Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy użycie nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylizacji i JavaScript.
Czerwony żeń-szeń stosowany jest w tradycyjnej medycynie azjatyckiej od setek lat.W tym badaniu oceniliśmy zdolność czterech rodzajów czerwonego żeń-szenia (chińskiego czerwonego żeń-szenia, koreańskiego czerwonego żeń-szenia A, koreańskiego czerwonego żeń-szenia B i koreańskiego czerwonego żeń-szenia C) uprawianych w różnych regionach w hamowaniu powstawania i wzrostu nowotworów płuc wywołanych czynnikami rakotwórczymi. nowotwory.Test na benzo(a)piren (B(a)P) przeprowadzono na myszach A/J i stwierdzono, że żeń-szeń koreański B jest najbardziej skuteczny w zmniejszaniu masy nowotworu spośród czterech odmian czerwonego żeń-szenia.Ponadto przeanalizowaliśmy zawartość różnych ginsenozydów (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5) w czterech ekstraktach z czerwonego żeń-szenia i odkryliśmy, że koreański czerwony żeń-szeń B ma najwyższe poziomy ginsenozydu Rg3 (G-Rg3), co sugeruje, że G-Rg3 może odgrywać ważną rolę w jego skuteczności terapeutycznej.Praca ta pokazuje, że G-Rg3 ma stosunkowo niską biodostępność.Jednakże, gdy G-Rg3 podawano jednocześnie z inhibitorem P-gp werapamilem, wypływ G-Rg3 do komórek Caco-2 zmniejszył się, szybkość wchłaniania jelitowego G-Rg3 wzrosła w modelu szczurzym, a G-Rg3 zwiększono.W komórkach Caco-2 zmniejsza się odpływ Rg3 i zmniejsza się poziom stężenia Rg3.Poziom G-Rg3 wzrasta w jelicie i osoczu, a jego zdolność do zapobiegania nowotworom jest również zwiększona w szczurzym modelu nowotworzenia indukowanego B(a)P.Odkryliśmy również, że G-Rg3 zmniejsza cytotoksyczność indukowaną B(a)P i tworzenie adduktów DNA w ludzkich komórkach płuc oraz przywraca ekspresję i aktywność enzymów fazy II poprzez szlak Nrf2, co może być związane z potencjalnym mechanizmem działania hamowania G -Rg3..O występowaniu nowotworów płuc.Nasze badanie pokazuje potencjalnie ważną rolę G-Rg3 w celowaniu w nowotwory płuc w modelach mysich.Biodostępność tego ginsenozydu po podaniu doustnym jest zwiększona poprzez celowanie w glikoproteinę P, dzięki czemu cząsteczka może wywierać działanie przeciwnowotworowe.
Najczęstszym typem raka płuc jest niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC), który jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu nowotworów w Chinach i Ameryce Północnej1,2.Głównym czynnikiem zwiększającym ryzyko zachorowania na niedrobnokomórkowego raka płuc jest palenie tytoniu.Dym papierosowy zawiera ponad 60 substancji rakotwórczych, w tym benzo(a)piren (B(a)P), nitrozoaminy i radioaktywne izotopy powstałe w wyniku rozpadu radonu.3 Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne B(a)P są główną przyczyną toksyczności papierosów palić.Pod wpływem ekspozycji na B(a)P cytochrom P450 przekształca go w B(a)P-7,8-dihydrodiolo-9,10-epoksyd (BPDE), który reaguje z DNA tworząc addukt 4 BPDE-DNA. Addukty indukują nowotworzenie płuc u myszy ze stadium nowotworu i histopatologią podobną do ludzkich guzów płuc5.Ta cecha sprawia, że model raka płuc indukowanego B(a)P jest odpowiednim systemem do oceny związków o możliwych właściwościach przeciwnowotworowych.
Jedną z możliwych strategii zapobiegania rozwojowi raka płuc w grupach wysokiego ryzyka, zwłaszcza u palaczy, jest stosowanie środków chemioprewencyjnych w celu zahamowania rozwoju śródnabłonkowych zmian nowotworowych i tym samym zapobiegania ich późniejszej progresji do nowotworu.Badania na zwierzętach pokazują, że skuteczne są różne środki chemoprewencyjne6.W naszym poprzednim raporcie7 podkreśliliśmy dobre działanie zapobiegawcze czerwonego żeń-szenia na raka płuc.Zioło to było stosowane od wieków w tradycyjnej medycynie azjatyckiej w celu przedłużenia życia i zdrowia oraz posiada udokumentowane działanie przeciwnowotworowe8.
Aktywnym czynnikiem żeń-szenia jest ginsenozyd, który służy jako złożony marker do oceny jakości ekstraktów z żeń-szenia.Analiza ilościowa surowych ekstraktów z żeń-szenia zazwyczaj obejmuje użycie kilku ginsenozydów, w tym RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 i Rc9,10.Ginsenozydy mają niewielkie zastosowanie kliniczne ze względu na ich bardzo słabą biodostępność po podaniu doustnym11.Chociaż mechanizm tej słabej biodostępności nie jest jasny, przyczyną może być wypływ ginsenozydów spowodowany przez glikoproteinę P (P-gp)12.P-gp jest jednym z najważniejszych transporterów wypływu w nadrodzinie transporterów kaset wiążących ATP, który wykorzystuje energię hydrolizy ATP do uwalniania substancji wewnątrzkomórkowych do środowiska zewnętrznego.Transportery P-gp są zazwyczaj szeroko rozpowszechnione w jelicie, nerkach, wątrobie i barierze krew-mózg13.P-gp odgrywa kluczową rolę we wchłanianiu jelitowym, a hamowanie P-gp zwiększa wchłanianie po podaniu doustnym i dostępność niektórych leków przeciwnowotworowych12,14.Przykładami inhibitorów stosowanych wcześniej w literaturze są werapamil i cyklosporyna A15.Praca ta obejmuje stworzenie mysiego systemu do badania raka płuc wywołanego B(a)P w celu oceny zdolności różnych ekstraktów z czerwonego żeń-szenia z Chin i Korei do wpływania na nowotwory.Ekstrakty poddano indywidualnej analizie w celu zidentyfikowania specyficznych ginsenozydów, które mogą wpływać na karcynogenezę.Następnie zastosowano werapamil w celu ukierunkowania P-gp oraz poprawy biodostępności po podaniu doustnym i skuteczności terapeutycznej ginsenozydów działających na raka.
