Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cele mai bune rezultate, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului dvs. (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stil sau JavaScript.
Ginsengul roșu a fost folosit în medicina tradițională asiatică de sute de ani.În acest studiu, am evaluat capacitatea a patru tipuri de ginseng roșu (ginseng roșu chinezesc, ginseng roșu coreean A, ginseng roșu coreean B și ginseng roșu coreean C) cultivate în diferite regiuni de a inhiba formarea și creșterea plămânului indus de cancerigen. tumori.Un test cu benzo(a)piren (B(a)P) a fost efectuat pe șoareci A/J, iar ginseng roșu coreean B s-a dovedit a fi cel mai eficient în reducerea poverii tumorale dintre cele patru soiuri de ginseng roșu.În plus, am analizat conținutul diferitelor ginsenozide (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 și Rg5) în patru extracte de ginseng roșu și am constatat că ginsengul roșu coreean B a avut cele mai ridicate niveluri de ginsenozidă Rg3 (G-Rg3), sugerând că G-Rg3 poate juca un rol important în eficacitatea sa terapeutică.Această lucrare arată că G-Rg3 are o biodisponibilitate relativ scăzută.Cu toate acestea, atunci când G-Rg3 a fost administrat concomitent cu inhibitorul P-gp verapamil, efluxul G-Rg3 în celulele Caco-2 a fost scăzut, rata de absorbție intestinală a G-Rg3 a fost crescută într-un model de șobolan și G-Rg3 a fost crescută.În celulele Caco-2, fluxul de Rg3 scade, iar nivelul concentrației de Rg3 scade.G-Rg3 este crescut în intestin și plasmă, iar capacitatea sa de a preveni tumorile este, de asemenea, îmbunătățită într-un model de șobolan de tumorigeneză indusă de B(a)P.De asemenea, am descoperit că G-Rg3 a redus citotoxicitatea indusă de B(a)P și formarea aductului ADN în celulele pulmonare umane și a restabilit expresia și activitatea enzimelor de fază II prin calea Nrf2, care poate fi legată de mecanismul potențial de acțiune. a inhibării G -Rg3..Despre apariția tumorilor pulmonare.Studiul nostru demonstrează un rol potențial important pentru G-Rg3 în țintirea tumorilor pulmonare în modelele de șoarece.Biodisponibilitatea orală a acestei ginsenozide este îmbunătățită prin țintirea glicoproteinei P, permițând moleculei să exercite efecte anticancer.
Cel mai frecvent tip de cancer pulmonar este cancerul pulmonar fără celule mici (NSCLC), care este una dintre principalele cauze de deces prin cancer în China și America de Nord1,2.Principalul factor care crește riscul de a dezvolta cancer pulmonar non-mici este fumatul.Fumul de țigară conține mai mult de 60 de agenți cancerigeni, inclusiv benzo(a)piren (B(a)P), nitrozamine și izotopi radioactivi din degradarea radonului.3 Hidrocarburile aromatice policiclice B(a)P sunt principala cauză a toxicității în țigări. fum.La expunerea la B(a)P, citocromul P450 îl transformă în B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoxid (BPDE), care reacționează cu ADN-ul pentru a forma aductul BPDE-ADN 4. În plus, acestea aductii induc tumorigeneza pulmonara la soareci cu stadiu tumoral si histopatologie similara cu tumorile pulmonare umane5.Această caracteristică face din modelul de cancer pulmonar indus de B(a)P un sistem adecvat pentru evaluarea compușilor cu posibile proprietăți anticanceroase.
O posibilă strategie de prevenire a dezvoltării cancerului pulmonar în grupurile cu risc ridicat, în special fumătorii, este utilizarea agenților chimiopreventivi pentru a suprima dezvoltarea leziunilor neoplazice intraepiteliale și, prin urmare, a preveni progresia lor ulterioară către malignitate.Studiile pe animale arată că diverși agenți chimiopreventivi sunt eficienți6.Raportul nostru anterior7 a evidențiat efectele preventive bune ale ginsengului roșu asupra cancerului pulmonar.Această plantă a fost folosită de secole în medicina tradițională asiatică pentru a prelungi viața și sănătatea și s-a dovedit că are efecte antitumorale8.
Factorul activ al ginsengului este ginsenozida, care este folosit ca marker compozit pentru a evalua calitatea extractelor de ginseng.Analiza cantitativă a extractelor de ginseng brut implică de obicei utilizarea mai multor ginsenozide, inclusiv RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 și Rc9,10.Ginsenozidele au o utilizare clinică mică din cauza biodisponibilității lor orale foarte slabe11.Deși mecanismul pentru această biodisponibilitate slabă nu este clar, efluxul de ginsenozide cauzat de glicoproteina P (P-gp)12 poate fi cauza.P-gp este unul dintre cei mai importanți transportatori de eflux din superfamilia de transportoare de casete care leagă ATP, care utilizează energia hidrolizei ATP pentru a elibera substanțe intracelulare în mediul extern.Transportorii P-gp sunt de obicei larg distribuiti în intestin, rinichi, ficat și bariera hemato-encefalică13.P-gp joacă un rol critic în absorbția intestinală, iar inhibarea P-gp crește absorbția orală și disponibilitatea unor medicamente anticanceroase12,14.Exemple de inhibitori utilizați anterior în literatură sunt verapamilul și ciclosporina A15.Această lucrare implică stabilirea unui sistem de șoarece pentru studiul cancerului pulmonar indus de B(a)P pentru a evalua capacitatea diferitelor extracte de ginseng roșu din China și Coreea de a afecta bolile maligne.Extractele au fost analizate individual pentru a identifica ginsenozide specifice care pot afecta carcinogeneza.Verapamil a fost apoi folosit pentru a viza P-gp și pentru a îmbunătăți biodisponibilitatea orală și eficacitatea terapeutică a ginsenozidelor care vizează cancerul.
