Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For best resultat anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren din (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten styling eller JavaScript.
Rød ginseng har blitt brukt i tradisjonell asiatisk medisin i hundrevis av år.I denne studien evaluerte vi evnen til fire typer rød ginseng (kinesisk rød ginseng, koreansk rød ginseng A, koreansk rød ginseng B og koreansk rød ginseng C) dyrket i forskjellige regioner til å hemme dannelsen og veksten av kreftfremkalt lunge svulster.En benzo(a)pyren (B(a)P)-test ble utført på A/J-mus, og koreansk rød ginseng B ble funnet å være den mest effektive for å redusere svulstbelastningen blant de fire røde ginsengvariantene.I tillegg analyserte vi innholdet av ulike ginsenosider (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 og Rg5) i fire røde ginsengekstrakter og fant at koreansk rød ginseng B hadde de høyeste nivåene av ginsenosid Rg3 (G-Rg3), noe som tyder på at G-Rg3 kan spille en viktig rolle i dens terapeutiske effekt.Dette arbeidet viser at G-Rg3 har relativt lav biotilgjengelighet.Når G-Rg3 ble administrert samtidig med P-gp-hemmeren verapamil, ble imidlertid utstrømningen av G-Rg3 til Caco-2-celler redusert, tarmabsorpsjonshastigheten av G-Rg3 ble økt i en rottemodell, og G-Rg3 ble økt.I Caco-2-celler avtar utstrømningen av Rg3, og nivået av Rg3-konsentrasjonen avtar.G-Rg3 øker i tarmen og plasma, og dens evne til å forhindre svulster er også forbedret i en rottemodell av B(a)P-indusert tumorigenese.Vi fant også at G-Rg3 reduserte B(a)P-indusert cytotoksisitet og DNA-adduktdannelse i humane lungeceller, og gjenopprettet ekspresjonen og aktiviteten til fase II-enzymer gjennom Nrf2-banen, som kan være relatert til den potensielle virkningsmekanismen av G-hemming -Rg3..Om forekomsten av lungesvulster.Vår studie viser en potensielt viktig rolle for G-Rg3 i målretting av lungesvulster i musemodeller.Den orale biotilgjengeligheten til dette ginsenoside forbedres ved å målrette P-glykoprotein, slik at molekylet kan utøve antikrefteffekter.
Den vanligste typen lungekreft er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som er en av de viktigste årsakene til kreftdødsfall i Kina og Nord-Amerika1,2.Hovedfaktoren som øker risikoen for å utvikle ikke-småcellet lungekreft er røyking.Sigarettrøyk inneholder mer enn 60 kreftfremkallende stoffer, inkludert benzo(a)pyren (B(a)P), nitrosaminer og radioaktive isotoper fra nedbrytning av radon.3 Polysykliske aromatiske hydrokarboner B(a)P er hovedårsaken til toksisitet i sigaretter røyk.Ved eksponering for B(a)P omdanner cytokrom P450 det til B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoksid (BPDE), som reagerer med DNA for å danne BPDE-DNA-addukt 4. I tillegg er disse addukter induserer lungetumorgenese hos mus med tumorstadium og histopatologi som ligner på humane lungetumorer5.Denne funksjonen gjør den B(a)P-induserte lungekreftmodellen til et egnet system for å evaluere forbindelser med mulige antikreftegenskaper.
En mulig strategi for å forhindre utvikling av lungekreft i høyrisikogrupper, spesielt røykere, er bruken av kjemopreventive midler for å undertrykke utviklingen av intraepiteliale neoplastiske lesjoner og derved forhindre deres påfølgende progresjon til malignitet.Dyrestudier viser at ulike kjemopreventive midler er effektive6.Vår forrige rapport7 fremhevet de gode forebyggende effektene av rød ginseng på lungekreft.Denne urten har blitt brukt i århundrer i tradisjonell asiatisk medisin for å forlenge liv og helse, og har blitt dokumentert å ha antitumoreffekter8.
Den aktive faktoren til ginseng er ginsenoside, som brukes som en sammensatt markør for å evaluere kvaliteten på ginsengekstrakter.Kvantitativ analyse av råginsengekstrakter involverer vanligvis bruk av flere ginsenosider, inkludert RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 og Rc9,10.Ginsenosider har liten klinisk bruk på grunn av deres svært dårlige orale biotilgjengelighet11.Selv om mekanismen for denne dårlige biotilgjengeligheten ikke er klar, kan utstrømningen av ginsenosider forårsaket av P-glykoprotein (P-gp)12 være årsaken.P-gp er en av de viktigste utstrømningstransportørene i den ATP-bindende kassetttransportør-superfamilien, som bruker energien fra ATP-hydrolyse til å frigjøre intracellulære stoffer til det ytre miljøet.P-gp-transportører er vanligvis vidt distribuert i tarm-, nyre-, lever- og blod-hjerne-barrieren13.P-gp spiller en kritisk rolle i intestinal absorpsjon, og hemming av P-gp øker oral absorpsjon og tilgjengelighet av enkelte kreftmedisiner12,14.Eksempler på inhibitorer tidligere brukt i litteraturen er verapamil og cyklosporin A15.Dette arbeidet innebærer å etablere et musesystem for å studere B(a)P-indusert lungekreft for å evaluere evnen til forskjellige røde ginsengekstrakter fra Kina og Korea til å påvirke maligniteter.Ekstraktene ble individuelt analysert for å identifisere spesifikke ginsenosider som kan påvirke karsinogenesen.Verapamil ble deretter brukt til å målrette P-gp og forbedre den orale biotilgjengeligheten og den terapeutiske effekten av kreftmålrettede ginsenosider.