Mechanizm, dzięki któremu saponiny żeń-szenia wywierają działanie terapeutyczne na karcynogenezę, pozostaje niejasny.Badania wykazały, że różne ginsenozydy mogą zmniejszać uszkodzenia DNA spowodowane przez czynniki rakotwórcze poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego i aktywację enzymów detoksykacyjnych fazy II, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniom komórek.S-transferaza glutationowa (GST) jest typowym enzymem fazy II, niezbędnym do ograniczenia uszkodzeń DNA powodowanych przez czynniki rakotwórcze17.Czynnik 2 związany z erytroidem jądrowym 2 (Nrf2) jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje homeostazę redoks i aktywuje ekspresję enzymów fazy II oraz cytoprotekcyjne odpowiedzi antyoksydacyjne18.W naszym badaniu zbadaliśmy także wpływ zidentyfikowanych ginsenozydów na zmniejszenie cytotoksyczności indukowanej przez B(a)P i tworzenie adduktów BPDE-DNA, a także indukcję enzymów fazy II poprzez modulację szlaku Nrf2 w normalnych komórkach płuc.
Utworzenie mysiego modelu raka wywołanego B(a)P jest zgodne z wcześniejszymi pracami5.Rycina 1A przedstawia projekt eksperymentalny 20-tygodniowego leczenia mysiego modelu raka indukowanego przez B(a)P, wodę (kontrola), ekstrakt z czerwonego żeń-szenia chińskiego (CRG), ekstrakt z czerwonego żeń-szenia koreańskiego A (KRGA) i czerwień koreańską żeń-szeń.Ekstrakt B (KRGB) i ekstrakt z czerwonego żeń-szenia koreańskiego C (KRGC).Po 20 tygodniach leczenia czerwonym żeń-szeniem myszy uśmiercano przez uduszenie CO2.Rycina 1B przedstawia makroskopowe nowotwory płuc u zwierząt leczonych różnymi rodzajami czerwonego żeń-szenia, a Rycina 1C przedstawia reprezentatywną mikrografię świetlną próbki nowotworu.Obciążenie nowotworem zwierząt leczonych KRGB (1,5 ± 0,35) było niższe niż u zwierząt kontrolnych (0,82 ± 0,2, P <0,05), jak pokazano na Figurze 1D.Średni stopień zahamowania obciążenia nowotworem wynosił 45%.Inne badane ekstrakty z czerwonego żeń-szenia nie wykazały tak znaczących zmian w masie guza (P > 0,05).Nie zaobserwowano żadnych oczywistych skutków ubocznych w modelu mysim podczas 20 tygodni leczenia czerwonym żeń-szeniem, w tym braku zmiany masy ciała (dane nie pokazane) ani toksyczności dla wątroby lub nerek (Rysunek 1E, F).
Ekstrakt z czerwonego żeń-szenia leczy rozwój nowotworu płuc u myszy A/J.(A) Projekt eksperymentalny.(B) Duże guzy płuc w modelu mysim.Guzy zaznaczono strzałkami.Odp.: Grupa chińskiego czerwonego żeń-szenia.b: grupa A żeń-szenia koreańskiego czerwonego.c: Grupa B czerwonego żeń-szenia koreańskiego. d: Grupa C czerwonego żeń-szenia koreańskiego. d: Grupa kontrolna.(C) Mikrofotografia przedstawiająca guz płuc.Powiększenie: 100. b: 400. (D) Obciążenie nowotworem w grupie ekstraktu z czerwonego żeń-szenia.(E) Poziomy enzymu wątrobowego ALT w osoczu.(F) Poziomy enzymu nerkowego Cr w osoczu.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe.*P <0,05.
Ekstrakty z czerwonego żeń-szenia zidentyfikowane w tym badaniu analizowano metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (UPLC-MS/MS) w celu ilościowego oznaczenia następujących ginsenozydów: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 i Rg5.Warunki UPLC i MS stosowane do pomiaru analitów opisano w poprzednim raporcie19.Chromatogramy UPLC-MS/MS czterech ekstraktów z czerwonego żeń-szenia przedstawiono na Figurze 2A.Wystąpiły znaczące różnice w całkowitej zawartości ginsenozydów, przy czym najwyższa całkowita zawartość ginsenozydów w CRG (590,27 ± 41,28 μmol/l) (ryc. 2B).Oceniając poszczególne ginsenozydy (ryc. 2C), KRGB wykazało najwyższy poziom G-Rg3 w porównaniu z innymi ginsenozydami (58,33 ± 3,81 μmol/L dla G-Rg3s i 41,56 ± 2,88 μmol/L dla G -Rg3r.L).typ czerwonego żeń-szenia (P <0,001).G-Rg3 występuje jako para stereoizomerów G-Rg3r i G-Rg3s, które różnią się pozycją grupy hydroksylowej przy węglu 20 (ryc. 2D).Wyniki wskazują, że G-Rg3r lub G-Rg3 mogą mieć istotny potencjał przeciwnowotworowy w mysim modelu raka indukowanego B(a)P.
