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O ginseng vermelho tem sido usado na medicina tradicional asiática há centenas de anos.Neste estudo, avaliamos a capacidade de quatro tipos de ginseng vermelho (ginseng vermelho chinês, ginseng vermelho coreano A, ginseng vermelho coreano B e ginseng vermelho coreano C) cultivados em diferentes regiões para inibir a formação e o crescimento de pulmão induzido por carcinógeno. tumores.Um teste de benzo(a)pireno (B(a)P) foi realizado em camundongos A/J, e o ginseng vermelho coreano B foi considerado o mais eficaz na redução da carga tumoral entre as quatro variedades de ginseng vermelho.Além disso, analisamos o conteúdo de vários ginsenosídeos (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Rg5) em quatro extratos de ginseng vermelho e descobrimos que o ginseng vermelho coreano B tinha os níveis mais elevados de ginsenosídeo Rg3 (G-Rg3), sugerindo que G-Rg3 pode desempenhar um papel importante na sua eficácia terapêutica.Este trabalho mostra que o G-Rg3 tem biodisponibilidade relativamente baixa.No entanto, quando G-Rg3 foi coadministrado com o inibidor da gp-P verapamil, o efluxo de G-Rg3 nas células Caco-2 diminuiu, a taxa de absorção intestinal de G-Rg3 aumentou em um modelo de rato e G-Rg3 foi aumentado.Nas células Caco-2, o fluxo de saída de Rg3 diminui e o nível de concentração de Rg3 diminui.G-Rg3 está aumentado no intestino e no plasma, e sua capacidade de prevenir tumores também é aumentada em um modelo de tumorigênese induzida por B(a)P em ratos.Descobrimos também que G-Rg3 reduziu a citotoxicidade induzida por B(a)P e a formação de adutos de DNA em células pulmonares humanas, e restaurou a expressão e atividade de enzimas de fase II através da via Nrf2, o que pode estar relacionado ao potencial mecanismo de ação da inibição de G -Rg3..Sobre a ocorrência de tumores pulmonares.Nosso estudo demonstra um papel potencialmente importante para o G-Rg3 no direcionamento de tumores pulmonares em modelos de camundongos.A biodisponibilidade oral deste ginsenosídeo é aumentada pelo direcionamento da glicoproteína P, permitindo que a molécula exerça efeitos anticancerígenos.
O tipo mais comum de câncer de pulmão é o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), que é uma das principais causas de mortes por câncer na China e na América do Norte1,2.O principal fator que aumenta o risco de desenvolver câncer de pulmão de células não pequenas é o tabagismo.A fumaça do cigarro contém mais de 60 substâncias cancerígenas, incluindo benzo(a)pireno (B(a)P), nitrosaminas e isótopos radioativos da decomposição do radônio.3 Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos B(a)P são a principal causa de toxicidade no cigarro. fumaça.Após exposição ao B(a)P, o citocromo P450 o converte em B(a)P-7,8-diidrodiol-9,10-epóxido (BPDE), que reage com o DNA para formar o aduto 4 de BPDE-DNA. adutos induzem tumorigênese pulmonar em camundongos com estágio tumoral e histopatologia semelhante aos tumores pulmonares humanos5.Esta característica torna o modelo de câncer de pulmão induzido por B(a)P um sistema adequado para avaliar compostos com possíveis propriedades anticancerígenas.
Uma possível estratégia para prevenir o desenvolvimento de cancro do pulmão em grupos de alto risco, especialmente fumadores, é a utilização de agentes quimiopreventivos para suprimir o desenvolvimento de lesões neoplásicas intraepiteliais e, assim, prevenir a sua subsequente progressão para malignidade.Estudos em animais mostram que vários agentes quimiopreventivos são eficazes6.O nosso relatório anterior7 destacou os bons efeitos preventivos do ginseng vermelho no cancro do pulmão.Esta erva tem sido usada há séculos na medicina tradicional asiática para prolongar a vida e a saúde, e foi documentado que tem efeitos antitumorais8.
O fator ativo do ginseng é o ginsenoside, que é usado como marcador composto para avaliar a qualidade dos extratos de ginseng.A análise quantitativa de extratos brutos de ginseng normalmente envolve o uso de vários ginsenosídeos, incluindo RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 e Rc9,10.Os ginsenosídeos têm pouca utilização clínica devido à sua muito baixa biodisponibilidade oral11.Embora o mecanismo para esta fraca biodisponibilidade não seja claro, o efluxo de ginsenosídeos causado pela glicoproteína P (P-gp)12 pode ser a causa.A P-gp é um dos transportadores de efluxo mais importantes da superfamília dos transportadores de cassetes de ligação ao ATP, que utiliza a energia da hidrólise do ATP para liberar substâncias intracelulares no ambiente externo.Os transportadores da P-gp são normalmente amplamente distribuídos no intestino, rim, fígado e barreira hematoencefálica13.A P-gp desempenha um papel crítico na absorção intestinal, e a inibição da P-gp aumenta a absorção oral e a disponibilidade de alguns medicamentos anticâncer12,14.Exemplos de inibidores previamente utilizados na literatura são verapamil e ciclosporina A15.Este trabalho envolve o estabelecimento de um sistema de camundongos para estudar o câncer de pulmão induzido por B (a) P para avaliar a capacidade de diferentes extratos de ginseng vermelho da China e da Coréia de afetar malignidades.Os extratos foram analisados individualmente para identificar ginsenosídeos específicos que podem afetar a carcinogênese.O verapamil foi então usado para atingir a P-gp e melhorar a biodisponibilidade oral e a eficácia terapêutica dos ginsenosídeos que combatem o câncer.
