Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Красный женьшень используется в традиционной азиатской медицине на протяжении сотен лет.В этом исследовании мы оценили способность четырех типов красного женьшеня (китайский красный женьшень, корейский красный женьшень А, корейский красный женьшень B и корейский красный женьшень C), выращенных в разных регионах, ингибировать образование и рост вызванных канцерогенами легких. опухоли.Тест на бензо(а)пирен (B(a)P) был проведен на мышах A/J, и корейский красный женьшень B оказался наиболее эффективным в снижении опухолевой нагрузки среди четырех сортов красного женьшеня.Кроме того, мы проанализировали содержание различных гинсенозидов (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5) в четырех экстрактах красного женьшеня и обнаружили, что корейский красный женьшень B самые высокие уровни гинзенозида Rg3 (G-Rg3), что позволяет предположить, что G-Rg3 может играть важную роль в его терапевтической эффективности.Эта работа показывает, что G-Rg3 имеет относительно низкую биодоступность.Однако при совместном введении G-Rg3 с ингибитором P-gp верапамилом отток G-Rg3 в клетки Caco-2 уменьшался, скорость кишечной абсорбции G-Rg3 повышалась на крысиной модели, а G-Rg3 был увеличен.В клетках Сасо-2 уменьшается отток Rg3 и снижается уровень концентрации Rg3.Уровень G-Rg3 увеличивается в кишечнике и плазме, а его способность предотвращать опухоли также усиливается на крысиной модели онкогенеза, индуцированного B(a)P.Мы также обнаружили, что G-Rg3 снижает цитотоксичность, индуцированную B(a)P, и образование аддуктов ДНК в клетках легких человека, а также восстанавливает экспрессию и активность ферментов фазы II через путь Nrf2, что может быть связано с потенциальным механизмом действия. ингибирования G -Rg3..О возникновении опухолей легких.Наше исследование демонстрирует потенциально важную роль G-Rg3 в воздействии на опухоли легких на моделях мышей.Биодоступность этого гинсенозида при пероральном приеме повышается за счет воздействия на P-гликопротеин, что позволяет молекуле оказывать противораковое действие.
Наиболее распространенным типом рака легких является немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), который является одной из ведущих причин смертности от рака в Китае и Северной Америке1,2.Основным фактором, повышающим риск развития немелкоклеточного рака легкого, является курение.Сигаретный дым содержит более 60 канцерогенов, включая бензо(а)пирен (Б(а)П), нитрозамины и радиоактивные изотопы распада радона.3 Полициклические ароматические углеводороды Б(а)П являются основной причиной токсичности сигарет. курить.При воздействии B(a)P цитохром P450 превращает его в B(a)P-7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид (BPDE), который реагирует с ДНК с образованием аддукта BPDE-ДНК 4. Кроме того, эти аддукты индуцируют онкогенез в легких у мышей со стадией опухоли и гистопатологией, сходной с опухолями легких человека5.Эта особенность делает модель рака легких, индуцированного B(a)P, подходящей системой для оценки соединений с возможными противораковыми свойствами.
Одной из возможных стратегий предотвращения развития рака легких у групп высокого риска, особенно у курильщиков, является применение химиопрофилактических средств для подавления развития интраэпителиальных неопластических поражений и тем самым предотвращения их последующего прогрессирования в злокачественные новообразования.Исследования на животных показывают, что различные химиопрофилактические средства эффективны6.В нашем предыдущем отчете7 подчеркивалось хорошее профилактическое воздействие красного женьшеня на рак легких.Эта трава веками использовалась в традиционной азиатской медицине для продления жизни и здоровья, и было документально подтверждено ее противоопухолевое действие8.
Активным фактором женьшеня является гинзенозид, который используется в качестве составного маркера для оценки качества экстрактов женьшеня.Количественный анализ сырых экстрактов женьшеня обычно включает использование нескольких гинсенозидов, включая RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 и Rc9,10.Гинзенозиды мало используются в клинической практике из-за их очень плохой биодоступности при пероральном приеме11.Хотя механизм такой плохой биодоступности не ясен, причиной может быть отток гинзенозидов, вызванный P-гликопротеином (P-gp)12.P-gp является одним из наиболее важных эффлюксных транспортеров в суперсемействе АТФ-связывающих кассетных транспортеров, который использует энергию гидролиза АТФ для высвобождения внутриклеточных веществ во внешнюю среду.Транспортеры P-gp обычно широко распространены в кишечнике, почках, печени и гематоэнцефалическом барьере13.P-gp играет решающую роль в кишечной абсорбции, а ингибирование P-gp увеличивает пероральную абсорбцию и доступность некоторых противораковых препаратов12,14.Примерами ингибиторов, ранее использовавшихся в литературе, являются верапамил и циклоспорин А15.Эта работа включает в себя создание мышиной системы для изучения рака легких, индуцированного B(a)P, чтобы оценить способность различных экстрактов красного женьшеня из Китая и Кореи влиять на злокачественные новообразования.Экстракты были индивидуально проанализированы для выявления специфических гинсенозидов, которые могут влиять на канцерогенез.Затем верапамил использовался для воздействия на P-gp и улучшения пероральной биодоступности и терапевтической эффективности гинзенозидов, нацеленных на рак.