Zawartość ginsenozydów w różnych ekstraktach z czerwonego żeń-szenia.(A) Chromatogramy UPLC-MS/MS czterech ekstraktów z czerwonego żeń-szenia.(B) Oszacowanie całkowitej zawartości ginsenozydów we wskazanych ekstraktach.(C) Wykrywanie poszczególnych ginsenozydów w znakowanych ekstraktach.(D) Struktury stereoizomerów ginsenozydu G-Rg3r i G-Rg3s.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych oznaczeń.***P <0,001.
Badanie UPLC-MS/MS wymagało ilościowego oznaczenia ginsenozydów w próbkach jelit i krwi po 20 tygodniach leczenia.Leczenie KRGB wykazało obecność jedynie 0,0063 ± 0,0005 µg/ml Rg5 we krwi.Nie wykryto żadnych pozostałych ginsenozydów, co wskazuje na słabą biodostępność po podaniu doustnym i w związku z tym zmniejszoną ekspozycję na te ginsenozydy.
Linia komórkowa gruczolakoraka okrężnicy Caco-2 jest morfologicznie i biochemicznie podobna do ludzkich komórek nabłonka jelitowego, co wskazuje na jej użyteczność w ocenie transportu enterocytów przez barierę nabłonkową jelit.Analiza ta opierała się na wcześniejszym badaniu 20 .Figury 3A, B, C, D, E, F przedstawiają reprezentatywne obrazy transportu przezkomórkowego G-Rg3r i G-Rg3 przy użyciu modelu jednowarstwowego Caco-2.Transport przezkomórkowy G-Rg3r lub G-Rg3 przez monowarstwy Caco-2 ze strony podstawno-bocznej do strony wierzchołkowej (Pb-a) był znacznie wyższy niż ze strony wierzchołkowej do strony podstawno-bocznej (Pa-b).Dla G-Rg3r średnia wartość Pa-b wyniosła 0,38 ± 0,06 i wzrosła do 0,73 ± 0,06 po leczeniu werapamilem w stężeniu 50 µmol/l i do 1,14 ± 0,09 po leczeniu werapamilem w stężeniu 100 µmol/l (p < 0,01 i 0,001, odpowiednio rys. 2).3A).Obserwacje dla G-Rg3 przebiegały według podobnego schematu (ryc. 3B), a wyniki wykazały, że leczenie werapamilem wzmaga transport G-Rg3r i G-Rg3.Leczenie werapamilem spowodowało również znaczące zmniejszenie średnich współczynników wypływu Pb-a i G-Rg3r i G-Rg3s (Figura 3C, D, E, F), co wskazuje, że leczenie werapamilem zmniejsza zawartość ginsenozydu w komórkach wypływu Caco-2..
Transport przezkomórkowy G-Rg3 w monowarstwach Caco-2 i wchłanianie jelitowe w teście perfuzji szczurów.(A) Wartość Pa-b grupy G-Rg3r w monowarstwie Caco-2.(B) Wartość Pa-b grup G-Rg3s w monowarstwie Caco-2.(C) Wartość Pb grupy G-Rg3r w monowarstwie Caco-2.(D) Wartość Pb grup G-Rg3s w monowarstwie Caco-2.(E) Stosunek plastyczności grup G-Rg3r w monowarstwie Caco-2.(F) Stosunek plastyczności grup G-Rg3 w monowarstwie Caco-2.(G) Procent wchłaniania jelitowego G-Rg3r w teście perfuzji u szczurów.(H) Procent wchłaniania jelitowego G-Rg3 w teście perfuzji u szczurów.Porównano przepuszczalność i wchłanianie bez dodatku werapamilu.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z pięciu niezależnych eksperymentów.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Zgodnie z wcześniejszymi pracami20, przeprowadzono ortotopową perfuzję jelitową szczurów, aby określić, czy wchłanianie G-Rg3 w jelitach wzrasta po leczeniu werapamilem.Figury 3G, H przedstawiają reprezentatywne testy perfuzji mające na celu ocenę procentu wchłaniania jelitowego G-Rg3r i G-Rg3 u szczurów w modelu raka w powyższych okresach czasu.Początkowy procent słabego wychwytu G-Rg3r wynoszący około 10% wzrósł do ponad 20% po leczeniu 50 µM werapamilem i do ponad 25% po leczeniu 100 µM werapamilu.Podobnie G-Rg3, którego początkowy wychwyt wynosił 10%, również wykazywał szczyt wynoszący ponad 20% po leczeniu 50 μM werapamilu i prawie 30% po leczeniu 100 μM werapamilu, co sugeruje, że hamowanie P-gp przez werapamil zwiększa jelitowa absorpcja G Rg3 w mysim modelu raka płuc.