O mecanismo pelo qual as saponinas do ginseng exercem efeitos terapêuticos na carcinogênese permanece obscuro.A pesquisa mostrou que vários ginsenosídeos podem reduzir os danos ao DNA causados por agentes cancerígenos, reduzindo o estresse oxidativo e ativando enzimas de desintoxicação de fase II, evitando assim danos celulares.A glutationa S-transferase (GST) é uma enzima típica de fase II necessária para reduzir os danos ao DNA causados por agentes cancerígenos17.O fator 2 relacionado ao eritróide nuclear 2 (Nrf2) é um importante fator de transcrição que regula a homeostase redox e ativa a expressão de enzimas de fase II e respostas antioxidantes citoprotetoras .Nosso estudo também examinou os efeitos dos ginsenosídeos identificados na redução da citotoxicidade induzida por B (a) P e na formação de adutos de BPDE-DNA, bem como na indução de enzimas de fase II através da modulação da via Nrf2 em células pulmonares normais.
O estabelecimento de um modelo de câncer induzido por B (a) P em camundongos é consistente com trabalhos anteriores .A Figura 1A mostra o projeto experimental de um tratamento de 20 semanas de um modelo de câncer de camundongo induzido por B(a)P, água (controle), extrato de ginseng vermelho chinês (CRG), extrato de ginseng vermelho coreano A (KRGA) e extrato de ginseng vermelho coreano A (KRGA) e extrato de ginseng vermelho coreano ginseng.Extrato B (KRGB) e Extrato C de Ginseng Vermelho Coreano (KRGC).Após 20 semanas de tratamento com ginseng vermelho, os ratos foram sacrificados por asfixia com CO2.A Figura 1B mostra tumores pulmonares macroscópicos em animais tratados com diferentes tipos de ginseng vermelho, e a Figura 1C mostra uma micrografia representativa de uma amostra de tumor.A carga tumoral dos animais tratados com KRGB (1,5 ± 0,35) foi menor que a dos animais controle (0,82 ± 0,2, P <0,05), como mostrado na Figura 1D.O grau médio de inibição da carga tumoral foi de 45%.Outros extratos de ginseng vermelho testados não mostraram alterações tão significativas na carga tumoral (P > 0,05).Nenhum efeito colateral óbvio foi observado no modelo de camundongo durante 20 semanas de tratamento com ginseng vermelho, incluindo nenhuma alteração no peso corporal (dados não mostrados) e nenhuma toxicidade hepática ou renal (Figura 1E,F).
Extrato de ginseng vermelho trata o desenvolvimento de tumores pulmonares em camundongos A/J.(A) Desenho experimental.(B) Grandes tumores pulmonares em modelo de camundongo.Os tumores estão indicados por setas.a: Grupo de ginseng vermelho chinês.b: grupo A de ginseng vermelho coreano.c: Grupo de ginseng vermelho coreano B. d: Grupo de ginseng vermelho coreano C. d: Grupo de controle.(C) Micrografia óptica mostrando um tumor pulmonar.Ampliação: 100. b: 400. (D) Carga tumoral no grupo extrato de ginseng vermelho.(E) Níveis plasmáticos da enzima hepática ALT.(F) Níveis plasmáticos da enzima renal Cr.Os dados são expressos como média ± desvio padrão.*P<0,05.
Os extratos de ginseng vermelho identificados neste estudo foram analisados por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC-MS/MS) para quantificar os seguintes ginsenosídeos: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 e Rg5.As condições UPLC e MS utilizadas para medir os analitos foram descritas em relatório anterior .Cromatogramas UPLC-MS/MS de quatro extratos de ginseng vermelho são mostrados na Figura 2A.Houve diferenças significativas no conteúdo total de ginsenosídeo, com o maior teor total de ginsenosídeo no CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figura 2B).Ao avaliar ginsenosídeos individuais (Figura 2C), o KRGB apresentou o nível mais alto de G-Rg3 em comparação com outros ginsenosídeos (58,33 ± 3,81 μmol/L para G-Rg3s e 41,56 ± 2,88 μmol/L para G -Rg3r).L).tipo ginseng vermelho (P < 0,001).G-Rg3 ocorre como um par de estereoisômeros G-Rg3r e G-Rg3s, que diferem na posição do grupo hidroxila no carbono 20 (Fig. 2D).Os resultados indicam que G-Rg3r ou G-Rg3 podem ter um importante potencial anticâncer em um modelo de camundongo com câncer induzido por B (a) P.