Mecanismul prin care saponinele de ginseng exercită efecte terapeutice asupra carcinogenezei rămâne neclar.Cercetările au arătat că diverse ginsenozide pot reduce daunele ADN-ului cauzate de agenții cancerigeni prin reducerea stresului oxidativ și activarea enzimelor de detoxifiere de faza II, prevenind astfel deteriorarea celulelor.Glutation S-transferaza (GST) este o enzimă tipică de fază II care este necesară pentru a reduce daunele ADN-ului cauzate de agenții cancerigeni17.Factorul 2 legat de eritroidul nuclear 2 (Nrf2) este un factor de transcripție important care reglează homeostazia redox și activează expresia enzimelor de fază II și răspunsurile antioxidante citoprotectoare18.Studiul nostru a examinat, de asemenea, efectele ginsenozidelor identificate asupra reducerii citotoxicității induse de B(a)P și formării aductului BPDE-ADN, precum și inducerea enzimelor de fază II prin modularea căii Nrf2 în celulele pulmonare normale.
Stabilirea unui model de șoarece de cancer indus de B(a)P este în concordanță cu lucrările anterioare5.Figura 1A prezintă designul experimental al unui tratament de 20 de săptămâni al unui model de cancer de șoarece indus de B(a)P, apă (control), extract de ginseng roșu chinezesc (CRG), extract de ginseng roșu coreean A (KRGA) și roșu coreean. ginseng.Extract B (KRGB) și Extract C de ginseng roșu coreean (KRGC).După 20 de săptămâni de tratament cu ginseng roșu, șoarecii au fost sacrificați prin asfixiere cu CO2.Figura 1B prezintă tumori pulmonare macroscopice la animalele tratate cu diferite tipuri de ginseng roșu, iar Figura 1C prezintă o micrografie cu lumină reprezentativă a unei probe de tumoră.Sarcina tumorală a animalelor tratate cu KRGB (1,5 ± 0,35) a fost mai mică decât cea a animalelor martor (0,82 ± 0,2, P <0,05), așa cum se arată în Figura 1D.Gradul mediu de inhibare a sarcinii tumorale a fost de 45%.Alte extracte de ginseng roșu testate nu au arătat modificări atât de semnificative ale sarcinii tumorale (P > 0,05).Nu au fost observate efecte secundare evidente la modelul de șoarece pe parcursul a 20 de săptămâni de tratament cu ginseng roșu, inclusiv nicio modificare a greutății corporale (datele nu sunt prezentate) și nicio toxicitate hepatică sau renală (Figura 1E, F).
Extractul de ginseng roșu tratează dezvoltarea tumorii pulmonare la șoarecii A/J.(A) Proiectare experimentală.(B) Tumori pulmonare mari într-un model de șoarece.Tumorile sunt indicate prin săgeți.a: grupul de ginseng roșu chinezesc.b: grupa A de ginseng roșu coreean.c: grupa de ginseng roșu coreean B. d: grupa de ginseng roșu coreean C. d: Grupul martor.(C) Micrografie luminoasă care arată o tumoare pulmonară.Mărire: 100. b: 400. (D) Încărcare tumorală în grupul cu extract de ginseng roșu.(E) Nivelurile plasmatice ale enzimei hepatice ALT.(F) Nivelurile plasmatice ale enzimei renale Cr.Datele sunt exprimate ca medie ± abatere standard.*P <0,05.
Extractele de ginseng roșu identificate în acest studiu au fost analizate prin spectrometrie de masă tandem de cromatografie lichidă ultra-performanță (UPLC-MS/MS) pentru a cuantifica următoarele ginsenozide: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3 , Rh2, F1, Rk1 și Rg5.Condițiile UPLC și MS utilizate pentru măsurarea analiților au fost descrise într-un raport anterior19.Cromatogramele UPLC-MS/MS a patru extracte de ginseng roșu sunt prezentate în Figura 2A.Au existat diferențe semnificative în conținutul total de ginsenozidă, cu cel mai mare conținut total de ginsenozidă în CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figura 2B).La evaluarea ginsenozidelor individuale (Figura 2C), KRGB a arătat cel mai înalt nivel de G-Rg3 în comparație cu alte ginsenozide (58,33 ± 3,81 μmol/L pentru G-Rg3s și 41,56 ± 2,88 μmol/L pentru G-Rg3r).L).tip ginseng roșu (P < 0,001).G-Rg3 apare ca o pereche de stereoizomeri G-Rg3r și G-Rg3s, care diferă în poziția grupării hidroxil la carbonul 20 (Fig. 2D).Rezultatele indică faptul că G-Rg3r sau G-Rg3 pot avea un potențial anticancer important într-un model de șoarece cu cancer indus de B(a)P.