Zgodnie z powyższą metodą, myszy modelowe raka indukowanego B(a)P podzielono losowo na sześć grup, jak pokazano na Figurze 4A.Nie zaobserwowano znaczącej utraty masy ciała ani klinicznych objawów toksyczności w grupie leczonej G-Rg3 w porównaniu z grupą kontrolną (dane nie pokazane).Po 20 tygodniach leczenia pobrano płuca od każdej myszy.Figura 4B przedstawia makroskopowe guzy płuc u myszy w powyższych grupach leczenia, a Figura 4C przedstawia reprezentatywną mikrografię świetlną reprezentatywnego guza.Jeśli chodzi o obciążenie nowotworem w każdej grupie (ryc. 4D), wartości dla myszy leczonych G-Rg3r i G-Rg3s wynosiły odpowiednio 0,75 ± 0,29 mm3 i 0,81 ± 0,30 mm3, podczas gdy wartości dla myszy G leczonych z -Rg3s wynosiły odpowiednio 1,63 ±0,40 mm3.myszy kontrolne (p < 0,001), wskazując, że leczenie G-Rg3 zmniejszyło obciążenie nowotworem u myszy.Podawanie werapamilu dodatkowo zwiększyło tę redukcję: wartości u myszy werapamil+ G-Rg3r spadły z 0,75 ± 0,29 mm3 do 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), a wartości dla werapamilu+ z 0,81 ± 0,30 mm3 spadły do 0,29 ± 0,21 mm3 u myszy leczonych G.-Rg3s (p < 0,05), co wskazuje, że werapamil może nasilać hamujący wpływ G-Rg3 na powstawanie nowotworów.Obciążenie nowotworem nie wykazało znaczących różnic pomiędzy grupą kontrolną a grupą werapamilu, grupą G-Rg3r i grupą G-Rg3s oraz grupą werapamil+G-Rg3r i grupą werapamil+G-Rg3s.Co więcej, nie stwierdzono znaczących działań toksycznych na wątrobę lub nerki związanych z ocenianymi terapiami (ryc. 4E, F).
Obciążenie nowotworem po leczeniu G-Rg3 oraz poziomy G-Rg3r i G-Rg3 w osoczu lub jelitach we wskazanych grupach.(A) Projekt eksperymentalny.(B) Guzy makroskopowe w modelu mysim.Guzy zaznaczono strzałkami.a: G-Wg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r w połączeniu z werapamilem.d: G-Rg3 w połączeniu z werapamilem.d: Werapamil.e: kontrola.(C) Mikrofotografia optyczna guza w powiększeniu.Odpowiedź: 100x.b: 400X.(D) Wpływ leczenia G-Rg3 + werapamilem na masę nowotworu u myszy A/J.(E) Poziomy enzymu wątrobowego ALT w osoczu.(F) Poziomy enzymu nerkowego Cr w osoczu.(G) Poziomy G-Rg3r lub G-Rg3 w osoczu wskazanych grup.(H) Poziomy G-Rg3r lub G-Rg3s w jelitach wskazanych grup.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych oznaczeń.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Poziomy G-Rg3 u myszy w modelu raka indukowanego B(a)P oceniano metodą UPLC-MS/MS po 20-tygodniowym okresie leczenia zgodnie z metodą opisaną w części Metody.Figury 4G i H przedstawiają odpowiednio poziomy G-Rg3 w osoczu i jelitach.Stężenie G-Rg3r w osoczu wynosiło 0,44 ± 0,32 µmol/l i zwiększało się do 1,17 ± 0,47 µmol/l po jednoczesnym podaniu werapamilu (p < 0,001), podczas gdy stężenie G-Rg3r w jelitach wynosiło 0,53 ± 0,08 µg/l.W połączeniu z werapamilem g wzrosło do 1,35 ± 0,13 µg/g (p < 0,001).W przypadku G-Rg3 wyniki były podobne, wskazując, że leczenie werapamilem zwiększało biodostępność G-Rg3 po podaniu doustnym u myszy A/J.
Do oceny cytotoksyczności B(a)P i G-Rg3 na komórkach hEL zastosowano test żywotności komórek.Cytotoksyczność indukowaną przez B(a)P w komórkach hEL pokazano na Figurze 5A, podczas gdy nietoksyczne właściwości G-Rg3r i G-Rg3 pokazano na Figurach 5A i 5B.5B, C. Aby ocenić działanie cytoprotekcyjne G-Rg3, B(a)P podawano wspólnie z G-Rg3r lub G-Rg3 w różnych stężeniach do komórek hEL.Jak pokazano na Figurze 5D, G-Rg3r w stężeniach 5 µM, 10 µM i 20 µM przywracał żywotność komórek odpowiednio do 58,3%, 79,3% i 77,3%.Podobne wyniki można zaobserwować także w grupie G-Rg3s.Gdy stężenia G-Rg3 wynosiły 5 µM, 10 µM i 20 µM, żywotność komórek została przywrócona odpowiednio do 58,3%, 72,7% i 76,7% (Figura 5E).).Obecność adduktów BPDE-DNA mierzono za pomocą zestawu ELISA.Nasze wyniki pokazały, że poziomy adduktów BPDE-DNA były zwiększone w grupie leczonej B(a)P w porównaniu z grupą kontrolną, ale w porównaniu z jednoczesnym leczeniem G-Rg3, poziomy adduktów BPDE-DNA w grupie B(a)P B w grupie leczonej poziomy adduktów DNA były znacząco zmniejszone.Wyniki leczenia samym B(a)P przedstawiono na rycinie 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 dla G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 dla G -Rg3s, p < 0,001).