Mekanismen som ginsengsaponiner utøver terapeutiske effekter på karsinogenesen er fortsatt uklar.Forskning har vist at ulike ginsenosider kan redusere DNA-skader forårsaket av kreftfremkallende stoffer ved å redusere oksidativt stress og aktivere fase II avgiftningsenzymer, og dermed forhindre celleskade.Glutation S-transferase (GST) er et typisk fase II-enzym som er nødvendig for å redusere DNA-skader forårsaket av kreftfremkallende stoffer17.Nukleær erytroid 2-relatert faktor 2 (Nrf2) er en viktig transkripsjonsfaktor som regulerer redokshomeostase og aktiverer ekspresjonen av fase II-enzymer og cytobeskyttende antioksidantresponser18.Vår studie undersøkte også effekten av identifiserte ginsenosider på å redusere B(a)P-indusert cytotoksisitet og BPDE-DNA-adduktdannelse, samt indusere fase II-enzymer ved å modulere Nrf2-banen i normale lungeceller.
Etableringen av en musemodell av B(a)P-indusert kreft er i samsvar med tidligere arbeid5.Figur 1A viser den eksperimentelle utformingen av en 20-ukers behandling av en musekreftmodell indusert av B(a)P, vann (kontroll), kinesisk rød ginsengekstrakt (CRG), koreansk rød ginsengekstrakt A (KRGA) og koreansk rød ginseng.Ekstrakt B (KRGB) og koreansk rød ginsengekstrakt C (KRGC).Etter 20 uker med rød ginseng-behandling ble mus ofret ved CO2-kvelning.Figur 1B viser makroskopiske lungesvulster hos dyr behandlet med forskjellige typer rød ginseng, og figur 1C viser et representativt lysmikrofotografi av en tumorprøve.Svulstbelastningen til KRGB-behandlede dyr (1,5 ± 0,35) var lavere enn for kontrolldyr (0,82 ± 0,2, P < 0,05), som vist i figur 1D.Gjennomsnittlig grad av hemming av tumorbelastning var 45 %.Andre røde ginsengekstrakter som ble testet viste ikke så signifikante endringer i tumorbelastning (P > 0,05).Ingen åpenbare bivirkninger ble observert i musemodellen i løpet av 20 uker med rød ginsengbehandling, inkludert ingen endring i kroppsvekt (data ikke vist) og ingen lever- eller nyretoksisitet (figur 1E,F).
Rødt ginseng-ekstrakt behandler utvikling av lungesvulst hos A/J-mus.(A) Eksperimentell design.(B) Store lungesvulster i en musemodell.Tumorer er indikert med piler.a: Kinesisk rød ginseng gruppe.b: gruppe A av koreansk rød ginseng.c: Koreansk rød ginseng gruppe B. d: Koreansk rød ginseng gruppe C. d: Kontrollgruppe.(C) Lysmikrofotografi som viser en lungesvulst.Forstørrelse: 100. b: 400. (D) Tumorbelastning i den røde ginsengekstraktgruppen.(E) Plasmanivåer av leverenzymet ALT.(F) Plasmanivåer av nyreenzymet Cr.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik.*P <0,05.
De røde ginsengekstraktene identifisert i denne studien ble analysert ved hjelp av ultraytelses væskekromatografi tandem massespektrometri (UPLC-MS/MS) for å kvantifisere følgende ginsenosider: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 og Rg5.UPLC- og MS-forholdene som ble brukt til å måle analyttene ble beskrevet i en tidligere rapport19.UPLC-MS/MS-kromatogrammer av fire røde ginsengekstrakter er vist i figur 2A.Det var signifikante forskjeller i totalt ginsenosidinnhold, med det høyeste totale ginsenosidinnholdet i CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figur 2B).Ved evaluering av individuelle ginsenosider (Figur 2C), viste KRGB det høyeste nivået av G-Rg3 sammenlignet med andre ginsenosider (58,33 ± 3,81 μmol/L for G-Rg3s og 41,56 ± 2,88 μmol/L for G -Rg3r).L).rød ginseng type (P < 0,001).G-Rg3 forekommer som et par stereoisomerer G-Rg3r og G-Rg3s, som er forskjellige i posisjonen til hydroksylgruppen ved karbon 20 (fig. 2D).Resultatene indikerer at G-Rg3r eller G-Rg3 kan ha viktig antikreftpotensial i en B(a)P-indusert kreftmusemodell.
