetzelfde effect op de uitstroom van sommige ginsenosiden (zoals Rg1, F1, Rh1 en Re), wat erop wijst dat ze niet worden beïnvloed door P-gp-substraten, zoals aangetoond door Liang et al.32.Deze waarneming kan verband houden met de betrokkenheid van andere transporteurs en alternatieve ginsenosidestructuren.
Het mechanisme van het preventieve effect van G-Rg3 op kanker is onduidelijk.Eerdere studies hebben aangetoond dat G-Rg3 DNA-schade en apoptose voorkomt door oxidatieve stress en ontsteking te verminderen, wat het onderliggende mechanisme zou kunnen zijn voor het voorkomen van door B(a)P geïnduceerde tumorigenese.Sommige rapporten geven aan dat door B(a)P geïnduceerde genotoxiciteit kan worden verminderd door fase II-enzymen te moduleren om BPDE-DNA te vormen34.GST is een typisch fase II-enzym dat de vorming van BPDE-DNA-adducten remt door de binding van GSH aan BPDE te bevorderen, waardoor de door B(a)P35 geïnduceerde DNA-schade wordt verminderd.Onze resultaten laten zien dat behandeling met G-Rg3 de door B(a)P geïnduceerde cytotoxiciteit en BPDE-DNA-adductvorming in hEL-cellen vermindert en de GST-expressie en -activiteit in vitro herstelt.Deze effecten waren echter afwezig in de afwezigheid van Nrf2, wat suggereert dat G-Rg3 cytoprotectieve effecten induceert via de Nrf2-route.Nrf2 is een belangrijke transcriptiefactor voor fase II-ontgiftingsenzymen die de klaring van xenobiotica bevordert36.Activering van de Nrf2-route induceert cytoprotectie en vermindert weefselschade37.Bovendien hebben verschillende rapporten de rol van Nrf2 als tumoronderdrukker bij carcinogenese ondersteund.Onze studie toont aan dat inductie van de Nrf2-route door G-Rg3 een belangrijke regulerende rol speelt bij door B(a)P geïnduceerde genotoxiciteit door B(a)P-ontgifting te veroorzaken door fase II-enzymen te activeren, waardoor het tumorigeneseproces wordt geremd.
Ons werk onthult het potentieel van rode ginseng bij het voorkomen van door B(a)P geïnduceerde longkanker bij muizen door de belangrijke betrokkenheid van ginsenoside G-Rg3.De slechte orale biologische beschikbaarheid van dit molecuul belemmert de klinische toepassing ervan.Deze studie toont echter voor het eerst aan dat G-Rg3 een substraat is van P-gp, en toediening van een P-gp-remmer verhoogt de biologische beschikbaarheid van G-Rg3 in vitro en in vivo.G-Rg3 vermindert door B(a)P geïnduceerde cytotoxiciteit door de Nrf2-route te reguleren, wat een potentieel mechanisme kan zijn voor de preventieve functie ervan.Onze studie bevestigt het potentieel van ginsenoside G-Rg3 voor de preventie en behandeling van longkanker.
Zes weken oude vrouwelijke A/J-muizen (20 ± 1 g) en 7 weken oude mannelijke Wistar-ratten (250 ± 20 g) werden verkregen van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, VS) en het Wuhan Institute of Zoology.Universiteit (Wuhan, China).Het Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, China) voorzag ons van Caco-2- en hEL-cellen.Sigma-Aldrich (St. Louis, VS) is een bron van B(a)P en tricaprine.Gezuiverde ginsenosiden G-Rg3r en G-Rg3s, dimethylsulfoxide (DMSO), CellTiter-96 proliferatietestkit (MTS), verapamil, minimaal essentieel medium (MEM) en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, China).De QIAamp DNA-minikit en BPDE-DNA-adduct ELISA-kit werden gekocht bij Qiagen (Stanford, CA, VS) en Cell Biolabs (San Diego, CA, VS).GST-activiteitstestkit en totale eiwittestkit (standaard BCA-methode) werden gekocht bij Solarbio (Beijing, China).Alle rode ginseng-extracten worden opgeslagen in Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, China) en Korea Cancer Center (Seoul, Korea) zijn commerciële bronnen van CRG-extract en verschillende rode ginseng-extracten van verschillende Koreaanse oorsprong (waaronder KRGA, KRGB en KRGC).Rode ginseng wordt gemaakt van de wortels van 6 jaar oude verse ginseng.Rode ginseng-extract wordt verkregen door ginseng driemaal met water te wassen, vervolgens het waterige extract te concentreren en uiteindelijk bij lage temperatuur te drogen om ginseng-extractpoeder te verkrijgen.Antilichamen (anti-Nrf2, anti-GST en β-actine), mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-konijn immunoglobuline G (IgG), transfectiereagens, controle-siRNA en Nrf2-siRNA werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA).