Conteúdo de ginsenosídeos em vários extratos de ginseng vermelho.(A) Cromatogramas UPLC-MS/MS de quatro extratos de ginseng vermelho.(B) Estimativa do conteúdo total de ginsenosídeo nos extratos indicados.(C) Detecção de ginsenosídeos individuais em extratos rotulados.(D) Estruturas dos estereoisômeros de ginsenosídeo G-Rg3r e G-Rg3s.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicado.***P<0,001.
O estudo UPLC-MS/MS exigiu a quantificação de ginsenosídeos em amostras intestinais e de sangue após 20 semanas de tratamento.O tratamento com KRGB mostrou a presença de apenas 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 no sangue.Não foram detectados ginsenosídeos restantes, indicando baixa biodisponibilidade oral e, portanto, redução da exposição a esses ginsenosídeos.
A linha celular de adenocarcinoma do cólon Caco-2 é morfológica e bioquimicamente semelhante às células epiteliais intestinais humanas, demonstrando a sua utilidade na avaliação do transporte de enterócitos através da barreira epitelial intestinal.Esta análise foi baseada em estudo anterior 20 .As Figuras 3A,B,C,D,E,F mostram imagens representativas do transporte transcelular de G-Rg3r e G-Rg3 usando um modelo de monocamada Caco-2.O transporte transcelular de G-Rg3r ou G-Rg3 através das monocamadas Caco-2 do lado basolateral para o apical (Pb-a) foi significativamente maior do que do lado apical para o basolateral (Pa-b).Para G-Rg3r, o valor médio de Pa-b foi de 0,38 ± 0,06, que aumentou para 0,73 ± 0,06 após tratamento com 50 μmol/L de verapamil e para 1,14 ± 0,09 após tratamento com 100 μmol/L de verapamil (p < 0,01 e 0,001, respectivamente; Figura 2).3A).As observações para G-Rg3 seguiram um padrão semelhante (Fig. 3B), e os resultados mostraram que o tratamento com verapamil melhorou o transporte de G-Rg3r e G-Rg3.O tratamento com verapamil também resultou em uma diminuição significativa nas taxas médias de efluxo de Pb-a e G-Rg3r e G-Rg3s (Figura 3C,D,E,F), indicando que o tratamento com verapamil reduz o conteúdo de ginsenosídeo nas células de efluxo Caco-2..
Transporte transcelular de G-Rg3 em monocamadas Caco-2 e absorção intestinal em ensaio de perfusão em ratos.(A) Valor Pa-b do grupo G-Rg3r na monocamada Caco-2.(B) Valor Pa-b dos grupos G-Rg3s na monocamada Caco-2.(C) Valor Pb do grupo G-Rg3r na monocamada Caco-2.(D) Valor Pb dos grupos G-Rg3s na monocamada Caco-2.(E) Razão de rendimento de grupos G-Rg3r em uma monocamada Caco-2.(F) Razão de rendimento de grupos G-Rg3 em uma monocamada Caco-2.(G) Porcentagem de absorção intestinal de G-Rg3r em ensaio de perfusão em ratos.(H) Porcentagem de absorção intestinal de G-Rg3 em ensaio de perfusão em ratos.A permeabilidade e a absorção foram comparadas sem a adição de verapamil.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de cinco experimentos independentes.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Consistente com trabalhos anteriores20, foi realizada perfusão intestinal ortotópica de ratos para determinar se a absorção de G-Rg3 no intestino aumenta após o tratamento com verapamil.As Figuras 3G,H mostram ensaios de perfusão representativos para avaliar a percentagem de absorção intestinal de G-Rg3r e G-Rg3 em ratos modelo de cancro durante os períodos de tempo acima.A porcentagem inicial de captação fraca de G-Rg3r de aproximadamente 10% aumentou para mais de 20% após o tratamento com 50 μM de verapamil e para mais de 25% após o tratamento com 100 μM de verapamil.Da mesma forma, G-Rg3, que teve uma captação inicial de 10%, também apresentou um pico de mais de 20% após o tratamento com 50 μM de verapamil e quase 30% após o tratamento com 100 μM de verapamil, sugerindo que a inibição da P-gp pelo verapamil aumenta absorção intestinal de G Rg3 em um modelo de câncer de pulmão em camundongos.