Innhold av ginsenosider i ulike røde ginsengekstrakter.(A) UPLC-MS/MS-kromatogrammer av fire røde ginsengekstrakter.(B) Estimering av totalt ginsenosidinnhold i de angitte ekstraktene.(C) Påvisning av individuelle ginsenosider i merkede ekstrakter.(D) Strukturer av ginsenosid stereoisomerer G-Rg3r og G-Rg3s.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikatbestemmelser.***P <0,001.
UPLC-MS/MS-studien krevde kvantifisering av ginsenosider i tarm- og blodprøver etter 20 ukers behandling.Behandling med KRGB viste tilstedeværelse av kun 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 i blodet.Ingen gjenværende ginsenosider ble oppdaget, noe som indikerer dårlig oral biotilgjengelighet og derfor redusert eksponering for disse ginsenosidene.
Colon adenokarsinomcellelinjen Caco-2 er morfologisk og biokjemisk lik humane tarmepitelceller, noe som viser dens nytte ved å vurdere enterocytttransport over tarmepitelbarrieren.Denne analysen var basert på en tidligere studie 20 .Figurene 3A,B,C,D,E,F viser representative bilder av transcellulær transport av G-Rg3r og G-Rg3 ved bruk av en Caco-2 monolagsmodell.Transcellulær transport av G-Rg3r eller G-Rg3 over Caco-2 monolag fra den basolaterale til apikale siden (Pb-a) var signifikant høyere enn fra den apikale til basolaterale siden (Pa-b).For G-Rg3r var gjennomsnittlig Pa-b-verdi 0,38 ± 0,06, som økte til 0,73 ± 0,06 etter behandling med 50 μmol/L verapamil og til 1,14 ± 0,09 etter behandling med 100 μmol/L verapamil (p < 0,01 og henholdsvis figur 2).3A).Observasjoner for G-Rg3 fulgte et lignende mønster (fig. 3B), og resultatene viste at verapamilbehandling økte transporten av G-Rg3r og G-Rg3.Verapamilbehandling resulterte også i en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig Pb-a og G-Rg3r og G-Rg3s utstrømningsforhold (figur 3C,D,E,F), noe som indikerer at verapamilbehandling reduserer ginsenosidinnholdet i Caco-2 utstrømningsceller..
Transcellulær transport av G-Rg3 i Caco-2 monolag og intestinal absorpsjon i en rotteperfusjonsanalyse.(A) Pa-b verdi av G-Rg3r gruppe i Caco-2 monolag.(B) Pa-b verdi av G-Rg3s grupper i Caco-2 monolag.(C) Pb-verdi for G-Rg3r-gruppen i Caco-2 monolag.(D) Pb verdi av G-Rg3s grupper i Caco-2 monolag.(E) Utbytteforhold for G-Rg3r-grupper i et Caco-2-monolag.(F) Utbytteforhold for G-Rg3-grupper i et Caco-2-monolag.(G) Prosentandel av intestinal absorpsjon av G-Rg3r i en perfusjonsanalyse hos rotter.(H) Prosentandel av intestinal absorpsjon av G-Rg3 i en perfusjonsanalyse hos rotter.Permeabilitet og absorpsjon ble sammenlignet uten tilsetning av verapamil.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for fem uavhengige eksperimenter.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
I samsvar med tidligere arbeid20 ble ortotopisk intestinal perfusjon av rotter utført for å bestemme om G-Rg3-absorpsjon i tarmen øker etter verapamilbehandling.Figurene 3G,H viser representative perfusjonsanalyser for å evaluere prosentandelen av intestinal absorpsjon av G-Rg3r og G-Rg3 i kreftmodellrotter i løpet av ovennevnte tidsperioder.Den initiale prosentandelen av svakt G-Rg3r-opptak på ca. 10 % økte til mer enn 20 % etter behandling med 50 μM verapamil og til mer enn 25 % etter behandling med 100 μM verapamil.Likeledes viste G-Rg3, som hadde et initialt opptak på 10 %, også en topp på over 20 % etter behandling med 50 μM verapamil og nesten 30 % etter behandling med 100 μM verapamil, noe som tyder på at hemming av P-gp av verapamil øker intestinal G-absorpsjon Rg3 i en musemodell av lungekreft.