Механизм, посредством которого сапонины женьшеня оказывают терапевтическое воздействие на канцерогенез, остается неясным.Исследования показали, что различные гинсенозиды могут уменьшить повреждение ДНК, вызванное канцерогенами, путем снижения окислительного стресса и активации ферментов детоксикации фазы II, тем самым предотвращая повреждение клеток.Глутатион S-трансфераза (GST) является типичным ферментом фазы II, который необходим для уменьшения повреждения ДНК, вызванного канцерогенами17.Фактор 2, родственный ядерному эритроиду 2 (Nrf2), является важным фактором транскрипции, который регулирует окислительно-восстановительный гомеостаз и активирует экспрессию ферментов фазы II и цитопротекторные антиоксидантные реакции18.В нашем исследовании также изучалось влияние выявленных гинзенозидов на снижение цитотоксичности, индуцированной B(a)P, и образование аддукта BPDE-ДНК, а также на индуцирование ферментов фазы II путем модуляции пути Nrf2 в нормальных клетках легких.
Создание мышиной модели рака, индуцированного B(a)P, согласуется с предыдущей работой5.На рисунке 1А показан экспериментальный план 20-недельного лечения модели рака у мышей, индуцированного B(a)P, водой (контроль), экстрактом китайского красного женьшеня (CRG), экстрактом корейского красного женьшеня A (KRGA) и корейским красным женьшенем. женьшень.Экстракт B (KRGB) и экстракт корейского красного женьшеня C (KRGC).После 20 недель лечения красным женьшенем мышей умерщвляли путем удушья CO2.На рисунке 1B показаны макроскопические опухоли легких у животных, получавших различные виды красного женьшеня, а на рисунке 1C показана репрезентативная световая микрофотография образца опухоли.Опухолевая нагрузка у животных, получавших KRGB (1,5 ± 0,35), была ниже, чем у контрольных животных (0,82 ± 0,2, P <0,05), как показано на рисунке 1D.Средняя степень ингибирования опухолевой нагрузки составила 45%.Другие протестированные экстракты красного женьшеня не показали таких значительных изменений в опухолевой нагрузке (P > 0,05).Никаких очевидных побочных эффектов не наблюдалось у мышей в течение 20 недель лечения красным женьшенем, включая отсутствие изменений в массе тела (данные не показаны) и отсутствие токсичности для печени или почек (рис. 1E,F).
Экстракт красного женьшеня лечит развитие опухоли легких у мышей A/J.(А) Экспериментальный дизайн.(B) Большие опухоли легких на мышиной модели.Опухоли указаны стрелками.а: Группа китайского красного женьшеня.б: группа А корейского красного женьшеня.c: Группа корейского красного женьшеня B. d: Группа корейского красного женьшеня C. d: Контрольная группа.(C) Световая микрофотография, показывающая опухоль легкого.Увеличение: 100. b: 400. (D) Опухолевая нагрузка в группе экстракта красного женьшеня.(E) Уровни печеночного фермента АЛТ в плазме.(F) Уровни почечного фермента Cr в плазме.Данные выражаются как среднее значение ± стандартное отклонение.*Р <0,05.
Экстракты красного женьшеня, выявленные в этом исследовании, были проанализированы с помощью тандемной масс-спектрометрии сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC-MS/MS) для количественного определения следующих гинсенозидов: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 и Rg5.Условия UPLC и MS, используемые для измерения аналитов, были описаны в предыдущем отчете19.Хроматограммы UPLC-MS/MS четырех экстрактов красного женьшеня показаны на рисунке 2A.Были значительные различия в общем содержании гинсенозидов, причем самое высокое общее содержание гинзенозидов наблюдалось в CRG (590,27 ± 41,28 мкмоль/л) (рис. 2B).При оценке отдельных гинсенозидов (рис. 2C) KRGB показал самый высокий уровень G-Rg3 по сравнению с другими гинсенозидами (58,33 ± 3,81 мкмоль/л для G-Rg3s и 41,56 ± 2,88 мкмоль/л для G-Rg3r).L).тип красного женьшеня (P <0,001).G-Rg3 встречается в виде пары стереоизомеров G-Rg3r и G-Rg3s, которые различаются положением гидроксильной группы при углероде 20 (рис. 2Г).Результаты показывают, что G-Rg3r или G-Rg3 могут обладать важным противораковым потенциалом в мышиной модели рака, индуцированного B(a)P.
Содержание гинзенозидов в различных экстрактах красного женьшеня.(A) Хроматограммы UPLC-MS/MS четырех экстрактов красного женьшеня.(B) Оценка общего содержания гинсенозидов в указанных экстрактах.(C) Обнаружение отдельных гинсенозидов в меченых экстрактах.(D) Структуры стереоизомеров гинзенозидов G-Rg3r и G-Rg3s.Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение трехкратных определений.***Р <0,001.