De acordo com o método acima, camundongos modelo de câncer induzido por B(a)P foram divididos aleatoriamente em seis grupos, como mostrado na Figura 4A.Nenhuma perda de peso significativa ou sinais clínicos de toxicidade foram observados no grupo de tratamento G-Rg3 em comparação com o grupo controle (dados não mostrados).Após 20 semanas de tratamento, os pulmões de cada rato foram recolhidos.A Figura 4B mostra tumores pulmonares macroscópicos em camundongos nos grupos de tratamento acima, e a Figura 4C mostra uma micrografia óptica representativa de um tumor representativo.Em relação à carga tumoral em cada grupo (Fig. 4D), os valores para camundongos tratados com G-Rg3r e G-Rg3s foram 0,75 ± 0,29 mm3 e 0,81 ± 0,30 mm3, respectivamente, enquanto os valores para camundongos G tratados com -Rg3s foram 1,63 respectivamente ±0,40 mm3.camundongos controle (p <0,001), indicando que o tratamento com G-Rg3 reduziu a carga tumoral em camundongos.A administração de verapamil melhorou ainda mais essa redução: os valores em camundongos verapamil+ G-Rg3r diminuíram de 0,75 ± 0,29 mm3 para 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), e os valores para verapamil+ de 0,81 ± 0,30 mm3 diminuíram para 0,29 ± 0,21 mm3 em camundongos tratados com G. -Rg3s (p <0,05), indicando que o verapamil pode aumentar o efeito inibitório do G-Rg3 na tumorigênese.A carga tumoral não mostrou diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo verapamil, o grupo G-Rg3r e o grupo G-Rg3s, e o grupo verapamil+G-Rg3r e o grupo verapamil+G-Rg3s.Além disso, não houve toxicidade hepática ou renal significativa associada aos tratamentos avaliados (Figura 4E,F).
Carga tumoral após tratamento com G-Rg3 e níveis plasmáticos ou intestinais de G-Rg3r e G-Rg3 nos grupos indicados.(A) Desenho experimental.(B) Tumores macroscópicos em modelo de camundongo.Os tumores estão indicados por setas.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r em combinação com verapamil.d: G-Rg3 em combinação com verapamil.d: Verapamil.e: controle.(C) Micrografia óptica do tumor em ampliação.Resposta: 100x.b: 400X.(D) Efeito do tratamento com G-Rg3 + verapamil na carga tumoral em camundongos A/J.(E) Níveis plasmáticos da enzima hepática ALT.(F) Níveis plasmáticos da enzima renal Cr.(G) Níveis plasmáticos de G-Rg3r ou G-Rg3 dos grupos indicados.(H) Níveis de G-Rg3r ou G-Rg3s nos intestinos dos grupos indicados.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Os níveis de G-Rg3 nos camundongos modelo de câncer induzido por B(a)P foram avaliados por UPLC-MS/MS após um período de tratamento de 20 semanas de acordo com o método descrito na seção Métodos.As Figuras 4G e H mostram os níveis plasmáticos e intestinais de G-Rg3, respectivamente.Os níveis plasmáticos de G-Rg3r foram de 0,44 ± 0,32 μmol/L e aumentaram para 1,17 ± 0,47 μmol/L com a administração concomitante de verapamil (p < 0,001), enquanto os níveis intestinais de G-Rg3r foram de 0,53 ± 0,08 μg/l.Quando combinado com verapamil, g aumentou para 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Para G-Rg3, os resultados seguiram um padrão semelhante, indicando que o tratamento com verapamil aumentou a biodisponibilidade oral de G-Rg3 em camundongos A/J.
O ensaio de viabilidade celular foi utilizado para avaliar a citotoxicidade de B(a)P e G-Rg3 em células hEL.A citotoxicidade induzida por B(a)P em células hEL é mostrada na Figura 5A, enquanto as propriedades não tóxicas de G-Rg3r e G-Rg3 são mostradas nas Figuras 5A e 5B.5B, C. Para avaliar o efeito citoprotetor de G-Rg3, B(a)P foi coadministrado com várias concentrações de G-Rg3r ou G-Rg3 em células hEL.Como mostrado na Figura 5D, G-Rg3r em concentrações de 5 μM, 10 μM e 20 μM restaurou a viabilidade celular para 58,3%, 79,3% e 77,3%, respectivamente.Resultados semelhantes também podem ser observados no grupo G-Rg3s.Quando as concentrações de G-Rg3s foram de 5 µM, 10 µM e 20 µM, a viabilidade celular foi restaurada para 58,3%, 72,7% e 76,7%, respectivamente (Figura 5E).).A presença de adutos BPDE-DNA foi medida utilizando um kit ELISA.Nossos resultados mostraram que os níveis de aduto de BPDE-DNA foram aumentados no grupo tratado com B(a)P em comparação com o grupo controle, mas em comparação com o co-tratamento com G-Rg3, os níveis de aduto de BPDE-DNA no grupo B(a)P B no grupo tratado, os níveis de aduto de DNA foram significativamente reduzidos.Os resultados do tratamento apenas com B(a)P são mostrados na Figura 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 para G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 para G -Rg3s, p < 0,001).