Caco2- en hEL-cellen werden gekweekt in celkweekschalen van 100 mm2 met MEM die 10% FBS bevatte bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.Om het effect van de behandelingsomstandigheden te bepalen, werden hEL-cellen 48 uur geïncubeerd met verschillende concentraties B(a)P en G-Rg3 in MEM.Cellen kunnen verder worden geanalyseerd of verzameld om celvrije extracten te bereiden.
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Experimental Animal Ethics Committee van Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (goedkeuringsnummer 2019; registratienummer 4587TH).Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften, en het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Acht weken oude A/J-muizen werden eerst intraperitoneaal geïnjecteerd met B(a)P in tricaprine-oplossing (100 mg/kg, 0,2 ml).Na een week werden de muizen willekeurig verdeeld in controlegroepen en verschillende behandelingsgroepen, 15 muizen in elke groep, en eenmaal per dag een maagsonde toegediend.Na 20 weken behandeling werden de dieren opgeofferd door CO2-verstikking.De longen werden verzameld en gedurende 24 uur gefixeerd.Het aantal oppervlakkige tumoren en de individuele tumorgroottes werden voor elke long gekwantificeerd onder een dissectiemicroscoop.Schattingen van het tumorvolume (V) werden berekend met behulp van de volgende uitdrukking: V (mm3) = 4/3πr3, waarbij r de tumordiameter is.De netto som van alle tumorvolumes in de longen van muizen vertegenwoordigde het totale tumorvolume, en het gemiddelde totale tumorvolume in elke groep vertegenwoordigde de tumorbelasting.Volbloed- en darmmonsters werden verzameld en bewaard bij -80°C voor UPLC-MS/MS-bepaling.Er werd serum verzameld en een geautomatiseerde chemieanalysator werd gebruikt om de alanineaminotransferase (ALT) en serumcreatinine (Cr) niveaus te analyseren om de lever- en nierfunctie te beoordelen.
De verzamelde monsters werden uit de koude opslag gehaald, ontdooid, gewogen en in buizen geplaatst zoals hierboven beschreven.Hieraan werd 0,5 μM florizine (interne standaard) in 0,8 ml methanoloplossing toegevoegd.Het weefsel werd vervolgens gehomogeniseerd met behulp van Tissue-Tearor en het homogenaat werd vervolgens overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.Het mengsel werd gedurende 15 minuten bij 15.500 rpm gecentrifugeerd.Na verwijdering van 1,0 ml supernatant droogt u met stikstof.Voor de terugwinning werd tweehonderd microliter methanol gebruikt.Het bloed wordt op één lijn verzameld en verwerkt en dient als referentie voor alle metingen.
Transwell-platen met 24 putjes werden bezaaid met 1,0 x 105 Caco-2-cellen per putje om de potentiële verbetering van G-Rg3-transport door de toevoeging van verapamil te evalueren.Na 3 weken kweken werden de cellen gewassen met HBSS en voorgeïncubeerd bij 37°C.400 μl 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s of een mengsel met 50 of 100 μM verapamil) werd geïnjecteerd op de basolaterale of apicale zijde van de monolaag, en 600 μl HBSS-oplossing werd aan de andere laag toegevoegd. kant.Verzamel op de aangegeven tijdstippen (0, 15, 30, 45, 60, 90 en 120 minuten) 100 µl kweekmedium en voeg 100 µl HBSS toe om dit volume aan te vullen.Monsters werden bewaard bij -4 ° C tot detectie door UPLC-MS/MS.De uitdrukking Papp = dQ/(dT × A × C0) wordt gebruikt om de schijnbare unidirectionele apicale en basolaterale permeabiliteit te kwantificeren en vice versa (respectievelijk Pa-b en Pb-a);dQ/dT is de concentratieverandering, A (0,6 cm2) is het oppervlak van de monolaag en C0 is de initiële donorconcentratie.De effluxverhouding wordt berekend als Pb-a/Pa-b, wat de effluxsnelheid van het onderzoeksgeneesmiddel weergeeft.