Исследование UPLC-MS/MS потребовало количественного определения гинсенозидов в образцах кишечника и крови после 20 недель лечения.Лечение КРГБ показало наличие в крови всего 0,0063 ± 0,0005 мкг/мл Rg5.Оставшихся гинзенозидов обнаружено не было, что указывает на плохую биодоступность при пероральном приеме и, следовательно, на снижение воздействия этих гинсенозидов.
Клеточная линия аденокарциномы толстой кишки Caco-2 морфологически и биохимически сходна с эпителиальными клетками кишечника человека, что демонстрирует ее полезность в оценке транспорта энтероцитов через эпителиальный барьер кишечника.Этот анализ был основан на более раннем исследовании 20 .На рисунках 3A, B, C, D, E, F показаны репрезентативные изображения трансклеточного транспорта G-Rg3r и G-Rg3 с использованием модели монослоя Caco-2.Трансклеточный транспорт G-Rg3r или G-Rg3 через монослои Caco-2 от базолатеральной к апикальной стороне (Pb-a) был значительно выше, чем от апикальной к базолатеральной стороне (Pa-b).Для G-Rg3r среднее значение Pa-b составляло 0,38 ± 0,06, которое увеличивалось до 0,73 ± 0,06 после лечения 50 мкмоль/л верапамила и до 1,14 ± 0,09 после лечения 100 мкмоль/л верапамила (p < 0,01 и 0,001, соответственно рисунок 2);3А).Наблюдения за G-Rg3 следовали аналогичной схеме (рис. 3B), и результаты показали, что лечение верапамилом усиливает транспорт G-Rg3r и G-Rg3.Лечение верапамилом также привело к значительному снижению средних соотношений оттока Pb-a и G-Rg3r и G-Rg3s (рис. 3C, D, E, F), что указывает на то, что лечение верапамилом снижает содержание гинсенозидов в отходящих клетках Caco-2..
Трансклеточный транспорт G-Rg3 в монослоях Caco-2 и кишечная абсорбция в анализе перфузии на крысах.(A) Значение Pa-b группы G-Rg3r в монослое Caco-2.(B) Значение Pa-b групп G-Rg3s в монослое Caco-2.(C) Значение Pb группы G-Rg3r в монослое Caco-2.(D) Значение Pb групп G-Rg3s в монослое Caco-2.(E) Коэффициент выхода групп G-Rg3r в монослое Caco-2.(F) Коэффициент выхода групп G-Rg3 в монослое Caco-2.(G) Процент кишечной абсорбции G-Rg3r в анализе перфузии у крыс.(H) Процент кишечной абсорбции G-Rg3 в анализе перфузии у крыс.Проницаемость и абсорбцию сравнивали без добавления верапамила.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
В соответствии с более ранней работой20, ортотопическая кишечная перфузия крыс была проведена, чтобы определить, увеличивается ли абсорбция G-Rg3 в кишечнике после лечения верапамилом.На фигурах 3G,H показаны репрезентативные перфузионные анализы для оценки процента кишечной абсорбции G-Rg3r и G-Rg3 у крыс с моделью рака в течение вышеуказанных периодов времени.Начальный процент слабого поглощения G-Rg3r, составлявший примерно 10%, увеличивался до более чем 20% после лечения 50 мкМ верапамила и до более чем 25% после лечения 100 мкМ верапамила.Аналогичным образом, G-Rg3, первоначальное поглощение которого составляло 10%, также показало пик более 20% после лечения 50 мкМ верапамила и почти 30% после лечения 100 мкМ верапамила, что позволяет предположить, что ингибирование P-gp верапамилом усиливается. кишечная G-абсорбция Rg3 на мышиной модели рака легких.
В соответствии с описанным выше методом мыши на модели рака, индуцированного B(a)P, были случайным образом разделены на шесть групп, как показано на рисунке 4A.Никакой значительной потери веса или клинических признаков токсичности не наблюдалось в группе лечения G-Rg3 по сравнению с контрольной группой (данные не показаны).После 20 недель лечения собирали легкие каждой мыши.На фигуре 4B показаны макроскопические опухоли легких у мышей в вышеуказанных группах лечения, а на фигуре 4C показана репрезентативная световая микрофотография репрезентативной опухоли.Что касается опухолевой нагрузки в каждой группе (рис. 4D), значения для мышей, получавших G-Rg3r и G-Rg3, составляли 0,75 ± 0,29 мм3 и 0,81 ± 0,30 мм3 соответственно, в то время как значения для G-мышей, получавших лечение с -Rg3s составляли 1,63 соответственно ±0,40 мм3.контрольные мыши (p <0,001), что указывает на то, что лечение G-Rg3 снижает опухолевую нагрузку у мышей.Введение верапамила еще больше усилило это снижение: значения у мышей верапамил+ G-Rg3r снизились с 0,75 ± 0,29 мм3 до 0,33 ± 0,25 мм3 (р < 0,01), а значения для верапамил+ с 0,81 ± 0,30 мм3 снизились до 0,29 ± 0,21. mm3 у мышей, получавших G.-Rg3s (p <0,05), что указывает на то, что верапамил может усиливать ингибирующее действие G-Rg3 на онкогенез.Опухолевая нагрузка не выявила существенных различий между контрольной группой и группой верапамила, группой G-Rg3r и группой G-Rg3s, а также группой верапамил+G-Rg3r и группой верапамил+G-Rg3s.Более того, не было выявлено значительной токсичности для печени или почек, связанной с оцениваемым лечением (рис. 4E,F).