Viabilidade celular e formação de aduto BPDE-DNA em células hEL tratadas com G-Rg3 e B(a)P.(A) Viabilidade de células hEL tratadas com B(a)P.(B) Viabilidade de células hEL tratadas com G-Rg3r.(C) Viabilidade de células hEL tratadas com G-Rg3.(D) Viabilidade de células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3r.(E) Viabilidade de células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3.(F) Níveis de aduto BPDE-DNA em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
A expressão da enzima GST foi detectada após co-tratamento com 10 μM de B (a) P e 10 μM de G-Rg3r ou G-Rg3s.Nossos resultados mostraram que B(a)P suprimiu a expressão de GST (59,7 ± 8,2% no grupo G-Rg3r e 39 ± 4,5% no grupo G-Rg3s), e B(a)P foi associado com G-Rg3r , ou com G-Rg3r, ou com G-Rg3r.O co-tratamento com G-Rg3s restaurou a expressão de GST.Expressão de GST (103,7 ± 15,5% no grupo G-Rg3r e 110 ± 11,1% no grupo G-Rg3s, p < 0,05 e p < 0,001, respectivamente, Figura 6A, B e C).A atividade de GST foi avaliada utilizando um kit de ensaio de atividade.Nossos resultados mostraram que o grupo de tratamento combinado teve maior atividade de GST em comparação com o grupo apenas B(a)P (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% no grupo G-Rg3r vs. 92,3 ± 6,5 no grupo G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% no grupo G-Rg3s, p < 0,001, Figura 6D).
Expressão de GST e Nrf2 em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3.(A) Detecção da expressão de GST por Western blotting.(B) Expressão quantitativa de GST em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3r.(C) Expressão quantitativa de GST em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3s.(D) Atividade de GST em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3.(E) Detecção da expressão de Nrf2 por Western blotting.(F) Expressão quantitativa de Nrf2 em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3r.(G) Expressão quantitativa de Nrf2 em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3s.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Para elucidar as vias envolvidas na supressão da tumorigênese induzida por B (a) P mediada por G-Rg3, a expressão de Nrf2 foi avaliada por Western blotting.Como mostrado nas Figuras 6E,F,G, em comparação com o grupo controle, apenas o nível de Nrf2 no grupo de tratamento B(a)P diminuiu;no entanto, em comparação com o grupo de tratamento B(a)P, os níveis de B(a) Nrf2 no grupo PG-Rg3 aumentaram (106 ± 9,5% para G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% para G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% para G-Rg3s, p < 0,01).
Confirmamos o papel preventivo do Nrf2 suprimindo a expressão do Nrf2 usando pequeno RNA interferente específico (siRNA).O knockdown de Nrf2 foi confirmado por Western blotting (Fig. 7A, B).Como mostrado nas Figuras 7C,D, o co-tratamento de células hEL com B(a)P e G-Rg3 resultou em uma diminuição no número de adutos BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) em comparação ao tratamento com B(a)P sozinho no grupo de siRNA de controle.) G-Rg3r foi 4,13 ± 0,49, G-Rg3s foi 1,8 ± 0,32 e 4,1 ± 0,57, p < 0,01).No entanto, o efeito inibitório do G-Rg3 na formação de BPDE-DNA foi abolido pelo knockdown de Nrf2.No grupo siNrf2, não houve diferença significativa na formação de adutos BPDE-DNA entre o co-tratamento B(a)P e G-Rg3 e o tratamento B(a)P sozinho (3,0 ± 0,21 para G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).para G-Rg3r versus 3,6 para G-Rg3s versus ±0,45 versus 4,0±0,37, p > 0,05).
Efeito do knockdown de Nrf2 na formação de adutos BPDE-DNA em células hEL.(A) O knockdown do Nrf2 foi confirmado por Western blotting.(B) Quantificação da intensidade da banda Nrf2.(C) Efeito do knockdown de Nrf2 nos níveis de aduto BPDE-DNA em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3r.(D) Efeito do knockdown de Nrf2 nos níveis de aduto BPDE-DNA em células hEL tratadas com B(a)P e G-Rg3.Os dados são expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicado.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Este estudo avaliou os efeitos preventivos de vários extratos de ginseng vermelho em um modelo de camundongo com câncer de pulmão induzido por B(a)P, e o tratamento com KRGB reduziu significativamente a carga tumoral.Considerando que G-Rg3 possui o maior teor neste extrato de ginseng, o importante papel deste ginsenosídeo na inibição da tumorigênese tem sido estudado.Tanto G-Rg3r como G-Rg3 (dois epímeros de G-Rg3) reduziram significativamente a carga tumoral num modelo de ratinho de cancro induzido por B(a)P.G-Rg3r e G-Rg3 exercem efeitos anticancerígenos induzindo a apoptose de células tumorais21, inibindo o crescimento tumoral22, interrompendo o ciclo celular23 e afetando a angiogênese24.Também foi demonstrado que o G-Rg3 inibe a metástase celular25, e a capacidade do G-Rg3 de aumentar os efeitos da quimioterapia e da radioterapia foi documentada26,27.Poon et al demonstraram que o tratamento com G-Rg3 poderia reduzir os efeitos genotóxicos do B(a)P28.Este estudo demonstra o potencial terapêutico do G-Rg3 no direcionamento de moléculas carcinogênicas ambientais e na prevenção do câncer.