Mannelijke Wistar-ratten lieten 24 uur vasten, dronken alleen water en werden verdoofd met een intraveneuze injectie van 3,5% pentobarbital-oplossing.De geïntubeerde siliconenslang heeft het uiteinde van de twaalfvingerige darm als ingang en het uiteinde van het ileum als uitgang.Gebruik een peristaltische pomp om de inlaat te pompen met 10 µM G-Rg3r of G-Rg3s in isotone HBSS met een stroomsnelheid van 0,1 ml/min.Het effect van verapamil werd beoordeeld door 50 μM of 100 μM van de verbinding toe te voegen aan 10 μM G-Rg3r of G-Rg3s.UPLC-MS/MS werd uitgevoerd op perfusie-extracten verzameld op tijdstippen 60, 90, 120 en 150 minuten na het begin van de perfusie.Het absorptiepercentage wordt gekwantificeerd met de formule: % absorptie = (1 – Cout/Cin) × 100%;de concentratie van G-Rg3 bij de uitlaat en inlaat wordt respectievelijk uitgedrukt door Cout en Cin.
hEL-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 1 x 104 cellen per putje en behandeld met B (a) P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) of G-Rg3 opgelost in DMSO .De geneesmiddelen werden vervolgens gedurende 48 uur verdund met kweekmedium tot verschillende concentraties (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM).Met behulp van een in de handel verkrijgbare MTS-testkit werden de cellen onderworpen aan een standaardprotocol en vervolgens gemeten met behulp van een microplaatlezer bij 490 nm.Het cellevensvatbaarheidsniveau van de groepen die gelijktijdig waren behandeld met B(a)P (10 μM) en G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) werd beoordeeld volgens de bovenstaande methode en vergeleken met de onbehandelde groep.
hEL-cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 x 105 cellen / putje en behandeld met 10 μMB (a) P in de aanwezigheid of afwezigheid van 10 μM G-Rg3.Na 48 uur behandeling werd DNA uit hEL-cellen geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant.De vorming van BPDE-DNA-adducten werd gedetecteerd met behulp van een BPDE-DNA-adduct ELISA-kit.De relatieve niveaus van BPDE-DNA-adduct werden gemeten met behulp van een microplaatlezer door de absorptie bij 450 nm te meten.
hEL-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 1 x 104 cellen per putje en behandeld met 10 μMB (a) P in de afwezigheid of aanwezigheid van 10 μM G-Rg3 gedurende 48 uur.GST-activiteit werd gemeten met behulp van een commerciële GST-activiteitstestkit volgens het protocol van de fabrikant.De relatieve GST-activatie werd gemeten door absorptie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer.
hEL-cellen werden gewassen met ijskoude PBS en vervolgens gelyseerd met behulp van radio-immunoprecipitatietestbuffer die proteaseremmers en fosfataseremmers bevatte.Na eiwitkwantificering met behulp van een totale eiwittestkit, werd 30 μg eiwit in elk monster gescheiden door 12% SDS-PAGE en door elektroforese overgebracht naar een PVDF-membraan.Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk en overnacht bij 4°C geïncubeerd met primaire antilichamen.Na incubatie met met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen werden verbeterde chemiluminescentiereagentia toegevoegd om het bindingssignaal zichtbaar te maken.De intensiteit van elke eiwitband werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.
GraphPad Prism 7.0-software werd gebruikt om alle gegevens te analyseren, uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking.Variatie tussen behandelingsgroepen werd beoordeeld met behulp van Student's t-test of eenzijdige variantieanalyse, waarbij een P-waarde <0,05 statistische significantie aangeeft.
Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn verkregen of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en aanvullende informatiebestanden.
Torre, LA, Siegel, RL en Jemal, A. Statistieken van longkanker.bijwoord.Verlopen.geneesmiddel.biologie.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tabak kankerverwekkende stoffen, hun biomarkers en door tabak geïnduceerde kanker.Nat.Kanker kapelaan.3, 733-744 (2003).
Phillips, DH en Venitt, S. DNA- en eiwitadducten in menselijke weefsels als gevolg van blootstelling aan tabaksrook.internationaliteit.J. Kanker.131, 2733-2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA en Yu M. Effect van Houttuynia cordata en silibinine op door benzo (a) pyreen geïnduceerde longtumorigenese bij A / J-muizen.Kreeft 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Natuurlijk product tegen kanker geïsoleerd uit Chinese geneeskrachtige materialen.kaak.geneesmiddel.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Werkzaamheid van polyfenon E, rode ginseng en rapamycine op door benzo(a)pyreen geïnduceerde longtumorigenese bij A/J-muizen.Kanker 8, 52-58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS en Yuan, KS Red, betrokkenheid bij kankertherapie.kaak.J. Nutt.geneesmiddel.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS en Gao, L. Ginsenosides in de wortels en bladeren van Amerikaanse ginseng.J. Agric.Voedsel scheikunde.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA en Yuan KS Farmacologie van ginseng: veel componenten en veel effecten.biochemie.farmacologie.58, 1685-1693 (1999).
Posttijd: 17 september 2023