Опухолевая нагрузка после лечения G-Rg3 и уровни G-Rg3r и G-Rg3 в плазме или кишечнике в указанных группах.(А) Экспериментальный дизайн.(B) Макроскопические опухоли на мышиной модели.Опухоли указаны стрелками.а: G-Rg3r.б: G-Rg3s.в: G-Rg3r в сочетании с верапамилом.г: G-Rg3 в сочетании с верапамилом.г: Верапамил.е: контроль.(C) Оптическая микрофотография опухоли при увеличении.Ответ: 100х.б: 400X.(D) Влияние лечения G-Rg3 + верапамилом на опухолевую нагрузку у мышей A/J.(E) Уровни печеночного фермента АЛТ в плазме.(F) Уровни почечного фермента Cr в плазме.(G) Уровни G-Rg3r или G-Rg3 указанных групп в плазме.(H) Уровни G-Rg3r или G-Rg3s в кишечнике указанных групп.Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение трехкратных определений.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Уровни G-Rg3 у мышей на модели рака, индуцированного B(a)P, оценивали с помощью UPLC-MS/MS после 20-недельного периода лечения в соответствии с методом, описанным в разделе «Методы».На рисунках 4G и H показаны уровни G-Rg3 в плазме и кишечнике соответственно.Уровни G-Rg3r в плазме составляли 0,44 ± 0,32 мкмоль/л и повышались до 1,17 ± 0,47 мкмоль/л при одновременном приеме верапамила (p < 0,001), тогда как уровни G-Rg3r в кишечнике составляли 0,53 ± 0,08 мкг/л.При сочетании с верапамилом g увеличивался до 1,35 ± 0,13 мкг/г (р < 0,001).Для G-Rg3 результаты следовали аналогичной схеме, указывая на то, что лечение верапамилом увеличивало биодоступность G-Rg3 при пероральном приеме у мышей A/J.
Анализ жизнеспособности клеток использовали для оценки цитотоксичности B(a)P и G-Rg3 на клетках hEL.Цитотоксичность, индуцированная B(a)P в клетках hEL, показана на рисунке 5A, тогда как нетоксические свойства G-Rg3r и G-Rg3 показаны на рисунках 5A и 5B.5B, C. Чтобы оценить цитопротекторный эффект G-Rg3, B(a)P вводили совместно с различными концентрациями G-Rg3r или G-Rg3 в клетки hEL.Как показано на рисунке 5D, G-Rg3r в концентрациях 5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ восстанавливал жизнеспособность клеток до 58,3%, 79,3% и 77,3% соответственно.Аналогичные результаты можно увидеть и в группе G-Rg3s.Когда концентрации G-Rg3 составляли 5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ, жизнеспособность клеток восстанавливалась до 58,3%, 72,7% и 76,7% соответственно (рис. 5E).).Присутствие аддуктов BPDE-ДНК измеряли с использованием набора ELISA.Наши результаты показали, что уровни аддукта BPDE-ДНК были увеличены в группе, получавшей B(a)P, по сравнению с контрольной группой, но по сравнению с совместным лечением G-Rg3 уровни аддукта BPDE-ДНК в группе B(a)P В группе, получавшей лечение, уровни аддукта ДНК были значительно снижены.Результаты лечения только B(a)P показаны на рисунке 5F (1,87 ± 0,33 против 3,77 ± 0,42 для G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 против 3,77 ± 0,42 для G-Rg3s, p <0,001).
Жизнеспособность клеток и образование аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL, обработанных G-Rg3 и B(a)P.(А) Жизнеспособность клеток hEL, обработанных B(a)P.(B) Жизнеспособность клеток hEL, обработанных G-Rg3r.(C) Жизнеспособность клеток hEL, обработанных G-Rg3.(D) Жизнеспособность клеток hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3r.(E) Жизнеспособность клеток hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3.(F) Уровни аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3.Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение трехкратных определений.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Экспрессию фермента GST обнаруживали после совместной обработки 10 мкМ B(a)P и 10 мкМ G-Rg3r или G-Rg3s.Наши результаты показали, что B(a)P подавлял экспрессию GST (59,7 ± 8,2% в группе G-Rg3r и 39 ± 4,5% в группе G-Rg3s), а B(a)P был связан либо с G-Rg3r, либо с G-Rg3r. , или с G-Rg3r, или с G-Rg3r.Совместное лечение G-Rg3 восстановило экспрессию GST.Экспрессия GST (103,7 ± 15,5% в группе G-Rg3r и 110 ± 11,1% в группе G-Rg3s, p < 0,05 и p < 0,001 соответственно, рис. 6А, Б и В).Активность GST оценивали с использованием набора для анализа активности.Наши результаты показали, что группа комбинированного лечения имела более высокую активность GST по сравнению с группой, получавшей только B(a)P (96,3 ± 6,6% против 35,7 ± 7,8% в группе G-Rg3r против 92,3 ± 6,5 в группе G-Rg3r). ).% против 35,7 ± 7,8% в группе G-Rg3s, p <0,001, рисунок 6D).