Conținut de ginsenozide în diferite extracte de ginseng roșu.(A) Cromatograme UPLC-MS/MS a patru extracte de ginseng roșu.(B) Estimarea conținutului total de ginsenozidă din extractele indicate.(C) Detectarea ginsenozidelor individuale în extractele marcate.(D) Structuri ale stereoizomerilor de ginsenozid G-Rg3r și G-Rg3s.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a determinărilor în trei exemplare.***P <0,001.
Studiul UPLC-MS/MS a necesitat cuantificarea ginsenozidelor din probele intestinale și de sânge după 20 de săptămâni de tratament.Tratamentul cu KRGB a arătat prezența a doar 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 în sânge.Nu au fost detectate ginsenozide rămase, ceea ce indică o biodisponibilitate orală slabă și, prin urmare, expunerea redusă la aceste ginsenozide.
Linia celulară de adenocarcinom de colon Caco-2 este similară din punct de vedere morfologic și biochimic cu celulele epiteliale intestinale umane, demonstrându-și utilitatea în evaluarea transportului de enterocite prin bariera epitelială intestinală.Această analiză sa bazat pe un studiu anterior 20 .Figurile 3A, B, C, D, E, F prezintă imagini reprezentative ale transportului transcelular al G-Rg3r și G-Rg3 folosind un model monostrat Caco-2.Transportul transcelular al G-Rg3r sau G-Rg3 prin monostraturile Caco-2 de la partea bazolaterală la cea apicală (Pb-a) a fost semnificativ mai mare decât de la partea apicală la cea bazolaterală (Pa-b).Pentru G-Rg3r, valoarea medie a Pa-b a fost de 0,38 ± 0,06, care a crescut la 0,73 ± 0,06 după tratamentul cu 50 μmol/L verapamil și la 1,14 ± 0,09 după tratamentul cu 100 μmol/L verapamil (p < 0,001, 0,001 și 0,001). respectiv Figura 2).3A).Observațiile pentru G-Rg3 au urmat un model similar (Fig. 3B), iar rezultatele au arătat că tratamentul cu verapamil a îmbunătățit transportul G-Rg3r și G-Rg3.Tratamentul cu verapamil a dus, de asemenea, la o scădere semnificativă a raporturilor medii de eflux Pb-a și G-Rg3r și G-Rg3s (Figura 3C, D, E, F), indicând faptul că tratamentul cu verapamil reduce conținutul de ginsenozidă în celulele de eflux Caco-2..
Transportul transcelular al G-Rg3 în monostraturi Caco-2 și absorbția intestinală într-un test de perfuzie la șobolan.(A) Valoarea Pa-b a grupării G-Rg3r în monostratul Caco-2.(B) Valoarea Pa-b a grupărilor G-Rg3s în monostratul Caco-2.(C) Valoarea Pb a grupării G-Rg3r în monostratul Caco-2.(D) Valoarea Pb a grupărilor G-Rg3s în monostratul Caco-2.(E) Raportul de randament al grupărilor G-Rg3r într-un monostrat Caco-2.(F) Raportul de randament al grupărilor G-Rg3 într-un monostrat Caco-2.(G) Procentul de absorbție intestinală a G-Rg3r într-un test de perfuzie la șobolani.(H) Procentul de absorbție intestinală a G-Rg3 într-un test de perfuzie la șobolani.Permeabilitatea și absorbția au fost comparate fără adăugarea de verapamil.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a cinci experimente independente.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
În conformitate cu lucrările anterioare20, a fost efectuată perfuzia intestinală ortotopică a șobolanilor pentru a determina dacă absorbția G-Rg3 în intestin crește după tratamentul cu verapamil.Figurile 3G, H prezintă teste de perfuzie reprezentative pentru a evalua procentul de absorbție intestinală a G-Rg3r și G-Rg3 la șobolani model de cancer în perioadele de timp de mai sus.Procentul inițial de absorbție slabă a G-Rg3r de aproximativ 10% a crescut la mai mult de 20% după tratamentul cu 50 μM verapamil și la mai mult de 25% după tratamentul cu 100 μM verapamil.De asemenea, G-Rg3, care a avut o absorbție inițială de 10%, a prezentat, de asemenea, un vârf de peste 20% după tratamentul cu 50 μM verapamil și aproape 30% după tratamentul cu 100 μM verapamil, sugerând că inhibarea P-gp de către verapamil îmbunătățește G-absorbția intestinală Rg3 într-un model de șoarece de cancer pulmonar.