I henhold til metoden ovenfor ble B(a)P-induserte kreftmodellmus tilfeldig delt inn i seks grupper, som vist i figur 4A.Ingen signifikant vekttap eller kliniske tegn på toksisitet ble observert i G-Rg3-behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (data ikke vist).Etter 20 ukers behandling ble lungene til hver mus samlet.Figur 4B viser makroskopiske lungetumorer hos mus i behandlingsgruppene ovenfor, og figur 4C viser et representativt lysmikrofotografi av en representativ tumor.Når det gjelder tumorbelastningen i hver gruppe (fig. 4D), var verdiene for mus behandlet med G-Rg3r og G-Rg3s henholdsvis 0,75 ± 0,29 mm3 og 0,81 ± 0,30 mm3, mens verdiene for G-mus behandlet med -Rg3s var 1,63 henholdsvis ±0,40 mm3.kontrollmus (p < 0,001), noe som indikerer at G-Rg3-behandling reduserte tumorbelastningen hos mus.Administrering av verapamil forsterket denne reduksjonen ytterligere: verdiene hos verapamil+ G-Rg3r-mus sank fra 0,75 ± 0,29 mm3 til 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), og verdiene for verapamil+ fra 0,81 ± 0,30,30,30,30 mm3 1 ± 0,291 ± 0,29 reduserte mm3 i G.-Rg3s-behandlede mus (p < 0,05), noe som indikerer at verapamil kan forsterke den hemmende effekten av G-Rg3 på tumorgenese.Tumorbelastningen viste ingen signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen og verapamilgruppen, G-Rg3r-gruppen og G-Rg3s-gruppen, og verapamil+G-Rg3r-gruppen og verapamil+G-Rg3s-gruppen.Dessuten var det ingen signifikant lever- eller nyretoksisitet assosiert med de evaluerte behandlingene (Figur 4E,F).
Tumorbelastning etter G-Rg3-behandling og plasma- eller intestinale G-Rg3r- og G-Rg3-nivåer i de angitte gruppene.(A) Eksperimentell design.(B) Makroskopiske svulster i en musemodell.Tumorer er indikert med piler.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r i kombinasjon med verapamil.d: G-Rg3 i kombinasjon med verapamil.d: Verapamil.e: kontroll.(C) Optisk mikrofotografi av svulsten ved forstørrelse.Svar: 100x.b: 400X.(D) Effekt av G-Rg3 + verapamil-behandling på tumorbelastning hos A/J-mus.(E) Plasmanivåer av leverenzymet ALT.(F) Plasmanivåer av nyreenzymet Cr.(G) Plasmanivåer av G-Rg3r eller G-Rg3 i de angitte gruppene.(H) Nivåer av G-Rg3r eller G-Rg3s i tarmene til de angitte gruppene.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikatbestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3-nivåer i de B(a)P-induserte kreftmodellmusene ble vurdert med UPLC-MS/MS etter en 20-ukers behandlingsperiode i henhold til metoden beskrevet i metodedelen.Figurene 4G og H viser henholdsvis plasma- og tarm-G-Rg3-nivåer.Plasma G-Rg3r-nivåer var 0,44 ± 0,32 μmol/L og økte til 1,17 ± 0,47 μmol/L ved samtidig administrering av verapamil (p < 0,001), mens intestinale G-Rg3r-nivåer var 0,53 ± 0,08 µg/l.Ved kombinert med verapamil økte g til 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).For G-Rg3 fulgte resultatene et lignende mønster, noe som indikerer at verapamil-behandling økte den orale biotilgjengeligheten av G-Rg3 i A/J-mus.
Cellelevedyktighetsanalyse ble brukt for å evaluere cytotoksisiteten til B(a)P og G-Rg3 på hEL-celler.Cytotoksisiteten indusert av B(a)P i hEL-celler er vist i figur 5A, mens de ikke-toksiske egenskapene til G-Rg3r og G-Rg3 er vist i figur 5A og 5B.5B, C. For å evaluere den cytobeskyttende effekten av G-Rg3, ble B(a)P administrert sammen med forskjellige konsentrasjoner av G-Rg3r eller G-Rg3 inn i hEL-celler.Som vist i figur 5D, gjenopprettet G-Rg3r ved konsentrasjoner på 5 μM, 10 μM og 20 μM cellelevedyktigheten til henholdsvis 58,3 %, 79,3 % og 77,3 %.Lignende resultater kan også sees i G-Rg3s-gruppen.Når konsentrasjonene av G-Rg3s var 5 µM, 10 µM og 20 µM, ble cellelevedyktigheten gjenopprettet til henholdsvis 58,3 %, 72,7 % og 76,7 % (Figur 5E).).Tilstedeværelsen av BPDE-DNA-addukter ble målt ved bruk av et ELISA-sett.Resultatene våre viste at BPDE-DNA-adduktnivåer ble økt i den B(a)P-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, men sammenlignet med G-Rg3-sambehandling, ble BPDE-DNA-adduktnivåene i B(a)P-gruppen B i den behandlede gruppen ble nivåene av DNA-addukt betydelig redusert.Resultatene av behandling med B(a)P alene er vist i figur 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 for G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 for G-Rg3s, p < 0,001).