Экспрессия GST и Nrf2 в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3.(А) Обнаружение экспрессии GST с помощью вестерн-блоттинга.(B) Количественная экспрессия GST в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3r.(C) Количественная экспрессия GST в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3s.(D) Активность GST в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3.(E) Обнаружение экспрессии Nrf2 с помощью вестерн-блоттинга.(F) Количественная экспрессия Nrf2 в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3r.(G) Количественная экспрессия Nrf2 в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3s.Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение трехкратных определений.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Чтобы выяснить пути, участвующие в G-Rg3-опосредованном подавлении B(a)P-индуцированного онкогенеза, экспрессию Nrf2 оценивали с помощью вестерн-блоттинга.Как показано на фигурах 6E,F,G, по сравнению с контрольной группой, только уровень Nrf2 в группе лечения B(a)P был снижен;однако по сравнению с группой лечения B(a)P уровни B(a) Nrf2 в группе PG-Rg3 были повышены (106 ± 9,5% для G-Rg3r против 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% для G-Rg3r против 41 ± 9,8% для G-Rg3s, p < 0,01).
Мы подтвердили профилактическую роль Nrf2 путем подавления экспрессии Nrf2 с помощью специфической малой интерферирующей РНК (миРНК).Нокдаун Nrf2 был подтвержден вестерн-блоттингом (рис. 7A,B).Как показано на рисунках 7C, D, совместная обработка клеток hEL B(a)P и G-Rg3 привела к уменьшению количества аддуктов BPDE-ДНК (1,47 ± 0,21) по сравнению с обработкой B(a)P. только в контрольной группе siRNA.) G-Rg3r составлял 4,13 ± 0,49, G-Rg3s составлял 1,8 ± 0,32 и 4,1 ± 0,57, p <0,01).Однако ингибирующее действие G-Rg3 на образование BPDE-ДНК было отменено нокдауном Nrf2.В группе siNrf2 не было значительной разницы в образовании аддукта BPDE-ДНК между совместным лечением B(a)P и G-Rg3 и только лечением B(a)P (3,0 ± 0,21 для G-Rg3r против 3,56 ± 0,32). ).для G-Rg3r против 3,6 для G-Rg3s против ±0,45 против 4,0±0,37, p > 0,05).
Влияние нокдауна Nrf2 на образование аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL.(A) Нокдаун Nrf2 был подтвержден вестерн-блоттингом.(B) Количественная оценка интенсивности полосы Nrf2.(C) Влияние нокдауна Nrf2 на уровни аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3r.(D) Влияние нокдауна Nrf2 на уровни аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL, обработанных B(a)P и G-Rg3.Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение трехкратных определений.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
В этом исследовании оценивалось профилактическое действие различных экстрактов красного женьшеня на мышиной модели рака легких, индуцированного B(a)P, а лечение KRGB значительно снижало опухолевую нагрузку.Учитывая, что G-Rg3 имеет самое высокое содержание в этом экстракте женьшеня, изучена важная роль этого гинзенозида в ингибировании онкогенеза.И G-Rg3r, и G-Rg3 (два эпимера G-Rg3) значительно снижают опухолевую нагрузку на мышиной модели рака, индуцированного B(a)P.G-Rg3r и G-Rg3 оказывают противораковое действие, индуцируя апоптоз опухолевых клеток21, ингибируя рост опухоли22, останавливая клеточный цикл23 и влияя на ангиогенез24.Также было показано, что G-Rg3 ингибирует клеточное метастазирование25, а также документально подтверждена способность G-Rg3 усиливать эффекты химио- и лучевой терапии26,27.Пун и др. продемонстрировали, что лечение G-Rg3 может снизить генотоксические эффекты B(a)P28.Это исследование демонстрирует терапевтический потенциал G-Rg3 в воздействии на канцерогенные молекулы окружающей среды и предотвращении рака.
Несмотря на их хороший профилактический потенциал, плохая биодоступность гинсенозидов при пероральном приеме представляет собой проблему для клинического использования этих молекул.Фармакокинетический анализ перорального введения гинсенозидов крысам показал, что его биодоступность по-прежнему составляет менее 5%29.Эти тесты показали, что после 20-недельного периода лечения снизился только уровень Rg5 в крови.Хотя основной механизм плохой биодоступности еще предстоит выяснить, считается, что P-gp участвует в оттоке гинсенозидов.Эта работа впервые продемонстрировала, что введение верапамила, блокатора P-gp, увеличивает пероральную биодоступность G-Rg3r и G-Rg3s.Таким образом, это открытие предполагает, что G-Rg3r и G-Rg3 действуют как субстраты P-gp, регулируя его отток.