Conform metodei de mai sus, șoarecii model de cancer indus de B(a)P au fost împărțiți aleatoriu în șase grupuri, așa cum se arată în Figura 4A.Nu au fost observate pierderi semnificative în greutate sau semne clinice de toxicitate în grupul de tratament cu G-Rg3 comparativ cu grupul de control (datele nu sunt prezentate).După 20 de săptămâni de tratament, plămânii fiecărui șoarece au fost colectați.Figura 4B prezintă tumori pulmonare macroscopice la şoareci în grupurile de tratament de mai sus, iar Figura 4C prezintă o micrografie luminoasă reprezentativă a unei tumori reprezentative.În ceea ce privește sarcina tumorală din fiecare grup (Fig. 4D), valorile pentru șoarecii tratați cu G-Rg3r și G-Rg3s au fost de 0,75 ± 0,29 mm3 și, respectiv, 0,81 ± 0,30 mm3, în timp ce valorile pentru șoarecii G tratați cu -Rg3 au fost 1,63 respectiv ±0,40 mm3.șoareci de control (p <0,001), indicând faptul că tratamentul cu G-Rg3 a redus sarcina tumorală la șoareci.Administrarea de verapamil a sporit și mai mult această reducere: valorile la șoarecii verapamil+ G-Rg3r au scăzut de la 0,75 ± 0,29 mm3 la 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), iar valorile pentru verapamil+ de la 0,81 ± 0,30 mm3 ± 0,30 mm3 au scăzut mm3 la șoarecii tratați cu G. -Rg3s (p < 0,05), indicând faptul că verapamilul poate crește efectul inhibitor al G-Rg3 asupra tumorigenezei.Povara tumorală nu a arătat diferențe semnificative între grupul de control și grupul cu verapamil, grupul G-Rg3r și grupul G-Rg3s și grupul verapamil + G-Rg3r și grupul verapamil + G-Rg3s.Mai mult, nu au existat toxicități semnificative ale ficatului sau rinichilor asociate cu tratamentele evaluate (Figura 4E, F).
Povara tumorală după tratamentul cu G-Rg3 și nivelurile plasmatice sau intestinale de G-Rg3r și G-Rg3 în grupurile indicate.(A) Proiectare experimentală.(B) Tumori macroscopice într-un model de șoarece.Tumorile sunt indicate prin săgeți.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r în combinație cu verapamil.d: G-Rg3 în combinație cu verapamil.d: Verapamil.e: control.(C) Micrografie optică a tumorii la mărire.Răspuns: 100x.b: 400X.(D) Efectul tratamentului cu G-Rg3 + verapamil asupra sarcinii tumorale la șoarecii A/J.(E) Nivelurile plasmatice ale enzimei hepatice ALT.(F) Nivelurile plasmatice ale enzimei renale Cr.(G) Nivelurile plasmatice ale G-Rg3r sau G-Rg3 ale grupurilor indicate.(H) Nivelurile de G-Rg3r sau G-Rg3 în intestinele grupurilor indicate.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a determinărilor în trei exemplare.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Nivelurile G-Rg3 la șoarecii model de cancer indus de B(a)P au fost evaluate prin UPLC-MS/MS după o perioadă de tratament de 20 de săptămâni conform metodei descrise în secțiunea Metode.Figurile 4G și H arată nivelurile plasmatice și, respectiv, intestinale de G-Rg3.Nivelurile plasmatice de G-Rg3r au fost de 0,44 ± 0,32 μmol/L și au crescut la 1,17 ± 0,47 μmol/L cu administrarea concomitentă de verapamil (p < 0,001), în timp ce nivelurile intestinale de G-Rg3r au fost de 0,53 ± 0,08 μg/l.Atunci când este combinat cu verapamil, g a crescut la 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Pentru G-Rg3, rezultatele au urmat un model similar, indicând faptul că tratamentul cu verapamil a crescut biodisponibilitatea orală a G-Rg3 la șoarecii A/J.
Testul de viabilitate celulară a fost utilizat pentru a evalua citotoxicitatea B(a)P și G-Rg3 pe celulele hEL.Citotoxicitatea indusă de B(a)P în celulele hEL este prezentată în Figura 5A, în timp ce proprietățile netoxice ale G-Rg3r și G-Rg3 sunt prezentate în Figurile 5A și 5B.5B, C. Pentru a evalua efectul citoprotector al G-Rg3, B(a)P a fost co-administrat cu diferite concentrații de G-Rg3r sau G-Rg3 în celulele hEL.După cum se arată în Figura 5D, G-Rg3r la concentrații de 5 μM, 10 μM și 20 μM a restabilit viabilitatea celulei la 58,3%, 79,3% și, respectiv, 77,3%.Rezultate similare pot fi observate și în grupul G-Rg3s.Când concentrațiile de G-Rg3 au fost de 5 uM, 10 uM și 20 uM, viabilitatea celulară a fost restabilită la 58,3%, 72,7% și, respectiv, 76,7% (Figura 5E).).Prezența aductilor BPDE-ADN a fost măsurată folosind un kit ELISA.Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de aduct BPDE-ADN au fost crescute în grupul tratat cu B(a)P în comparație cu grupul de control, dar în comparație cu co-tratamentul G-Rg3, nivelurile de aduct BPDE-ADN în grupul B(a)P B în grupul tratat, nivelurile de aduct ADN au fost reduse semnificativ.Rezultatele tratamentului cu B(a)P singur sunt prezentate în Figura 5F (1,87 ± 0,33 față de 3,77 ± 0,42 pentru G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 față de 3,77 ± 0,42 pentru G-Rg3s, p < 0,001).