Żywotność komórek i tworzenie adduktów BPDE-DNA w komórkach hEL traktowanych G-Rg3 i B(a)P.(A) Żywotność komórek hEL traktowanych B(a)P.(B) Żywotność komórek hEL traktowanych G-Rg3r.(C) Żywotność komórek hEL traktowanych G-Rg3.(D) Żywotność komórek hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3r.(E) Żywotność komórek hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.(F) Poziomy adduktu BPDE-DNA w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych oznaczeń.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ekspresję enzymu GST wykryto po jednoczesnym potraktowaniu 10 µM B(a)P i 10 µM G-Rg3r lub G-Rg3s.Nasze wyniki pokazały, że B(a)P tłumiło ekspresję GST (59,7 ± 8,2% w grupie G-Rg3r i 39 ± 4,5% w grupie G-Rg3s), a B(a)P było powiązane z którymkolwiek z G-Rg3r lub z G-Rg3r, lub z G-Rg3r.Jednoczesne leczenie G-Rg3 przywróciło ekspresję GST.Ekspresja GST (103,7 ± 15,5% w grupie G-Rg3r i 110 ± 11,1% w grupie G-Rg3s, odpowiednio p < 0,05 i p < 0,001, ryc. 6A, B i C).Aktywność GST oceniano za pomocą zestawu do oznaczania aktywności.Nasze wyniki wykazały, że grupa leczona skojarzeniem miała wyższą aktywność GST w porównaniu z grupą otrzymującą wyłącznie B(a)P (96,3 ± 6,6% w porównaniu z 35,7 ± 7,8% w grupie G-Rg3r w porównaniu z 92,3 ± 6,5 w grupie G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% w grupie G-Rg3s, p < 0,001, Ryc. 6D).
Ekspresja GST i Nrf2 w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.(A) Wykrywanie ekspresji GST metodą Western blot.(B) Ilościowa ekspresja GST w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3r.(C) Ilościowa ekspresja GST w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.(D) Aktywność GST w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.(E) Wykrywanie ekspresji Nrf2 metodą Western blot.(F) Ilościowa ekspresja Nrf2 w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3r.(G) Ilościowa ekspresja Nrf2 w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych oznaczeń.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Aby wyjaśnić szlaki zaangażowane w supresję nowotworzenia indukowanego B(a)P za pośrednictwem G-Rg3, ekspresję Nrf2 oceniano metodą Western blot.Jak pokazano na Figurach 6E, F, G, w porównaniu z grupą kontrolną, obniżony został jedynie poziom Nrf2 w grupie leczonej B(a)P;jednakże w porównaniu z grupą leczoną B(a)P, poziomy B(a) Nrf2 w grupie PG-Rg3 wzrosły (106 ± 9,5% dla G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% dla G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% dla G-Rg3s, p < 0,01).
Potwierdziliśmy zapobiegawczą rolę Nrf2 poprzez tłumienie ekspresji Nrf2 przy użyciu specyficznego małego interferującego RNA (siRNA).Knockdown Nrf2 potwierdzono metodą Western blot (ryc. 7A, B).Jak pokazano na Rycinach 7C, D, jednoczesne traktowanie komórek hEL B(a)P i G-Rg3 spowodowało zmniejszenie liczby adduktów BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) w porównaniu z leczeniem B(a)P sam w kontrolnej grupie siRNA.) G-Rg3r wynosił 4,13 ± 0,49, G-Rg3s wynosił 1,8 ± 0,32 i 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Jednakże hamujący wpływ G-Rg3 na tworzenie BPDE-DNA został zniesiony przez powalenie Nrf2.W grupie siNrf2 nie było istotnej różnicy w tworzeniu adduktów BPDE-DNA pomiędzy jednoczesnym leczeniem B(a)P i G-Rg3 a samym leczeniem B(a)P (3,0 ± 0,21 dla G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).dla G-Rg3r w porównaniu z 3,6 dla G-Rg3s w porównaniu z ±0,45 w porównaniu z 4,0±0,37, p > 0,05).
Wpływ powalenia Nrf2 na tworzenie adduktu BPDE-DNA w komórkach hEL.(A) Powalenie Nrf2 potwierdzono metodą Western blot.(B) Kwantyfikacja intensywności pasma Nrf2.(C) Wpływ knockdown Nrf2 na poziomy adduktów BPDE-DNA w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3r.(D) Wpływ knockdown Nrf2 na poziomy adduktów BPDE-DNA w komórkach hEL traktowanych B(a)P i G-Rg3.Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych oznaczeń.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
W tym badaniu oceniano zapobiegawcze działanie różnych ekstraktów z czerwonego żeń-szenia na mysim modelu raka płuc wywołanego B(a)P, a leczenie KRGB znacząco zmniejszyło obciążenie nowotworem.Biorąc pod uwagę, że G-Rg3 ma najwyższą zawartość w tym ekstrakcie żeń-szenia, zbadano ważną rolę tego ginsenozydu w hamowaniu powstawania nowotworów.Zarówno G-Rg3r, jak i G-Rg3 (dwa epimery G-Rg3) znacząco zmniejszały obciążenie nowotworem w mysim modelu raka indukowanego B(a)P.G-Rg3r i G-Rg3 wywierają działanie przeciwnowotworowe poprzez indukcję apoptozy komórek nowotworowych21, hamowanie wzrostu guza22, zatrzymanie cyklu komórkowego23 i wpływ na angiogenezę24.Wykazano również, że G-Rg3 hamuje przerzuty komórkowe25 i udokumentowano zdolność G-Rg3 do wzmacniania efektów chemioterapii i radioterapii26,27.Poon i wsp. wykazali, że leczenie G-Rg3 może zmniejszyć genotoksyczne działanie B(a)P28.Badanie to pokazuje potencjał terapeutyczny G-Rg3 w zwalczaniu środowiskowych cząsteczek rakotwórczych i zapobieganiu nowotworom.