Эта работа демонстрирует, что комбинированное лечение верапамилом увеличивает пероральную биодоступность G-Rg3 на мышиной модели рака легких.Это открытие подтверждается усилением кишечного трансклеточного транспорта G-Rg3 при блокаде P-gp, тем самым увеличивая его абсорбцию.Анализы на клетках Caco2 показали, что обработка верапамилом снижает отток G-Rg3r и G-Rg3, одновременно улучшая проницаемость мембран.Исследование Янга и др.Исследования показали, что лечение циклоспорином А (еще одним блокатором P-gp) увеличивает биодоступность гинзенозида Rh2 с исходного значения 1%20 до более чем 30%.Соединения гинсенозидов K и Rg1 также показали аналогичные результаты30,31.При совместном применении верапамила и циклоспорина А отток соединения К в клетках Caco-2 значительно снижался с 26,6 до менее 3, тогда как его внутриклеточные уровни увеличивались в 40 раз30.В присутствии верапамила уровни Rg1 повышались в эпителиальных клетках легких крыс, что указывает на роль P-gp в оттоке гинсенозидов, как показано Meng et al.31.Однако верапамил не оказывал такого же влияния на отток некоторых гинсенозидов (таких как Rg1, F1, Rh1 и Re), что указывает на то, что на них не влияют субстраты P-gp, как показано Liang et al.32 .Это наблюдение может быть связано с участием других транспортеров и альтернативных гинсенозидных структур.
Механизм профилактического действия G-Rg3 на рак неясен.Предыдущие исследования показали, что G-Rg3 предотвращает повреждение ДНК и апоптоз за счет снижения окислительного стресса и воспаления16,33, что может быть основным механизмом предотвращения онкогенеза, индуцированного B(a)P.В некоторых сообщениях указывается, что генотоксичность, вызванную B(a)P, можно снизить путем модуляции ферментов фазы II с образованием BPDE-ДНК34.GST представляет собой типичный фермент фазы II, который ингибирует образование аддукта BPDE-ДНК, способствуя связыванию GSH с BPDE, тем самым уменьшая повреждение ДНК, вызванное B(a)P35.Наши результаты показывают, что обработка G-Rg3 снижает индуцированную B(a)P цитотоксичность и образование аддукта BPDE-ДНК в клетках hEL, а также восстанавливает экспрессию и активность GST in vitro.Однако эти эффекты отсутствовали в отсутствие Nrf2, что позволяет предположить, что G-Rg3 индуцирует цитопротекторные эффекты через путь Nrf2.Nrf2 является основным фактором транскрипции ферментов детоксикации фазы II, который способствует выведению ксенобиотиков36.Активация пути Nrf2 вызывает цитозащиту и уменьшает повреждение тканей37.Более того, несколько сообщений подтверждают роль Nrf2 как супрессора опухолей в канцерогенезе38.Наше исследование показывает, что индукция пути Nrf2 с помощью G-Rg3 играет важную регуляторную роль в генотоксичности, индуцированной B(a)P, вызывая детоксикацию B(a)P путем активации ферментов фазы II, тем самым ингибируя процесс онкогенеза.
Наша работа раскрывает потенциал красного женьшеня в предотвращении рака легких, индуцированного B(a)P, у мышей благодаря важному участию гинзенозида G-Rg3.Плохая биодоступность этой молекулы при пероральном приеме затрудняет ее клиническое применение.Однако это исследование впервые показывает, что G-Rg3 является субстратом P-gp, а введение ингибитора P-gp увеличивает биодоступность G-Rg3 in vitro и in vivo.G-Rg3 снижает цитотоксичность, индуцированную B(a)P, путем регулирования пути Nrf2, что может быть потенциальным механизмом его профилактической функции.Наше исследование подтверждает потенциал гинзенозида G-Rg3 для профилактики и лечения рака легких.