Viabilitatea celulară și formarea aductului BPDE-ADN în celulele hEL tratate cu G-Rg3 și B(a)P.(A) Viabilitatea celulelor hEL tratate cu B(a)P.(B) Viabilitatea celulelor hEL tratate cu G-Rg3r.(C) Viabilitatea celulelor hEL tratate cu G-Rg3.(D) Viabilitatea celulelor hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3r.(E) Viabilitatea celulelor hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3.(F) Nivelurile de aduct BPDE-ADN în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a determinărilor în trei exemplare.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Expresia enzimei GST a fost detectată după co-tratament cu 10 μM B(a)P și 10 μM G-Rg3r sau G-Rg3s.Rezultatele noastre au arătat că B(a)P a suprimat expresia GST (59,7 ± 8,2% în grupul G-Rg3r și 39 ± 4,5% în grupul G-Rg3s), iar B(a)P a fost asociat cu oricare cu G-Rg3r. , sau cu G-Rg3r, sau cu G-Rg3r.Co-tratamentul cu G-Rg3s a restabilit expresia GST.Expresia GST (103,7 ± 15,5% în grupul G-Rg3r și 110 ± 11,1% în grupul G-Rg3s, p <0,05 și respectiv p <0,001, Fig. 6A, B și C).Activitatea GST a fost evaluată folosind un kit de testare a activității.Rezultatele noastre au arătat că grupul de tratament combinat a avut o activitate GST mai mare în comparație cu grupul numai B(a)P (96,3 ± 6,6% vs. 35,7 ± 7,8% în grupul G-Rg3r vs. 92,3 ± 6,5 în grupul G-Rg3r ).% vs 35,7 ± 7,8% în grupul G-Rg3s, p <0,001, Figura 6D).
Exprimarea GST și Nrf2 în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3.(A) Detectarea expresiei GST prin Western blot.(B) Expresia cantitativă a GST în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3r.(C) Expresia cantitativă a GST în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3s.(D) Activitate GST în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3.(E) Detectarea expresiei Nrf2 prin Western blot.(F) Expresia cantitativă a Nrf2 în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3r.(G) Expresia cantitativă a Nrf2 în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3s.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a determinărilor în trei exemplare.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Pentru a elucida căile implicate în suprimarea mediată de G-Rg3 a tumorigenezei induse de B(a)P, expresia Nrf2 a fost evaluată prin Western blot.După cum se arată în figurile 6E,F,G, în comparație cu grupul de control, doar nivelul de Nrf2 în grupul de tratament B(a)P a fost scăzut;totuși, în comparație cu grupul de tratament cu B(a)P, nivelurile B(a) Nrf2 din grupul PG-Rg3 au fost crescute (106 ± 9,5% pentru G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% pentru G-Rg3r vs. 41 ± 9,8% pentru G-Rg3s, p < 0,01).
Am confirmat rolul preventiv al Nrf2 prin suprimarea expresiei Nrf2 folosind ARN mic interferent specific (siRNA).Knockdown Nrf2 a fost confirmată prin Western blot (Fig. 7A, B).După cum se arată în figurile 7C, D, co-tratamentul celulelor hEL cu B(a)P și G-Rg3 a dus la o scădere a numărului de aducti BPDE-ADN (1,47 ± 0,21) comparativ cu tratamentul cu B(a)P singur în grupul de control siRNA.) G-Rg3r a fost 4,13 ± 0,49, G-Rg3s a fost 1,8 ± 0,32 și 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Cu toate acestea, efectul inhibitor al G-Rg3 asupra formării BPDE-ADN a fost abolit prin distrugerea Nrf2.În grupul siNrf2, nu a existat nicio diferență semnificativă în formarea aductului BPDE-ADN între co-tratamentul cu B(a)P și G-Rg3 și tratamentul cu B(a)P singur (3,0 ± 0,21 pentru G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).pentru G-Rg3r față de 3,6 pentru G-Rg3s față de ±0,45 față de 4,0±0,37, p > 0,05).
Efectul declanșării Nrf2 asupra formării aductului BPDE-ADN în celulele hEL.(A) Knockdown Nrf2 a fost confirmată prin Western blot.(B) Cuantificarea intensității benzii Nrf2.(C) Efectul declanșării Nrf2 asupra nivelurilor de aduct BPDE-ADN în celulele hEL tratate cu B (a) P și G-Rg3r.(D) Efectul declanșării Nrf2 asupra nivelurilor de aduct BPDE-ADN în celulele hEL tratate cu B(a)P și G-Rg3.Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard a determinărilor în trei exemplare.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Acest studiu a evaluat efectele preventive ale diferitelor extracte de ginseng roșu pe un model de șoarece de cancer pulmonar indus de B(a)P, iar tratamentul cu KRGB a redus semnificativ sarcina tumorală.Având în vedere că G-Rg3 are cel mai mare conținut în acest extract de ginseng, a fost studiat rolul important al acestei ginsenozide în inhibarea tumorigenezei.Atât G-Rg3r, cât și G-Rg3 (doi epimeri ai G-Rg3) au redus semnificativ sarcina tumorală într-un model de șoarece de cancer indus de B(a)P.G-Rg3r și G-Rg3 exercită efecte anticancerigene prin inducerea apoptozei celulelor tumorale21, inhibarea creșterii tumorii22, oprirea ciclului celular23 și afectarea angiogenezei24.De asemenea, sa demonstrat că G-Rg3 inhibă metastazele celulare25, iar capacitatea G-Rg3 de a spori efectele chimioterapiei și radioterapiei a fost documentată26,27.Poon și colab. au demonstrat că tratamentul cu G-Rg3 ar putea reduce efectele genotoxice ale B(a)P28.Acest studiu demonstrează potențialul terapeutic al G-Rg3 în țintirea moleculelor cancerigene de mediu și prevenirea cancerului.