Apesar do seu bom potencial profilático, a fraca biodisponibilidade oral dos ginsenosídeos representa um desafio para o uso clínico destas moléculas.A análise farmacocinética da administração oral de ginsenosídeos em ratos mostrou que sua biodisponibilidade ainda é inferior a 5%29.Estes testes mostraram que após o período de tratamento de 20 semanas, apenas os níveis sanguíneos de Rg5 diminuíram.Embora o mecanismo subjacente da baixa biodisponibilidade ainda não esteja elucidado, acredita-se que a P-gp esteja envolvida no efluxo de ginsenosídeos.Este trabalho demonstrou pela primeira vez que a administração de verapamil, um bloqueador da P-gp, aumenta a biodisponibilidade oral de G-Rg3r e G-Rg3s.Assim, este achado sugere que G-Rg3r e G-Rg3s atuam como substratos da P-gp para regular seu efluxo.
Este trabalho demonstra que o tratamento combinado com verapamil aumenta a biodisponibilidade oral de G-Rg3 em um modelo de câncer de pulmão em camundongos.Esta descoberta é apoiada pelo aumento do transporte transcelular intestinal de G-Rg3 após o bloqueio da P-gp, aumentando assim a sua absorção.Ensaios em células Caco2 mostraram que o tratamento com verapamil reduziu o efluxo de G-Rg3r e G-Rg3s enquanto melhorava a permeabilidade da membrana.Um estudo de Yang et al.Estudos demonstraram que o tratamento com ciclosporina A (outro bloqueador da gp-P) aumenta a biodisponibilidade do ginsenosídeo Rh2 de um valor basal de 1%20 para mais de 30%.Os compostos ginsenosídeos K e Rg1 também apresentaram resultados semelhantes30,31.Quando verapamil e ciclosporina A foram coadministrados, o efluxo do composto K nas células Caco-2 foi significativamente reduzido de 26,6 para menos de 3, enquanto seus níveis intracelulares aumentaram 40 vezes30.Na presença de verapamil, os níveis de Rg1 aumentaram nas células epiteliais do pulmão de ratos, sugerindo um papel da P-gp no efluxo de ginsenosídeo, como mostrado por Meng et al.31.Contudo, o verapamil não teve o mesmo efeito no efluxo de alguns ginsenosídeos (como Rg1, F1, Rh1 e Re), indicando que eles não são afetados por substratos da P-gp, como mostrado por Liang et al.32.Esta observação pode estar relacionada ao envolvimento de outros transportadores e estruturas alternativas de ginsenosídeos.
O mecanismo do efeito preventivo do G-Rg3 no câncer não é claro.Estudos anteriores demonstraram que o G-Rg3 previne danos no DNA e a apoptose, reduzindo o estresse oxidativo e a inflamação, que pode ser o mecanismo subjacente para a prevenção da tumorigênese induzida por B (a) P.Alguns relatos indicam que a genotoxicidade induzida por B(a)P pode ser reduzida pela modulação de enzimas de fase II para formar BPDE-DNA34.GST é uma enzima típica de fase II que inibe a formação de adutos BPDE-DNA, promovendo a ligação de GSH ao BPDE, reduzindo assim os danos ao DNA induzidos por B(a)P35.Nossos resultados mostram que o tratamento com G-Rg3 reduz a citotoxicidade induzida por B (a) P e a formação de adutos de BPDE-DNA em células hEL e restaura a expressão e atividade de GST in vitro.No entanto, estes efeitos estavam ausentes na ausência de Nrf2, sugerindo que G-Rg3 induz efeitos citoprotetores através da via Nrf2.Nrf2 é um importante fator de transcrição para enzimas de desintoxicação de fase II que promove a depuração de xenobióticos36.A ativação da via Nrf2 induz citoproteção e reduz o dano tecidual37.Além disso, vários relatos apoiaram o papel do Nrf2 como supressor tumoral na carcinogênese38.Nosso estudo mostra que a indução da via Nrf2 por G-Rg3 desempenha um importante papel regulatório na genotoxicidade induzida por B (a) P, causando a desintoxicação de B (a) P pela ativação de enzimas de fase II, inibindo assim o processo de tumorigênese.
Nosso trabalho revela o potencial do ginseng vermelho na prevenção do câncer de pulmão induzido por B(a)P em camundongos através do importante envolvimento do ginsenosídeo G-Rg3.A fraca biodisponibilidade oral desta molécula dificulta a sua aplicação clínica.No entanto, este estudo mostra pela primeira vez que o G-Rg3 é um substrato da P-gp, e a administração de um inibidor da P-gp aumenta a biodisponibilidade do G-Rg3 in vitro e in vivo.G-Rg3 reduz a citotoxicidade induzida por B(a)P regulando a via Nrf2, o que pode ser um mecanismo potencial para sua função preventiva.Nosso estudo confirma o potencial do ginsenosídeo G-Rg3 para a prevenção e tratamento do câncer de pulmão.