Шестинедельные самки мышей A/J (20 ± 1 г) и 7-недельные крысы-самцы линии Wistar (250 ± 20 г) были получены из Лаборатории Джексона (Бар-Харбор, США) и Уханьского института зоологии.Университет (Ухань, Китай).Китайский центр сбора типовых культур (Ухань, Китай) предоставил нам клетки Caco-2 и hEL.Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США) является источником Б(а)П и трикаприна.Очищенные гинзенозиды G-Rg3r и G-Rg3s, диметилсульфоксид (ДМСО), набор для анализа пролиферации CellTiter-96 (MTS), верапамил, минимальная необходимая среда (MEM) и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Chengdu Must Bio-Technology. .Компания с ограниченной ответственностью.(Чэнду, Китай).Мини-набор QIAamp DNA и набор ELISA для аддукта BPDE-ДНК были приобретены у Qiagen (Стэнфорд, Калифорния, США) и Cell Biolabs (Сан-Диего, Калифорния, США).Набор для анализа активности GST и набор для анализа общего белка (стандартный метод BCA) были приобретены у Solarbio (Пекин, Китай).Все экстракты красного женьшеня хранятся в лаборатории Мингю 7. Гонконгский баптистский университет (Гонконг, Китай) и Корейский онкологический центр (Сеул, Корея) являются коммерческими источниками экстракта CRG и различных экстрактов красного женьшеня различного корейского происхождения (включая KRGA, KRGB). и КРГК).Красный женьшень изготавливается из корней 6-летнего свежего женьшеня.Экстракт красного женьшеня получают путем трехкратного промывания женьшеня водой, затем концентрирования водного экстракта и, наконец, сушки при низкой температуре с получением порошка экстракта женьшеня.Антитела (анти-Nrf2, анти-GST и β-актин), антикроличий иммуноглобулин G (IgG), конъюгированный с пероксидазой хрена, реагент для трансфекции, контрольная миРНК и миРНК Nrf2 были приобретены в компании Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния). .), США).
Клетки Caco2 и hEL культивировали в чашках для культивирования клеток площадью 100 мм2 с МЕМ, содержащим 10% FBS, при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2.Для определения влияния условий обработки клетки hEL инкубировали с различными концентрациями B(a)P и G-Rg3 в МЕМ в течение 48 часов.Клетки можно дополнительно проанализировать или собрать для приготовления бесклеточных экстрактов.
Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных Медицинского колледжа Тунцзи Хуачжунского университета науки и технологий (одобрение № 2019; регистрационный № 4587TH).Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами, а исследование проводилось в соответствии с рекомендациями «Исследования на животных: отчеты об экспериментах in vivo» (ARRIVE).Восьминедельным мышам A/J сначала внутрибрюшинно вводили B(a)P в растворе трикаприна (100 мг/кг, 0,2 мл).Через неделю мышей случайным образом разделили на контрольные группы и различные группы лечения, по 15 мышей в каждой группе, и вводили через зонд один раз в день.Через 20 недель лечения животных умерщвляли путем асфиксии CO2.Легкие собирали и фиксировали в течение 24 часов.Количество поверхностных опухолей и отдельные размеры опухолей определяли количественно для каждого легкого под препаровальным микроскопом.Оценки объема опухоли (V) рассчитывали с использованием следующего выражения: V (мм3) = 4/3πr3, где r — диаметр опухоли.Чистая сумма всех объемов опухолей в легких мышей представляла собой общий объем опухоли, а средний общий объем опухоли в каждой группе представлял собой опухолевую нагрузку.Образцы цельной крови и кишечника собирали и хранили при -80°C для определения UPLC-MS/MS.Собирали сыворотку и использовали автоматизированный химический анализатор для анализа уровней аланинаминотрансферазы (АЛТ) и сывороточного креатинина (Cr) для оценки функции печени и почек.
Собранные образцы извлекали из холодного хранилища, размораживали, взвешивали и помещали в пробирки, как описано выше.К этому добавляли 0,5 мкМ флоризина (внутренний стандарт) в 0,8 мл раствора метанола.Затем ткань гомогенизировали с помощью Tissue-Tearor и гомогенат впоследствии переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.Смесь центрифугировали при 15500 об/мин в течение 15 минут.После удаления 1,0 мл надосадочной жидкости сушат азотом.Для восстановления было использовано двести микролитров метанола.Кровь собирается и обрабатывается на одной линии и используется в качестве эталона для всех измерений.
24-луночные планшеты Transwell засевали 1,0 × 105 клеток Caco-2 на лунку для оценки потенциального усиления транспорта G-Rg3 за счет добавления верапамила.После 3 недель культивирования клетки промывали HBSS и предварительно инкубировали при 37°C.400 мкл 10 мкМ G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s или смесь с 50 или 100 мкМ верапамила) вводили на базолатеральную или апикальную сторону монослоя, а на другую сторону добавляли 600 мкл раствора HBSS. сторона.Соберите 100 мкл культуральной среды в назначенное время (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минут) и добавьте 100 мкл HBSS, чтобы составить этот объем.Образцы хранили при -4 °C до обнаружения с помощью UPLC-MS/MS.Выражение Papp = dQ/(dT × A × C0) используется для количественной оценки кажущейся однонаправленной апикальной и базолатеральной проницаемости и наоборот (Pa-b и Pb-a соответственно);dQ/dT – изменение концентрации, A (0,6 см2) – площадь поверхности монослоя, C0 – начальная концентрация донора.Коэффициент оттока рассчитывают как Pb-a/Pa-b, который представляет собой скорость оттока исследуемого препарата.