În ciuda potențialului lor profilactic bun, biodisponibilitatea orală slabă a ginsenozidelor reprezintă o provocare pentru utilizarea clinică a acestor molecule.Analiza farmacocinetică a administrării orale a ginsenozidelor la șobolani a arătat că biodisponibilitatea sa este încă mai mică de 5%29.Aceste teste au arătat că după perioada de tratament de 20 de săptămâni, doar nivelurile sanguine de Rg5 au scăzut.Deși mecanismul de bază al biodisponibilității slabe rămâne de elucidat, se crede că P-gp este implicată în efluxul ginsenozidelor.Această lucrare a demonstrat pentru prima dată că administrarea de verapamil, un blocant P-gp, crește biodisponibilitatea orală a G-Rg3r și G-Rg3s.Astfel, această descoperire sugerează că G-Rg3r și G-Rg3s acționează ca substraturi ale P-gp pentru a-și regla efluxul.
Această lucrare demonstrează că tratamentul combinat cu verapamil crește biodisponibilitatea orală a G-Rg3 într-un model de șoarece de cancer pulmonar.Această constatare este susținută de transportul transcelular intestinal crescut al G-Rg3 la blocarea P-gp, crescând astfel absorbția acestuia.Testele în celulele Caco2 au arătat că tratamentul cu verapamil a redus efluxul de G-Rg3r și G-Rg3s, îmbunătățind în același timp permeabilitatea membranei.Un studiu realizat de Yang și colab.Studiile au arătat că tratamentul cu ciclosporină A (un alt blocant P-gp) crește biodisponibilitatea ginsenozidei Rh2 de la o valoare inițială de 1%20 la mai mult de 30%.Compușii ginsenozidici K și Rg1 au prezentat și ei rezultate similare30,31.Când verapamilul și ciclosporina A au fost administrate concomitent, efluxul compusului K în celulele Caco-2 a fost redus semnificativ de la 26,6 la mai puțin de 3, în timp ce nivelurile sale intracelulare au crescut de 40 de ori30.În prezența verapamilului, nivelurile de Rg1 au crescut în celulele epiteliale pulmonare de șobolan, sugerând un rol pentru P-gp în efluxul de ginsenozide, așa cum a arătat Meng și colab.31.Cu toate acestea, verapamilul nu a avut același efect asupra efluxului unor ginsenozide (cum ar fi Rg1, F1, Rh1 și Re), indicând faptul că acestea nu sunt afectate de substraturile P-gp, așa cum a arătat Liang și colab.32 .Această observație poate fi legată de implicarea altor transportatori și a structurilor alternative de ginsenozide.
Mecanismul efectului preventiv al G-Rg3 asupra cancerului este neclar.Studiile anterioare au arătat că G-Rg3 previne deteriorarea ADN-ului și apoptoza prin reducerea stresului oxidativ și a inflamației16,33, care poate fi mecanismul de bază pentru prevenirea tumorigenezei induse de B(a)P.Unele rapoarte indică faptul că genotoxicitatea indusă de B(a)P poate fi redusă prin modularea enzimelor de fază II pentru a forma BPDE-ADN34.GST este o enzimă tipică de fază II care inhibă formarea aductului BPDE-ADN prin promovarea legării GSH la BPDE, reducând astfel daunele ADN induse de B(a)P35.Rezultatele noastre arată că tratamentul cu G-Rg3 reduce citotoxicitatea indusă de B(a)P și formarea de aduct BPDE-ADN în celulele hEL și restabilește expresia și activitatea GST in vitro.Cu toate acestea, aceste efecte au fost absente în absența Nrf2, sugerând că G-Rg3 induce efecte citoprotectoare prin calea Nrf2.Nrf2 este un factor de transcripție major pentru enzimele de detoxifiere de faza II care promovează clearance-ul xenobioticelor36.Activarea căii Nrf2 induce citoprotecția și reduce afectarea tisulară37.Mai mult, mai multe rapoarte au susținut rolul Nrf2 ca supresor tumoral în carcinogeneză38.Studiul nostru arată că inducerea căii Nrf2 de către G-Rg3 joacă un rol important de reglare în genotoxicitatea indusă de B(a)P, provocând detoxifierea B(a)P prin activarea enzimelor de fază II, inhibând astfel procesul de tumorigeneză.
Lucrarea noastră dezvăluie potențialul ginsengului roșu în prevenirea cancerului pulmonar indus de B(a)P la șoareci prin implicarea importantă a ginsenozidei G-Rg3.Biodisponibilitatea orală slabă a acestei molecule împiedică aplicarea sa clinică.Cu toate acestea, acest studiu arată pentru prima dată că G-Rg3 este un substrat al P-gp, iar administrarea unui inhibitor de P-gp crește biodisponibilitatea G-Rg3 in vitro și in vivo.G-Rg3 reduce citotoxicitatea indusă de B(a)P prin reglarea căii Nrf2, care poate fi un mecanism potențial pentru funcția sa preventivă.Studiul nostru confirmă potențialul ginsenozidei G-Rg3 pentru prevenirea și tratamentul cancerului pulmonar.