Pomimo ich dobrego potencjału profilaktycznego, słaba biodostępność ginsenozydów po podaniu doustnym stanowi wyzwanie dla klinicznego zastosowania tych cząsteczek.Analiza farmakokinetyczna doustnego podawania ginsenozydów szczurom wykazała, że ich biodostępność nadal wynosi mniej niż 5%29.Testy te wykazały, że po 20-tygodniowym okresie leczenia obniżył się jedynie poziom Rg5 we krwi.Chociaż mechanizm leżący u podstaw słabej dostępności biologicznej pozostaje do wyjaśnienia, uważa się, że P-gp bierze udział w wypływie ginsenozydów.Praca ta wykazała po raz pierwszy, że podawanie werapamilu, blokera P-gp, zwiększa biodostępność G-Rg3r i G-Rg3s po podaniu doustnym.Zatem odkrycie to sugeruje, że G-Rg3r i G-Rg3 działają jako substraty P-gp regulując jej wypływ.
Praca ta pokazuje, że leczenie skojarzone z werapamilem zwiększa biodostępność G-Rg3 po podaniu doustnym w mysim modelu raka płuc.Odkrycie to potwierdza zwiększony przezkomórkowy transport jelitowy G-Rg3 po blokadzie P-gp, zwiększając w ten sposób jego wchłanianie.Testy na komórkach Caco2 wykazały, że leczenie werapamilem zmniejsza wypływ G-Rg3r i G-Rg3, poprawiając jednocześnie przepuszczalność błony.Badanie przeprowadzone przez Yanga i in.Badania wykazały, że leczenie cyklosporyną A (inny bloker P-gp) zwiększa biodostępność ginsenozydu Rh2 z wartości wyjściowej 1%20 do ponad 30%.Związki ginsenozydów K i Rg1 również wykazały podobne wyniki30,31.Po jednoczesnym podaniu werapamilu i cyklosporyny A wypływ związku K z komórek Caco-2 uległ znacznemu zmniejszeniu z 26,6 do mniej niż 3, podczas gdy jego poziom wewnątrzkomórkowy wzrósł 40-krotnie30.W obecności werapamilu poziom Rg1 wzrósł w komórkach nabłonka płuc szczura, co sugeruje rolę P-gp w wypływie ginsenozydu, jak wykazali Meng i wsp.31.Jednakże werapamil nie miał takiego samego wpływu na wypływ niektórych ginsenozydów (takich jak Rg1, F1, Rh1 i Re), co wskazuje, że substraty P-gp nie mają na nie wpływu, jak wykazali Liang i in.32 .Obserwacja ta może być związana z udziałem innych transporterów i alternatywnych struktur ginsenozydów.
Mechanizm profilaktycznego działania G-Rg3 na raka jest niejasny.Poprzednie badania wykazały, że G-Rg3 zapobiega uszkodzeniom DNA i apoptozie poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego16,33, co może stanowić podstawowy mechanizm zapobiegania nowotworzeniu indukowanemu przez B(a)P.Niektóre doniesienia wskazują, że genotoksyczność indukowaną przez B(a)P można zmniejszyć poprzez modulację enzymów fazy II z wytworzeniem BPDE-DNA34.GST jest typowym enzymem fazy II, który hamuje tworzenie adduktów BPDE-DNA poprzez promowanie wiązania GSH z BPDE, zmniejszając w ten sposób uszkodzenia DNA indukowane przez B(a)P35.Nasze wyniki pokazują, że leczenie G-Rg3 zmniejsza cytotoksyczność indukowaną B(a)P i tworzenie adduktu BPDE-DNA w komórkach hEL oraz przywraca ekspresję i aktywność GST in vitro.Jednakże efekty te nie występowały w przypadku braku Nrf2, co sugeruje, że G-Rg3 indukuje działanie cytoprotekcyjne poprzez szlak Nrf2.Nrf2 jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym dla enzymów detoksykacyjnych fazy II, który promuje usuwanie ksenobiotyków36.Aktywacja szlaku Nrf2 indukuje cytoprotekcję i zmniejsza uszkodzenie tkanki37.Co więcej, kilka raportów potwierdziło rolę Nrf2 jako supresora nowotworu w karcynogenezie38.Nasze badanie pokazuje, że indukcja szlaku Nrf2 przez G-Rg3 odgrywa ważną rolę regulacyjną w genotoksyczności indukowanej B(a)P, powodując detoksykację B(a)P poprzez aktywację enzymów fazy II, hamując w ten sposób proces nowotworzenia.
Nasza praca ujawnia potencjał czerwonego żeń-szenia w zapobieganiu rakowi płuc indukowanemu przez B(a)P u myszy poprzez istotne zaangażowanie ginsenozydu G-Rg3.Słaba biodostępność tej cząsteczki po podaniu doustnym utrudnia jej zastosowanie kliniczne.Jednakże badanie to pokazuje po raz pierwszy, że G-Rg3 jest substratem P-gp, a podawanie inhibitora P-gp zwiększa biodostępność G-Rg3 in vitro i in vivo.G-Rg3 zmniejsza cytotoksyczność indukowaną B(a)P poprzez regulację szlaku Nrf2, co może być potencjalnym mechanizmem jego funkcji zapobiegawczej.Nasze badanie potwierdza potencjał ginsenozydu G-Rg3 w profilaktyce i leczeniu raka płuc.