Самцов крыс Вистар голодали в течение 24 часов, пили только воду и анестезировали внутривенной инъекцией 3,5% раствора пентобарбитала.Интубированная силиконовая трубка имеет конец двенадцатиперстной кишки в качестве входа и конец подвздошной кишки в качестве выхода.Используйте перистальтический насос для прокачки входного отверстия с 10 мкм G-Rg3r или G-Rg3s в изотоническом HBSS со скоростью потока 0,1 мл/мин.Эффект верапамила оценивали путем добавления 50 мкМ или 100 мкМ соединения к 10 мкМ G-Rg3r или G-Rg3s.UPLC-MS/MS проводили на перфузионных экстрактах, собранных в моменты времени 60, 90, 120 и 150 минут после начала перфузии.Процент поглощения количественно определяют по формуле % поглощения = (1 – Cout/Cin) × 100%;концентрация G-Rg3 на выходе и входе выражается Cout и Cin соответственно.
Клетки hEL высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку и обрабатывали B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 мкМ) или G-Rg3, растворенным в ДМСО. .Затем препараты разводили культуральной средой до различных концентраций (0, 1, 2, 5, 10, 20 мкМ) в течение 48 часов.Используя коммерчески доступный набор для анализа MTS, клетки подвергали стандартному протоколу, а затем измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов при 490 нм.Уровень жизнеспособности клеток групп, совместно обработанных B(a)P (10 мкМ) и G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 мкМ), оценивали в соответствии с вышеуказанным методом и сравнивали с необработанной группой.
Клетки hEL высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 1 × 105 клеток/лунку и обрабатывали 10 мкМБ(а)П в присутствии или в отсутствие 10 мкМ G-Rg3.Через 48 часов обработки ДНК экстрагировали из клеток hEL с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit согласно протоколу производителя.Образование аддуктов BPDE-ДНК детектировали с использованием набора ELISA для аддуктов BPDE-ДНК.Относительные уровни аддукта BPDE-ДНК измеряли с использованием устройства для считывания микропланшетов путем измерения поглощения при 450 нм.
Клетки hEL высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку и обрабатывали 10 мкМБ(а)П в отсутствие или в присутствии 10 мкМ G-Rg3 в течение 48 часов.Активность GST измеряли с использованием коммерческого набора для анализа активности GST в соответствии с протоколом производителя.Относительную активацию GST измеряли по поглощению при 450 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов.
Клетки hEL промывали ледяным PBS и затем лизировали с использованием буфера для анализа радиоиммунопреципитации, содержащего ингибиторы протеазы и ингибиторы фосфатазы.После количественного определения белка с использованием набора для анализа общего белка 30 мкг белка в каждом образце разделяли с помощью 12%-ного электрофореза в ДСН-ПААГ и переносили на мембрану из ПВДФ с помощью электрофореза.Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С.После инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, добавляли реагенты усиленной хемилюминесценции для визуализации сигнала связывания.Интенсивность каждой белковой полосы определяли количественно с помощью программного обеспечения ImageJ.
Программное обеспечение GraphPad Prism 7.0 использовалось для анализа всех данных, выраженных как среднее значение ± стандартное отклонение.Вариации между группами лечения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента или одностороннего дисперсионного анализа, при этом значение P <0,05 указывает на статистическую значимость.
Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и дополнительные информационные файлы.
Торре, Л.А., Сигел, Р.Л. и Джемаль, А. Статистика рака легких.наречие.Истекший.лекарство.биология.893, 1–19 (2016).
Хехт, С. Канцерогены табака, их биомаркеры и рак, вызванный табаком.Нат.Раковый капеллан.3, 733–744 (2003).
Филлипс, Д.Х. и Венитт, С. ДНК и белковые аддукты в тканях человека в результате воздействия табачного дыма.интернациональность.Дж. Рак.131, 2733–2753 (2012).
Ян Ю., Ван Ю., Тан К., Любет Р.А. и Ю М. Влияние Houttuynia cordata и силибинина на бензо(а)пирен-индуцированный онкогенез легких у мышей A/J.Рак 7, 1053–1057 (2005).
Тан, В. и др.Противораковый натуральный продукт, выделенный из китайских лекарственных материалов.челюсть.лекарство.6, 27 (2011).
Ян, Ю. и др.Эффективность полифенона Е, красного женьшеня и рапамицина в отношении бензо(а)пирен-индуцированного онкогенеза в легких у мышей A/J.Рак 8, 52–58 (2006).
Ван, Ч.З., Андерсон, С., Ду, В., Хе, Т.С. и Юань, К.С. Ред, участие в терапии рака.челюсть.Дж. Натт.лекарство.14, 7–16 (2016).
Ли Т.С., Мацца Г., Коттрелл А.С. и Гао Л. Гинзенозиды в корнях и листьях американского женьшеня.Дж. Агрик.Пищевая химия.44, 717–720 (1996).
Аттеле А.С., Ву Дж.А. и Юань К.С. Фармакология женьшеня: множество компонентов и множество эффектов.биохимия.фармакология.58, 1685–1693 (1999).
Время публикации: 17 сентября 2023 г.