Cellelevedyktighet og BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler behandlet med G-Rg3 og B(a)P.(A) Levedyktigheten til hEL-celler behandlet med B(a)P.(B) Levedyktigheten til hEL-celler behandlet med G-Rg3r.(C) Levedyktigheten til hEL-celler behandlet med G-Rg3.(D) Levedyktighet til hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(E) Levedyktighet til hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(F) Nivåer av BPDE-DNA-addukt i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikatbestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST-enzymekspresjon ble påvist etter samtidig behandling med 10 μM B(a)P og 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.Resultatene våre viste at B(a)P undertrykte GST-ekspresjon (59,7 ± 8,2 % i G-Rg3r-gruppen og 39 ± 4,5 % i G-Rg3s-gruppen), og B(a)P var assosiert med begge med G-Rg3r , eller med G-Rg3r, eller med G-Rg3r.Sambehandling med G-Rg3s gjenopprettet GST-uttrykk.GST-ekspresjon (103,7 ± 15,5 % i G-Rg3r-gruppen og 110 ± 11,1 % i G-Rg3s-gruppen, henholdsvis p < 0,05 og p < 0,001, fig. 6A, B og C).GST-aktivitet ble vurdert ved bruk av et aktivitetsanalysesett.Resultatene våre viste at kombinasjonsbehandlingsgruppen hadde høyere GST-aktivitet sammenlignet med bare B(a)P-gruppen (96,3 ± 6,6 % vs. 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3r-gruppen vs. 92,3 ± 6,5 i G-Rg3r-gruppen ).% vs 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3s-gruppen, p < 0,001, figur 6D).
Ekspresjon av GST og Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(A) Deteksjon av GST-uttrykk ved Western blotting.(B) Kvantitativ ekspresjon av GST i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(C) Kvantitativ ekspresjon av GST i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3s.(D) GST-aktivitet i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.(E) Deteksjon av Nrf2-uttrykk ved Western blotting.(F) Kvantitativ ekspresjon av Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(G) Kvantitativ ekspresjon av Nrf2 i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3s.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikatbestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
For å belyse veiene involvert i G-Rg3-mediert undertrykkelse av B(a)P-indusert tumorigenese, ble Nrf2-ekspresjon vurdert ved Western blotting.Som vist i figurene 6E,F,G, sammenlignet med kontrollgruppen, ble bare nivået av Nrf2 i B(a)P-behandlingsgruppen redusert;sammenlignet med B(a)P-behandlingsgruppen var imidlertid B(a) Nrf2-nivåene i PG-Rg3-gruppen økt (106 ± 9,5 % for G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6, 2 % for G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % for G-Rg3s, p < 0,01).
Vi bekreftet den forebyggende rollen til Nrf2 ved å undertrykke Nrf2-ekspresjon ved å bruke spesifikt lite forstyrrende RNA (siRNA).Nrf2 knockdown ble bekreftet ved Western blotting (fig. 7A,B).Som vist i figur 7C,D, resulterte samtidig behandling av hEL-celler med B(a)P og G-Rg3 i en reduksjon i antall BPDE-DNA-addukter (1,47 ± 0,21) sammenlignet med behandling med B(a)P alene i kontroll siRNA-gruppen.) G-Rg3r var 4,13 ± 0,49, G-Rg3s var 1,8 ± 0,32 og 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Imidlertid ble den hemmende effekten av G-Rg3 på BPDE-DNA-dannelse opphevet av Nrf2 knockdown.I siNrf2-gruppen var det ingen signifikant forskjell i BPDE-DNA-adduktdannelse mellom B(a)P og G-Rg3 samtidig behandling og B(a)P behandling alene (3,0 ± 0,21 for G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).for G-Rg3r versus 3,6 for G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler.(A) Nrf2 knockdown ble bekreftet ved Western blotting.(B) Kvantifisering av Nrf2-båndintensitet.(C) Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktnivåer i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3r.(D) Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktnivåer i hEL-celler behandlet med B(a)P og G-Rg3.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikatbestemmelser.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Denne studien evaluerte de forebyggende effektene av forskjellige røde ginsengekstrakter på en musemodell av B(a)P-indusert lungekreft, og KRGB-behandling reduserte tumorbelastningen betydelig.Tatt i betraktning at G-Rg3 har det høyeste innholdet i dette ginsengekstraktet, har den viktige rollen til dette ginsenosidet i å hemme tumorgenese blitt studert.Både G-Rg3r og G-Rg3 (to epimerer av G-Rg3) reduserte tumorbelastningen signifikant i en musemodell av B(a)P-indusert kreft.G-Rg3r og G-Rg3 utøver antikrefteffekter ved å indusere apoptose av tumorceller21, hemme tumorvekst22, stoppe cellesyklusen23 og påvirke angiogenese24.G-Rg3 har også vist seg å hemme cellulær metastase25, og evnen til G-Rg3 til å forsterke effekten av kjemoterapi og strålebehandling er dokumentert26,27.Poon et al demonstrerte at G-Rg3-behandling kunne redusere de genotoksiske effektene av B(a)P28.Denne studien demonstrerer det terapeutiske potensialet til G-Rg3 for å målrette kreftfremkallende molekyler i miljøet og forebygge kreft.