Soareci femele A/J în vârstă de șase săptămâni (20 ± 1 g) și șobolani Wistar masculi în vârstă de 7 săptămâni (250 ± 20 g) au fost obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, SUA) și Institutul de Zoologie Wuhan.Universitatea (Wuhan, China).Centrul de colectare a culturilor de tip chinezesc (Wuhan, China) ne-a furnizat celule Caco-2 și hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, SUA) este o sursă de B(a)P și tricaprină.Ginsenozide purificate G-Rg3r și G-Rg3s, dimetil sulfoxid (DMSO), kit de test de proliferare CellTiter-96 (MTS), verapamil, mediu esențial minim (MEM) și ser fetal bovin (FBS) au fost achiziționate de la Chengdu Must Bio-Technology .Co, Ltd.(Chengdu, China).Kit-ul QIAamp ADN mini și kitul ELISA aduct BPDE-DNA au fost achiziționate de la Qiagen (Stanford, CA, SUA) și Cell Biolabs (San Diego, CA, SUA).Trusa de analiză a activității GST și kitul de analiză a proteinei totale (metoda BCA standard) au fost achiziționate de la Solarbio (Beijing, China).Toate extractele de ginseng roșu sunt stocate în Laboratorul Mingyu 7. Universitatea Baptist din Hong Kong (Hong Kong, China) și Centrul pentru Cancer din Coreea (Seul, Coreea) sunt surse comerciale de extract CRG și diferite extracte de ginseng roșu de diferite origini coreene (inclusiv KRGA, KRGB). și KRGC).Ginsengul roșu este făcut din rădăcinile de ginseng proaspăt de 6 ani.Extractul de ginseng roșu se obține prin spălarea ginseng-ului cu apă de trei ori, apoi concentrarea extractului apos și, în final, uscarea la temperatură scăzută pentru a obține pudra de extract de ginseng.Anticorpii (anti-Nrf2, anti-GST și β-actină), imunoglobulină G anti-iepure conjugată cu peroxidază de hrean (IgG), reactiv de transfecție, siARN de control și siARN Nrf2 au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), STATELE UNITE ALE AMERICII).
Celulele Caco2 și hEL au fost cultivate în vase de cultură celulară de 100 mm2 cu MEM care conține 10% FBS la 37 ° C într-o atmosferă umidificată de 5% CO2.Pentru a determina efectul condițiilor de tratament, celulele hEL au fost incubate cu diferite concentrații de B(a)P și G-Rg3 în MEM timp de 48 de ore.Celulele pot fi analizate sau colectate în continuare pentru a prepara extracte fără celule.
Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor experimentale al Colegiului Medical Tongji, Universitatea de Știință și Tehnologie Huazhong (Aprobare nr. 2019; Înregistrare nr. 4587TH).Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu ghidurile și reglementările relevante, iar studiul a fost efectuat în conformitate cu ghidurile de cercetare pe animale: Raportarea experimentelor in vivo (ARRIVE).Șoarecii A/J în vârstă de opt săptămâni au fost mai întâi injectați intraperitoneal cu B(a)P în soluție de tricaprină (100 mg/kg, 0,2 ml).După o săptămână, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în grupuri de control și diferite grupuri de tratament, 15 șoareci în fiecare grup și gavage o dată pe zi.După 20 de săptămâni de tratament, animalele au fost sacrificate prin asfixie cu CO2.Plămânii au fost colectați și fixați timp de 24 de ore.Numărul de tumori superficiale și dimensiunile individuale ale tumorii au fost cuantificate pentru fiecare plămân sub un microscop de disecție.Estimările volumului tumoral (V) au fost calculate utilizând următoarea expresie: V (mm3) = 4/3πr3, unde r este diametrul tumorii.Suma netă a tuturor volumelor tumorii din plămânii șoarecilor a reprezentat volumul total al tumorii, iar volumul total mediu al tumorii din fiecare grup a reprezentat încărcătura tumorală.Au fost colectate probe de sânge integral și intestinal și stocate la -80 ° C pentru determinarea UPLC-MS/MS.S-a colectat ser și a fost folosit un analizor chimic automat pentru a analiza nivelurile de alanina aminotransferaza (ALT) și creatinina serică (Cr) pentru a evalua funcția hepatică și renală.
Probele colectate au fost scoase din depozitul la rece, decongelate, cântărite și plasate în tuburi așa cum este descris mai sus.La aceasta s-a adăugat 0,5 μM phlorizină (standard intern) în 0,8 ml soluție de metanol.Țesutul a fost apoi omogenizat folosind Tissue-Tearor și omogenatul a fost ulterior transferat într-un tub de microcentrifugă de 1,5 ml.Amestecul a fost centrifugat la 15500 rpm timp de 15 minute.După îndepărtarea a 1,0 ml de supernatant, se usucă cu azot.Pentru recuperare s-au folosit două sute de microlitri de metanol.Sângele este colectat și procesat pe o singură linie și este folosit ca referință pentru toate măsurătorile.
Plăcile Transwell cu 24 de godeuri au fost însămânțate cu 1,0 × 105 celule Caco-2 per godeu pentru a evalua potențiala îmbunătățire a transportului G-Rg3 prin adăugarea de verapamil.După 3 săptămâni de cultură, celulele au fost spălate cu HBSS și preincubate la 37°C.S-au injectat 400 μL de 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s sau un amestec cu 50 sau 100 μM verapamil) pe partea bazolaterală sau apicală a monostratului și 600 μL de soluție HBSS au fost adăugate la celălalt latură.Se colectează 100 µl de mediu de cultură la momentele desemnate (0, 15, 30, 45, 60, 90 și 120 de minute) și se adaugă 100 µl de HBSS pentru a completa acest volum.Probele au fost păstrate la -4 ° C până la detectarea prin UPLC-MS/MS.Expresia Papp = dQ/(dT × A × C0) este utilizată pentru a cuantifica permeabilitatea apicală și bazolaterală unidirecțională aparentă și invers (Pa-b și respectiv Pb-a);dQ/dT este modificarea concentrației, A (0,6 cm2) este aria suprafeței monostratului, iar C0 este concentrația inițială a donorului.Raportul de eflux este calculat ca Pb-a/Pa-b, care reprezintă rata de eflux a medicamentului de studiu.