Sześciotygodniowe samice myszy A/J (20 ± 1 g) i 7-tygodniowe samce szczurów Wistar (250 ± 20 g) otrzymano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) i Wuhan Institute of Zoology.Uniwersytet (Wuhan, Chiny).Centrum gromadzenia kultur typu chińskiego (Wuhan, Chiny) dostarczyło nam komórki Caco-2 i hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) jest źródłem B(a)P i trikapryny.Oczyszczone ginsenozydy G-Rg3r i G-Rg3s, sulfotlenek dimetylu (DMSO), zestaw do testu proliferacji CellTiter-96 (MTS), werapamil, minimalną niezbędną pożywkę (MEM) i płodową surowicę bydlęcą (FBS) zakupiono od Chengdu Must Bio-Technology .Spółka.(Chengdu, Chiny).Minizestaw QIAamp DNA i zestaw ELISA adduktu BPDE-DNA zakupiono od Qiagen (Stanford, Kalifornia, USA) i Cell Biolabs (San Diego, Kalifornia, USA).Zestaw do oznaczania aktywności GST i zestaw do oznaczania białka całkowitego (standardowa metoda BCA) zakupiono od Solarbio (Pekin, Chiny).Wszystkie ekstrakty z czerwonego żeń-szenia są przechowywane w Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hongkong, Chiny) i Korea Cancer Center (Seul, Korea) są komercyjnymi źródłami ekstraktu CRG i różnych ekstraktów z czerwonego żeń-szenia różnego pochodzenia koreańskiego (w tym KRGA, KRGB i KRGC).Żeń-szeń czerwony wytwarzany jest z korzeni 6-letniego świeżego żeń-szenia.Ekstrakt z czerwonego żeń-szenia otrzymuje się poprzez trzykrotne przemycie żeń-szenia wodą, następnie zatężenie wodnego ekstraktu i na koniec wysuszenie w niskiej temperaturze w celu otrzymania proszku ekstraktu żeń-szenia.Przeciwciała (anty-Nrf2, anty-GST i β-aktyna), skoniugowana z peroksydazą chrzanową przeciwkrólicza immunoglobulina G (IgG), odczynnik do transfekcji, siRNA kontrolny i siRNA Nrf2 zakupiono od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornia). .), USA).
Komórki Caco2 i hEL hodowano na płytkach do hodowli komórkowych o powierzchni 100 mm2 z MEM zawierającym 10% FBS w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2.Aby określić wpływ warunków leczenia, komórki hEL inkubowano z różnymi stężeniami B(a)P i G-Rg3 w MEM przez 48 godzin.Komórki można dalej analizować lub zbierać w celu przygotowania ekstraktów wolnych od komórek.
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Doświadczalnej Zwierząt Tongji Medical College, Uniwersytetu Naukowo-Technologicznego w Huazhong (nr zatwierdzenia 2019; nr rejestracji 4587TH).Wszystkie doświadczenia przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami, a badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Ośmiotygodniowym myszom A/J najpierw wstrzyknięto dootrzewnowo B(a)P w roztworze trikapryny (100 mg/kg, 0,2 ml).Po tygodniu myszy losowo podzielono na grupy kontrolne i grupy poddane różnym zabiegom, po 15 myszy w każdej grupie, i karmiono je przez zgłębnik raz dziennie.Po 20 tygodniach leczenia zwierzęta uśmiercano przez uduszenie CO2.Pobrano płuca i utrwalono je na 24 godziny.Liczbę powierzchownych guzów i indywidualne rozmiary guzów określono ilościowo dla każdego płuca pod mikroskopem preparacyjnym.Oszacowania objętości guza (V) obliczono przy użyciu następującego wyrażenia: V (mm3) = 4/3πr3, gdzie r jest średnicą guza.Suma netto wszystkich objętości guza w płucach myszy reprezentowała całkowitą objętość guza, a średnia całkowita objętość guza w każdej grupie reprezentowała obciążenie nowotworem.Pobrano próbki krwi pełnej i jelit i przechowywano je w temperaturze -80°C w celu oznaczenia UPLC-MS/MS.Pobrano surowicę i zastosowano automatyczny analizator chemiczny do analizy poziomu aminotransferazy alaninowej (ALT) i kreatyniny (Cr) w surowicy w celu oceny czynności wątroby i nerek.
Zebrane próbki wyjęto z chłodni, rozmrożono, zważono i umieszczono w probówkach, jak opisano powyżej.Do tego dodano 0,5 µM floryzyny (wzorzec wewnętrzny) w 0,8 ml roztworu metanolu.Tkankę następnie homogenizowano za pomocą Tissue-Tearor, a homogenat następnie przenoszono do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.Mieszaninę wirowano przy 15500 obr/min przez 15 minut.Po usunięciu 1,0 ml supernatantu osuszyć azotem.Do odzysku wykorzystano dwieście mikrolitrów metanolu.Krew jest pobierana i przetwarzana w jednej linii i służy jako punkt odniesienia dla wszystkich pomiarów.
24-dołkowe płytki Transwell wysiano 1,0 x 105 komórek Caco-2 na dołek w celu oceny potencjalnego wzmocnienia transportu G-Rg3 przez dodatek werapamilu.Po 3 tygodniach hodowli komórki przemyto HBSS i wstępnie inkubowano w temperaturze 37°C.400 µl 10 µM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s lub mieszanina z 50 lub 100 µM werapamilu) wstrzyknięto na podstawno-boczną lub wierzchołkową stronę monowarstwy, a do drugiej dodano 600 µl roztworu HBSS strona.Zbierz 100 µl pożywki hodowlanej w wyznaczonych momentach (0, 15, 30, 45, 60, 90 i 120 minut) i dodaj 100 µl HBSS, aby uzupełnić tę objętość.Próbki przechowywano w -4°C do czasu wykrycia za pomocą UPLC-MS/MS.Wyrażenie Papp = dQ/(dT × A × C0) stosuje się do ilościowego określenia pozornej jednokierunkowej przepuszczalności wierzchołkowej i podstawno-bocznej i odwrotnie (odpowiednio Pa-b i Pb-a);dQ/dT to zmiana stężenia, A (0,6 cm2) to pole powierzchni monowarstwy, a C0 to początkowe stężenie dawcy.Współczynnik wypływu oblicza się jako Pb-a/Pa-b, co reprezentuje szybkość wypływu badanego leku.