Til tross for deres gode profylaktiske potensial, utgjør den dårlige orale biotilgjengeligheten av ginsenosider en utfordring for klinisk bruk av disse molekylene.Farmakokinetisk analyse av oral administrering av ginsenosider hos rotter viste at biotilgjengeligheten fortsatt er mindre enn 5 %29.Disse testene viste at etter den 20 uker lange behandlingsperioden var det bare blodnivåene av Rg5 som gikk ned.Selv om den underliggende mekanismen for dårlig biotilgjengelighet gjenstår å bli belyst, antas P-gp å være involvert i utstrømningen av ginsenosider.Dette arbeidet viste for første gang at administrering av verapamil, en P-gp-blokker, øker den orale biotilgjengeligheten av G-Rg3r og G-Rg3s.Dermed antyder dette funnet at G-Rg3r og G-Rg3s fungerer som substrater for P-gp for å regulere utstrømningen.
Dette arbeidet viser at kombinasjonsbehandling med verapamil øker den orale biotilgjengeligheten av G-Rg3 i en musemodell av lungekreft.Dette funnet støttes av økt intestinal transcellulær transport av G-Rg3 ved P-gp-blokkering, og øker dermed absorpsjonen.Analyser i Caco2-celler viste at verapamilbehandling reduserte utstrømningen av G-Rg3r og G-Rg3s mens den forbedret membranpermeabiliteten.En studie av Yang et al.Studier har vist at behandling med ciklosporin A (en annen P-gp-blokker) øker biotilgjengeligheten av ginsenosid Rh2 fra en baseline-verdi på 1 %20 til mer enn 30 %.Ginsenosideforbindelsene K og Rg1 viste også lignende resultater30,31.Når verapamil og ciklosporin A ble administrert samtidig, ble utstrømningen av forbindelse K i Caco-2-celler betydelig redusert fra 26,6 til mindre enn 3, mens dets intracellulære nivåer økte 40 ganger30.I nærvær av verapamil økte Rg1-nivåene i rottelungeepitelceller, noe som tyder på en rolle for P-gp i ginsenosid-utstrømning, som vist av Meng et al.31.Verapamil hadde imidlertid ikke samme effekt på utstrømningen av noen ginsenosider (som Rg1, F1, Rh1 og Re), noe som indikerer at de ikke påvirkes av P-gp-substrater, som vist av Liang et al.32 .Denne observasjonen kan være relatert til involvering av andre transportører og alternative ginsenosidstrukturer.
Mekanismen for den forebyggende effekten av G-Rg3 på kreft er uklar.Tidligere studier har vist at G-Rg3 forhindrer DNA-skade og apoptose ved å redusere oksidativt stress og betennelse16,33, som kan være den underliggende mekanismen for å forhindre B(a)P-indusert tumorigenese.Noen rapporter indikerer at genotoksisitet indusert av B(a)P kan reduseres ved å modulere fase II-enzymer for å danne BPDE-DNA34.GST er et typisk fase II-enzym som hemmer dannelse av BPDE-DNA-addukt ved å fremme bindingen av GSH til BPDE, og dermed redusere DNA-skade indusert av B(a)P35.Resultatene våre viser at G-Rg3-behandling reduserer B(a)P-indusert cytotoksisitet og BPDE-DNA-adduktdannelse i hEL-celler og gjenoppretter GST-ekspresjon og aktivitet in vitro.Imidlertid var disse effektene fraværende i fravær av Nrf2, noe som tyder på at G-Rg3 induserer cytobeskyttende effekter gjennom Nrf2-banen.Nrf2 er en viktig transkripsjonsfaktor for fase II avgiftningsenzymer som fremmer clearance av xenobiotika36.Aktivering av Nrf2-banen induserer cytobeskyttelse og reduserer vevsskade37.Dessuten har flere rapporter støttet rollen til Nrf2 som en tumorundertrykker i karsinogenese38.Vår studie viser at induksjon av Nrf2-vei av G-Rg3 spiller en viktig regulatorisk rolle i B(a)P-indusert genotoksisitet ved å forårsake B(a)P-avgiftning ved å aktivere fase II-enzymer, og dermed hemme tumorgenese-prosessen.
Vårt arbeid avslører potensialet til rød ginseng for å forhindre B(a)P-indusert lungekreft hos mus gjennom den viktige involveringen av ginsenosid G-Rg3.Den dårlige orale biotilgjengeligheten til dette molekylet hemmer dets kliniske anvendelse.Imidlertid viser denne studien for første gang at G-Rg3 er et substrat for P-gp, og administrering av en P-gp-hemmer øker biotilgjengeligheten av G-Rg3 in vitro og in vivo.G-Rg3 reduserer B(a)P-indusert cytotoksisitet ved å regulere Nrf2-banen, som kan være en potensiell mekanisme for dens forebyggende funksjon.Vår studie bekrefter potensialet til ginsenoside G-Rg3 for forebygging og behandling av lungekreft.