Șobolanii masculi Wistar au fost ținuți timp de 24 de ore, au băut doar apă și au fost anesteziați cu o injecție intravenoasă de soluție de pentobarbital 3,5%.Tubul de silicon intubat are capătul duodenului ca intrare și capătul ileonului ca ieșire.Utilizați o pompă peristaltică pentru a pompa admisia cu 10 µM G-Rg3r sau G-Rg3s în HBSS izotonic la un debit de 0,1 ml/min.Efectul verapamilului a fost evaluat prin adăugarea a 50 μM sau 100 μM de compus la 10 μM G-Rg3r sau G-Rg3s.UPLC-MS/MS a fost efectuat pe extracte de perfuzie colectate la punctele de timp 60, 90, 120 și 150 de minute după începerea perfuziei.Procentul de absorbție se cuantifică prin formula % absorbție = (1 – Cout/Cin) × 100%;concentrația de G-Rg3 la ieșire și la intrare este exprimată prin Cout și, respectiv, Cin.
Celulele hEL au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 1 × 104 celule per godeu și tratate cu B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) sau G-Rg3 dizolvat în DMSO .Medicamentele au fost apoi diluate cu mediu de cultură la diferite concentrații (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) timp de 48 de ore.Folosind un kit de testare MTS disponibil comercial, celulele au fost supuse unui protocol standard și apoi măsurate folosind un cititor de microplăci la 490 nm.Nivelul de viabilitate celulară al grupurilor co-tratate cu B(a)P (10 μM) și G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) a fost evaluat conform metodei de mai sus și comparat cu grupul netratat.
Celulele hEL au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri la o densitate de 1 × 105 celule/godeu și tratate cu 10 μMB(a)P în prezența sau absența a 10 μM G-Rg3.După 48 de ore de tratament, ADN-ul a fost extras din celulele hEL folosind QIAamp DNA Mini Kit conform protocolului producătorului.Formarea de aducti BPDE-ADN a fost detectată utilizând un kit ELISA de aduct BPDE-ADN.Nivelurile relative de aduct BPDE-ADN au fost măsurate folosind un cititor de microplăci prin măsurarea absorbanței la 450 nm.
Celulele hEL au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 1 × 104 celule per godeu și tratate cu 10 μMB(a)P în absența sau prezența a 10 μM G-Rg3 timp de 48 de ore.Activitatea GST a fost măsurată utilizând un kit comercial de analiză a activității GST în conformitate cu protocolul producătorului.Activarea relativă a GST a fost măsurată prin absorbanță la 450 nm folosind un cititor de microplăci.
Celulele hEL au fost spălate cu PBS rece cu gheață și apoi lizate utilizând tampon de testare de radioimunoprecipitare care conține inhibitori de protează și inhibitori de fosfatază.După cuantificarea proteinei folosind un kit de testare a proteinei totale, 30 μg de proteină din fiecare probă au fost separate cu 12% SDS-PAGE și transferate pe o membrană PVDF prin electroforeză.Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% și incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4°C.După incubarea cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean, s-au adăugat reactivi de chemiluminiscență îmbunătățiți pentru a vizualiza semnalul de legare.Intensitatea fiecărei benzi de proteine a fost cuantificată folosind software-ul ImageJ.
Software-ul GraphPad Prism 7.0 a fost utilizat pentru a analiza toate datele, exprimate ca medie ± abatere standard.Variația între grupurile de tratament a fost evaluată folosind testul t Student sau analiza unidirecțională a varianței, cu o valoare P <0,05 indicând semnificația statistică.
Toate datele obținute sau analizate în timpul acestui studiu sunt incluse în acest articol publicat și în fișierele de informații suplimentare.
Torre, LA, Siegel, RL și Jemal, A. Statistica cancerului pulmonar.adverb.Expirat.medicament.biologie.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Carcinogeni de tutun, biomarkerii lor și cancerul indus de tutun.Nat.Capelan de cancer.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH și Venitt, S. Aducti ADN și proteine în țesuturile umane rezultate din expunerea la fumul de tutun.internaţionalitate.J. Cancer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA și Yu M. Efectul Houttuynia cordata și silibinina asupra tumorigenezei pulmonare induse de benzo(a)piren la șoarecii A/J.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. şi colab.Produs natural anticancer izolat din materiale medicinale chinezești.maxilar.medicament.6, 27 (2011).
Yang, Y. şi colab.Eficacitatea polifenonului E, ginseng roșu și rapamicină asupra tumorigenezei pulmonare induse de benzo(a)piren la șoarecii A/J.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS și Yuan, KS Red, implicarea în terapia cancerului.maxilar.J. Nutt.medicament.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS și Gao, L. Ginsenoside în rădăcinile și frunzele de ginseng american.J. Agric.Chimia alimentelor.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA și Yuan KS Farmacologia ginsengului: multe componente și multe efecte.biochimie.farmacologie.58, 1685–1693 (1999).
Ora postării: 17-sept-2023