Camundongos A/J fêmeas com seis semanas de idade (20 ± 1 g) e ratos Wistar machos com 7 semanas de idade (250 ± 20 g) foram obtidos do Laboratório Jackson (Bar Harbor, EUA) e do Instituto de Zoologia de Wuhan.Universidade (Wuhan, China).O Centro Chinês de Coleta de Culturas Tipo (Wuhan, China) nos forneceu células Caco-2 e hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA) é uma fonte de B(a)P e tricaprina.Ginsenosídeos purificados G-Rg3r e G-Rg3s, dimetilsulfóxido (DMSO), kit de ensaio de proliferação CellTiter-96 (MTS), verapamil, meio essencial mínimo (MEM) e soro bovino fetal (FBS) foram adquiridos da Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, China).O mini kit QIAamp DNA e o kit BPDE-DNA ELISA foram adquiridos da Qiagen (Stanford, CA, EUA) e Cell Biolabs (San Diego, CA, EUA).O kit de ensaio de atividade GST e o kit de ensaio de proteína total (método BCA padrão) foram adquiridos da Solarbio (Pequim, China).Todos os extratos de ginseng vermelho são armazenados no Laboratório Mingyu 7. A Universidade Batista de Hong Kong (Hong Kong, China) e o Korea Cancer Center (Seul, Coreia) são fontes comerciais de extrato de CRG e vários extratos de ginseng vermelho de várias origens coreanas (incluindo KRGA, KRGB e KRGC).O ginseng vermelho é feito a partir das raízes do ginseng fresco de 6 anos de idade.O extrato de ginseng vermelho é obtido lavando o ginseng com água três vezes, depois concentrando o extrato aquoso e, finalmente, secando em baixa temperatura para obter o extrato de ginseng em pó.Anticorpos (anti-Nrf2, anti-GST e β-actina), imunoglobulina G anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (IgG), reagente de transfecção, siRNA de controle e siRNA Nrf2 foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), EUA).
As células Caco2 e hEL foram cultivadas em placas de cultura celular de 100 mm2 com MEM contendo 10% de FBS a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2.Para determinar o efeito das condições de tratamento, as células hEL foram incubadas com diferentes concentrações de B(a)P e G-Rg3 em MEM durante 48 h.As células podem ser posteriormente analisadas ou coletadas para preparar extratos livres de células.
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais da Tongji Medical College, Universidade Huazhong de Ciência e Tecnologia (Aprovação No. 2019; Registro No. 4587TH).Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes, e o estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes da Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Camundongos A/J com oito semanas de idade foram primeiro injetados intraperitonealmente com B(a)P em solução de tricaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Após uma semana, os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos de controle e diferentes grupos de tratamento, 15 camundongos em cada grupo, e submetidos à gavagem uma vez ao dia.Após 20 semanas de tratamento, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2.Os pulmões foram coletados e fixados por 24 horas.O número de tumores superficiais e os tamanhos individuais dos tumores foram quantificados para cada pulmão sob um microscópio de dissecação.As estimativas do volume tumoral (V) foram calculadas utilizando a seguinte expressão: V (mm3) = 4/3πr3, onde r é o diâmetro do tumor.A soma líquida de todos os volumes tumorais nos pulmões dos camundongos representou o volume total do tumor, e o volume total médio do tumor em cada grupo representou a carga tumoral.Amostras de sangue total e intestinal foram coletadas e armazenadas a -80°C para determinação UPLC-MS/MS.O soro foi coletado e um analisador químico automatizado foi utilizado para analisar os níveis de alanina aminotransferase (ALT) e creatinina sérica (Cr) para avaliar a função hepática e renal.
As amostras coletadas foram retiradas do armazenamento refrigerado, descongeladas, pesadas e colocadas em tubos conforme descrito acima.A isto foi adicionado florizina 0,5 μM (padrão interno) em 0,8 ml de solução de metanol.O tecido foi então homogeneizado usando Tissue-Tearor e o homogeneizado foi posteriormente transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.A mistura foi centrifugada a 15.500 rpm durante 15 minutos.Após remoção de 1,0 ml de sobrenadante, secar com nitrogênio.Duzentos microlitros de metanol foram utilizados para recuperação.O sangue é coletado e processado em uma linha e é usado como referência para todas as medições.
Placas Transwell de 24 poços foram semeadas com 1,0 x 105 células Caco-2 por poço para avaliar o potencial aumento do transporte de G-Rg3 pela adição de verapamil.Após 3 semanas de cultura, as células foram lavadas com HBSS e pré-incubadas a 37°C.400 μL de 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s ou uma mistura com 50 ou 100 μM de verapamil) foram injetados no lado basolateral ou apical da monocamada, e 600 μL de solução de HBSS foram adicionados ao outro. lado.Coletar 100 µl de meio de cultura nos tempos designados (0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos) e adicionar 100 µl de HBSS para completar este volume.As amostras foram armazenadas a -4 °C até detecção por UPLC-MS/MS.A expressão Papp = dQ/(dT × A × C0) é usada para quantificar a aparente permeabilidade apical e basolateral unidirecional e vice-versa (Pa-b e Pb-a, respectivamente);dQ/dT é a mudança na concentração, A (0,6 cm2) é a área superficial da monocamada e C0 é a concentração inicial do doador.A razão de efluxo é calculada como Pb-a/Pa-b, que representa a taxa de efluxo do medicamento em estudo.