Seks uker gamle A/J hunnmus (20 ± 1 g) og 7 uker gamle Wistar hannrotter (250 ± 20 g) ble hentet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) og Wuhan Institute of Zoology.Universitetet (Wuhan, Kina).Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, Kina) ga oss Caco-2- og hEL-celler.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) er en kilde til B(a)P og tricaprin.Rensede ginsenosider G-Rg3r og G-Rg3s, dimetylsulfoksid (DMSO), CellTiter-96 proliferasjonsanalysesett (MTS), verapamil, minimalt essensielt medium (MEM) og føtalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Kina).QIAamp DNA mini kit og BPDE-DNA addukt ELISA kit ble kjøpt fra Qiagen (Stanford, CA, USA) og Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).GST-aktivitetsanalysesett og totalproteinanalysesett (standard BCA-metode) ble kjøpt fra Solarbio (Beijing, Kina).Alle røde ginsengekstrakter er lagret i Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Kina) og Korea Cancer Center (Seoul, Korea) er kommersielle kilder til CRG-ekstrakt og ulike røde ginsengekstrakter av ulik koreansk opprinnelse (inkludert KRGA, KRGB og KRGC).Rød ginseng er laget av røttene til 6 år gammel fersk ginseng.Rødt ginsengekstrakt oppnås ved å vaske ginseng med vann tre ganger, deretter konsentrere det vandige ekstraktet og til slutt tørke ved lav temperatur for å oppnå ginsengekstraktpulver.Antistoffer (anti-Nrf2, anti-GST og β-aktin), pepperrotperoksidase-konjugert anti-kanin immunoglobulin G (IgG), transfeksjonsreagens, kontroll siRNA og Nrf2 siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Caco2- og hEL-celler ble dyrket i 100 mm2 cellekulturskåler med MEM inneholdende 10% FBS ved 37 °C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.For å bestemme effekten av behandlingsforholdene ble hEL-celler inkubert med forskjellige konsentrasjoner av B(a)P og G-Rg3 i MEM i 48 timer.Celler kan videre analyseres eller samles for å fremstille cellefrie ekstrakter.
Alle eksperimentene ble godkjent av den eksperimentelle dyreetiske komiteen ved Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (godkjenning nr. 2019; registreringsnr. 4587TH).Alle forsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter, og studien ble utført i henhold til Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) retningslinjer.Åtte uker gamle A/J-mus ble først injisert intraperitonealt med B(a)P i trikaprinløsning (100 mg/kg, 0,2 ml).Etter en uke ble musene tilfeldig delt inn i kontrollgrupper og ulike behandlingsgrupper, 15 mus i hver gruppe, og gitt en gang daglig.Etter 20 ukers behandling ble dyrene avlivet ved CO2-kvelning.Lungene ble samlet og fiksert i 24 timer.Antall overfladiske svulster og individuelle tumorstørrelser ble kvantifisert for hver lunge under et dissekerende mikroskop.Tumorvolumestimater (V) ble beregnet ved å bruke følgende uttrykk: V (mm3) = 4/3πr3, hvor r er tumordiameteren.Nettosummen av alle tumorvolumer i lungene til mus representerte det totale tumorvolumet, og det gjennomsnittlige totale tumorvolumet i hver gruppe representerte tumorbelastningen.Helblods- og tarmprøver ble samlet og lagret ved -80 °C for UPLC-MS/MS-bestemmelse.Serum ble samlet inn og en automatisert kjemianalysator ble brukt til å analysere nivåer av alaninaminotransferase (ALT) og serumkreatinin (Cr) for å vurdere lever- og nyrefunksjon.
Innsamlede prøver ble fjernet fra kjølelager, tint, veid og plassert i rør som beskrevet ovenfor.Til dette ble det tilsatt 0,5 μM florizin (intern standard) i 0,8 ml metanolløsning.Vevet ble deretter homogenisert ved bruk av Tissue-Tearor og homogenatet ble deretter overført til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.Blandingen ble sentrifugert ved 15500 rpm i 15 minutter.Etter fjerning av 1,0 ml supernatant, tørk med nitrogen.To hundre mikroliter metanol ble brukt for utvinning.Blodet samles og behandles på én linje og brukes som referanse for alle målinger.
24-brønners Transwell-plater ble sådd med 1,0 × 105 Caco-2-celler per brønn for å evaluere den potensielle forbedringen av G-Rg3-transport ved tilsetning av verapamil.Etter 3 ukers dyrking ble cellene vasket med HBSS og preinkubert ved 37°C.400 μL av 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s, eller en blanding med 50 eller 100 μM verapamil) ble injisert på den basolaterale eller apikale siden av monolaget, og 600 μL HBSS-løsning ble tilsatt til den andre side.Samle 100 µl kulturmedium på de angitte tidspunktene (0, 15, 30, 45, 60, 90 og 120 minutter) og tilsett 100 µl HBSS for å gjøre opp dette volumet.Prøver ble lagret ved -4 °C inntil påvisning med UPLC-MS/MS.Uttrykket Papp = dQ/(dT × A × C0) brukes til å kvantifisere den tilsynelatende ensrettede apikale og basolaterale permeabiliteten og vice versa (henholdsvis Pa-b og Pb-a);dQ/dT er endringen i konsentrasjon, A (0,6 cm2) er overflatearealet til monolaget, og C0 er den opprinnelige donorkonsentrasjonen.Utstrømningsforholdet beregnes som Pb-a/Pa-b, som representerer utstrømningshastigheten til studiemedikamentet.