Samce szczurów Wistar głodzono przez 24 godziny, pili tylko wodę i znieczulano dożylnym wstrzyknięciem 3,5% roztworu pentobarbitalu.Zaintubowana rurka silikonowa ma koniec dwunastnicy jako wejście i koniec jelita krętego jako wyjście.Za pomocą pompy perystaltycznej pompuj do wlotu 10 µM G-Rg3r lub G-Rg3s w izotonicznym HBSS z szybkością przepływu 0,1 ml/min.Wpływ werapamilu oceniano dodając 50 µM lub 100 µM związku do 10 µM G-Rg3r lub G-Rg3s.UPLC-MS/MS przeprowadzono na ekstraktach perfuzyjnych zebranych w punktach czasowych 60, 90, 120 i 150 minut po rozpoczęciu perfuzji.Procent absorpcji określa się ilościowo za pomocą wzoru % absorpcji = (1 – Cout/Cin) × 100%;stężenie G-Rg3 na wylocie i wlocie wyraża się odpowiednio jako Cout i Cin.
Komórki hEL wysiano na 96-dołkowe płytki przy gęstości 1 x 104 komórek na dołek i traktowano B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 µM) lub G-Rg3 rozpuszczonym w DMSO .Następnie leki rozcieńczano pożywką hodowlaną do różnych stężeń (0, 1, 2, 5, 10, 20 µM) w ciągu 48 godzin.Stosując dostępny na rynku zestaw testowy MTS, komórki poddano standardowemu protokołowi, a następnie zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek przy 490 nm.Poziom żywotności komórek w grupach leczonych jednocześnie B(a)P (10 µM) i G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 µM) oceniano zgodnie z powyższą metodą i porównywano z grupą nietraktowaną.
Komórki hEL wysiano na 6-studzienkowe płytki przy gęstości 1 x 105 komórek/studzienkę i traktowano 10 µMB(a)P w obecności lub przy braku 10 µM G-Rg3.Po 48 godzinach leczenia z komórek hEL wyekstrahowano DNA przy użyciu zestawu QIAamp DNA Mini Kit zgodnie z protokołem producenta.Tworzenie adduktów BPDE-DNA wykrywano przy użyciu zestawu ELISA dla adduktów BPDE-DNA.Względne poziomy adduktu BPDE-DNA mierzono za pomocą czytnika mikropłytek, mierząc absorbancję przy 450 nm.
Komórki hEL wysiano na 96-studzienkowe płytki przy gęstości 1 x 104 komórek na studzienkę i traktowano 10 µMB(a)P w nieobecności lub w obecności 10 µM G-Rg3 przez 48 godzin.Aktywność GST mierzono przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do oznaczania aktywności GST zgodnie z protokołem producenta.Względną aktywację GST mierzono poprzez absorbancję przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek.
Komórki hEL przemyto lodowatym PBS, a następnie poddano lizie przy użyciu buforu do testu radioimmunoprecypitacji zawierającego inhibitory proteaz i inhibitory fosfatazy.Po oznaczeniu ilościowym białka przy użyciu zestawu do oznaczania białka całkowitego, 30 µg białka w każdej próbce oddzielono za pomocą 12% SDS-PAGE i przeniesiono na membranę PVDF za pomocą elektroforezy.Błony blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem i inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4°C.Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową, dodano wzmocnione odczynniki chemiluminescencyjne w celu wizualizacji sygnału wiązania.Intensywność każdego prążka białka określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Do analizy wszystkich danych wyrażonych jako średnia ± odchylenie standardowe wykorzystano program GraphPad Prism 7.0.Zmienność pomiędzy grupami terapeutycznymi oceniano za pomocą testu t-Studenta lub jednoczynnikowej analizy wariancji, przy wartości P <0,05 wskazującej na istotność statystyczną.
Wszystkie dane uzyskane lub przeanalizowane podczas tego badania znajdują się w opublikowanym artykule i plikach informacji uzupełniających.
Torre, Los Angeles, Siegel, RL i Jemal, A. Statystyki dotyczące raka płuc.przysłówek.Wygasły.medycyna.biologia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Substancje rakotwórcze tytoniu, ich biomarkery i nowotwory wywołane tytoniem.Nat.Kapelan Rak.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH i Venitt, S. Addukty DNA i białka w tkankach ludzkich powstałe w wyniku narażenia na dym tytoniowy.międzynarodowość.J. Rak.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA i Yu M. Wpływ Houttuynia cordata i sylibininy na indukowaną benzo(a)pirenem nowotwór płuc u myszy A/J.Rak 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. i in.Naturalny produkt przeciwnowotworowy wyizolowany z chińskich materiałów leczniczych.szczęka.medycyna.6, 27 (2011).
Yang, Y. i in.Skuteczność polifenonu E, czerwonego żeń-szenia i rapamycyny na indukowaną benzo(a)pirenem nowotwór płuc u myszy A/J.Rak 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS i Yuan, KS Red, zaangażowanie w terapię raka.szczęka.J. Nutt.medycyna.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS i Gao, L. Ginsenozydy w korzeniach i liściach żeń-szenia amerykańskiego.J.Agrik.Chemia gastronomiczna.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA i Yuan KS Farmakologia żeń-szenia: wiele składników i wiele efektów.biochemia.farmakologia.58, 1685–1693 (1999).
Czas publikacji: 17 września 2023 r