Ratos Wistar machos foram submetidos a jejum de 24 horas, beberam apenas água e foram anestesiados com injeção intravenosa de solução de pentobarbital a 3,5%.O tubo de silicone intubado tem a extremidade do duodeno como entrada e a extremidade do íleo como saída.Use uma bomba peristáltica para bombear a entrada com 10 μM G-Rg3r ou G-Rg3s em HBSS isotônico a uma vazão de 0,1 ml/min.O efeito do verapamil foi avaliado pela adição de 50 μM ou 100 μM do composto a 10 μM de G-Rg3r ou G-Rg3s.UPLC-MS/MS foi realizado em extratos de perfusão coletados nos momentos 60, 90, 120 e 150 minutos após o início da perfusão.A porcentagem de absorção é quantificada pela fórmula % absorção = (1 – Cout/Cin) × 100%;a concentração de G-Rg3 na saída e na entrada é expressa por Cout e Cin, respectivamente.
Células hEL foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 104 células por poço e tratadas com B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ou G-Rg3 dissolvido em DMSO .Os medicamentos foram então diluídos com meio de cultura em várias concentrações (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) durante 48 horas.Utilizando um kit de ensaio MTS disponível comercialmente, as células foram submetidas a um protocolo padrão e depois medidas utilizando um leitor de microplacas a 490 nm.O nível de viabilidade celular dos grupos co-tratados com B(a)P (10 μM) e G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) foi avaliado de acordo com o método acima e comparado com o grupo não tratado.
As células hEL foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 105 células/poço e tratadas com 10 μMB (a) P na presença ou ausência de 10 μM G-Rg3.Após 48 horas de tratamento, o DNA foi extraído das células hEL utilizando o QIAamp DNA Mini Kit de acordo com o protocolo do fabricante.A formação de aductos BPDE-DNA foi detectada utilizando um kit ELISA de aducto BPDE-DNA.Os níveis relativos de aduto BPDE-DNA foram medidos utilizando um leitor de microplacas medindo a absorvância a 450 nm.
Células hEL foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 104 células por poço e tratadas com 10 μMB (a) P na ausência ou presença de 10 μM G-Rg3 por 48 h.A atividade de GST foi medida utilizando um kit comercial de ensaio de atividade de GST de acordo com o protocolo do fabricante.A activação relativa de GST foi medida por absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
As células hEL foram lavadas com PBS gelado e depois lisadas utilizando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação contendo inibidores de protease e inibidores de fosfatase.Após a quantificação da proteína utilizando um kit de ensaio de proteína total, 30 μg de proteína em cada amostra foram separados por SDS-PAGE a 12% e transferidos para uma membrana de PVDF por eletroforese.As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4°C.Após incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, foram adicionados reagentes de quimiluminescência melhorados para visualizar o sinal de ligação.A intensidade de cada banda proteica foi quantificada utilizando o software ImageJ.
O software GraphPad Prism 7.0 foi utilizado para analisar todos os dados, expressos como média ± desvio padrão.A variação entre os grupos de tratamento foi avaliada usando o teste t de Student ou análise de variância unidirecional, com um valor P <0,05 indicando significância estatística.
Todos os dados obtidos ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e em arquivos de informações suplementares.
Torre, LA, Siegel, RL e Jemal, A. Estatísticas de câncer de pulmão.advérbio.Expirado.medicamento.biologia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Carcinógenos do tabaco, seus biomarcadores e câncer induzido pelo tabaco.Nat.Capelão do Câncer.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH e Venitt, S. DNA e adutos de proteínas em tecidos humanos resultantes da exposição à fumaça do tabaco.internacionalidade.J. Câncer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA e Yu M. Efeito de Houttuynia cordata e silibinina na tumorigênese pulmonar induzida por benzo (a) pireno em camundongos A/J.Câncer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Produto natural anticancerígeno isolado de materiais medicinais chineses.mandíbula.medicamento.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Eficácia do polifenon E, ginseng vermelho e rapamicina na tumorigênese pulmonar induzida por benzo (a) pireno em camundongos A/J.Câncer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS e Yuan, KS Red, envolvimento na terapia do câncer.mandíbula.J. Nutt.medicamento.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS e Gao, L. Ginsenosides nas raízes e folhas do ginseng americano.J. Agric.Química Alimentar.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA e Yuan KS Farmacologia do ginseng: muitos componentes e muitos efeitos.bioquímica.farmacologia.58, 1685–1693 (1999).
Horário da postagem: 17 de setembro de 2023