Wistar-hannrotter ble fastet i 24 timer, drakk kun vann og bedøvet med en intravenøs injeksjon av 3,5 % pentobarbitalløsning.Det intuberte silikonrøret har enden av tolvfingertarmen som inngang og enden av ileum som utgang.Bruk en peristaltisk pumpe til å pumpe innløpet med 10 µM G-Rg3r eller G-Rg3s i isotonisk HBSS med en strømningshastighet på 0,1 ml/min.Effekten av verapamil ble vurdert ved å tilsette 50 μM eller 100 μM av forbindelsen til 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.UPLC-MS/MS ble utført på perfusjonsekstrakter samlet på tidspunktene 60, 90, 120 og 150 minutter etter starten av perfusjonen.Prosentandelen av absorpsjon kvantifiseres med formelen % absorpsjon = (1 – Cout/Cin) × 100 %;konsentrasjonen av G-Rg3 ved utløpet og innløpet uttrykkes med henholdsvis Cout og Cin.
hEL-celler ble sådd i 96-brønners plater med en tetthet på 1 × 104 celler per brønn og behandlet med B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) eller G-Rg3 oppløst i DMSO .Legemidlene ble deretter fortynnet med kulturmedium til forskjellige konsentrasjoner (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) i løpet av 48 timer.Ved å bruke et kommersielt tilgjengelig MTS-analysesett ble cellene underkastet en standardprotokoll og deretter målt ved bruk av en mikroplateleser ved 490 nm.Cellelevedyktighetsnivået til gruppene som ble behandlet sammen med B(a)P (10 μM) og G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) ble vurdert i henhold til metoden ovenfor og sammenlignet med den ubehandlede gruppen.
hEL-celler ble sådd i 6-brønners plater med en tetthet på 1 × 105 celler/brønn og behandlet med 10 μMB(a)P i nærvær eller fravær av 10 μM G-Rg3.Etter 48 timers behandling ble DNA ekstrahert fra hEL-celler ved å bruke QIAamp DNA Mini Kit i henhold til produsentens protokoll.Dannelsen av BPDE-DNA-addukter ble påvist ved bruk av et BPDE-DNA-addukt-ELISA-sett.Relative nivåer av BPDE-DNA-addukt ble målt ved å bruke en mikroplateleser ved å måle absorbans ved 450 nm.
hEL-celler ble sådd i 96-brønners plater med en tetthet på 1 × 104 celler per brønn og behandlet med 10 μMB(a)P i fravær eller nærvær av 10 μM G-Rg3 i 48 timer.GST-aktivitet ble målt ved å bruke et kommersielt GST-aktivitetsanalysesett i henhold til produsentens protokoll.Relativ GST-aktivering ble målt ved absorbans ved 450 nm ved bruk av en mikroplateleser.
hEL-celler ble vasket med iskald PBS og deretter lysert ved bruk av radioimmunutfellingsanalysebuffer som inneholdt proteaseinhibitorer og fosfatasehemmere.Etter proteinkvantifisering ved bruk av et totalproteinanalysesett, ble 30 μg protein i hver prøve separert med 12% SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran ved elektroforese.Membraner ble blokkert med 5 % skummet melk og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4°C.Etter inkubasjon med pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer, ble forsterkede kjemiluminescensreagenser tilsatt for å visualisere bindingssignalet.Intensiteten til hvert proteinbånd ble kvantifisert ved bruk av ImageJ-programvare.
GraphPad Prism 7.0 programvare ble brukt til å analysere alle data, uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik.Variasjon mellom behandlingsgruppene ble vurdert ved hjelp av Students t-test eller enveis variansanalyse, med en P-verdi <0,05 som indikerer statistisk signifikans.
Alle data innhentet eller analysert i løpet av denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen og tilleggsinformasjonsfiler.
Torre, LA, Siegel, RL og Jemal, A. Lungekreftstatistikk.adverb.Utløpt.medisin.biologi.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tobakkskreftfremkallende stoffer, deres biomarkører og tobakk-indusert kreft.Nat.Kreftprest.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH og Venitt, S. DNA og proteinaddukter i menneskelig vev som følge av eksponering for tobakksrøyk.internasjonalitet.J. Kreft.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA og Yu M. Effekt av Houttuynia cordata og silibinin på benzo(a)pyren-indusert lungetumorogenese i A/J-mus.Kreft 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Antikreft naturlig produkt isolert fra kinesiske medisinske materialer.kjeve.medisin.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Effekten av polyfenon E, rød ginseng og rapamycin på benzo(a)pyrenindusert lungetumorogenese hos A/J-mus.Kreft 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS og Yuan, KS Red, involvering i kreftbehandling.kjeve.J. Nutt.medisin.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS og Gao, L. Ginsenosider i røttene og bladene til amerikansk ginseng.J. Agric.Matkjemi.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA og Yuan KS Farmakologi av ginseng: mange komponenter og mange effekter.biokjemi.farmakologi.58, 1685-1693 (1999).
Innleggstid: 17. september 2023