Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Na dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame použiť novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlu alebo JavaScriptu.
Červený ženšen sa v tradičnej ázijskej medicíne používa už stovky rokov.V tejto štúdii sme hodnotili schopnosť štyroch druhov červeného ženšenu (čínskeho červeného ženšenu, kórejského červeného ženšenu A, kórejského červeného ženšenu B a kórejského červeného ženšenu C) pestovaných v rôznych oblastiach inhibovať tvorbu a rast pľúc vyvolaných karcinogénmi. nádorov.Test na benzo(a)pyrén (B(a)P) bol vykonaný na myšiach A/J a zistilo sa, že kórejský červený ženšen B je najúčinnejší pri znižovaní nádorovej záťaže spomedzi štyroch odrôd červeného ženšenu.Okrem toho sme analyzovali obsah rôznych ginsenosidov (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 a Rg5) v štyroch extraktoch červeného ženšenu a zistili sme, že kórejský červený ženšen B mal najvyššie hladiny ginsenosidu Rg3 (G-Rg3), čo naznačuje, že G-Rg3 môže hrať dôležitú úlohu v jeho terapeutickej účinnosti.Táto práca ukazuje, že G-Rg3 má relatívne nízku biologickú dostupnosť.Keď sa však G-Rg3 podával spolu s inhibítorom P-gp verapamilom, eflux G-Rg3 do buniek Caco-2 sa znížil, rýchlosť intestinálnej absorpcie G-Rg3 sa zvýšila na modeli potkanov a G-Rg3 bola zvýšená.V bunkách Caco-2 sa odtok Rg3 znižuje a hladina koncentrácie Rg3 klesá.G-Rg3 je zvýšený v čreve a plazme a jeho schopnosť predchádzať nádorom je tiež zvýšená na potkanom modeli tumorigenézy indukovanej B(a)P.Zistili sme tiež, že G-Rg3 znížil B(a)P-indukovanú cytotoxicitu a tvorbu aduktov DNA v ľudských pľúcnych bunkách a obnovil expresiu a aktivitu enzýmov fázy II prostredníctvom dráhy Nrf2, čo môže súvisieť s potenciálnym mechanizmom účinku. G inhibície -Rg3..O výskyte nádorov pľúc.Naša štúdia demonštruje potenciálne dôležitú úlohu G-Rg3 pri zacielení na pľúcne nádory u myších modelov.Perorálna biologická dostupnosť tohto ginsenosidu je zvýšená zacielením na P-glykoproteín, čo umožňuje molekule prejavovať protirakovinové účinky.
Najbežnejším typom rakoviny pľúc je nemalobunkový karcinóm pľúc (NSCLC), ktorý je jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu v Číne a Severnej Amerike1,2.Hlavným faktorom, ktorý zvyšuje riziko vzniku nemalobunkového karcinómu pľúc, je fajčenie.Cigaretový dym obsahuje viac ako 60 karcinogénov vrátane benzo(a)pyrénu (B(a)P), nitrozamínov a rádioaktívnych izotopov z rozpadu radónu.3 Polycyklické aromatické uhľovodíky B(a)P sú hlavnou príčinou toxicity v cigaretách fajčiť.Po expozícii B(a)P ju cytochróm P450 premieňa na B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE), ktorý reaguje s DNA za vzniku aduktu BPDE-DNA 4. adukty indukujú tumorigenézu pľúc u myší s nádorovým štádiom a histopatológiou podobnou ľudským pľúcnym nádorom5.Táto vlastnosť robí z modelu B(a)P-indukovanej rakoviny pľúc vhodný systém na hodnotenie zlúčenín s možnými protirakovinovými vlastnosťami.
Jednou z možných stratégií prevencie rozvoja rakoviny pľúc u vysoko rizikových skupín, najmä u fajčiarov, je použitie chemopreventívnych činidiel na potlačenie rozvoja intraepitelových neoplastických lézií, a tým zabránenie ich následnej progresii do malignity.Štúdie na zvieratách ukazujú, že rôzne chemopreventívne činidlá sú účinné6.Naša predchádzajúca správa7 zdôraznila dobré preventívne účinky červeného ženšenu na rakovinu pľúc.Táto bylina sa po stáročia používa v tradičnej ázijskej medicíne na predĺženie života a zdravia a je dokázané, že má protinádorové účinky8.
Aktívnym faktorom ženšenu je ginsenosid, ktorý sa používa ako kompozitný marker na hodnotenie kvality ženšenových extraktov.Kvantitatívna analýza surových extraktov ženšenu typicky zahŕňa použitie niekoľkých ginsenosidov, vrátane RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 a Rc9,10.Ginsenozidy majú malé klinické využitie kvôli ich veľmi zlej perorálnej biologickej dostupnosti11.Hoci mechanizmus tejto zlej biologickej dostupnosti nie je jasný, príčinou môže byť eflux ginsenosidov spôsobený P-glykoproteínom (P-gp)12.P-gp je jedným z najdôležitejších efluxných transportérov v superrodine transportérov kaziet viažucich ATP, ktorý využíva energiu hydrolýzy ATP na uvoľnenie intracelulárnych látok do vonkajšieho prostredia.Transportéry P-gp sú typicky široko distribuované v čreve, obličkách, pečeni a hematoencefalickej bariére13.P-gp hrá rozhodujúcu úlohu pri črevnej absorpcii a inhibícia P-gp zvyšuje perorálnu absorpciu a dostupnosť niektorých protirakovinových liečiv12,14.Príklady inhibítorov predtým používaných v literatúre sú verapamil a cyklosporín A15.Táto práca zahŕňa vytvorenie myšacieho systému na štúdium rakoviny pľúc vyvolanej B(a)P na vyhodnotenie schopnosti rôznych extraktov červeného ženšenu z Číny a Kórey ovplyvniť zhubné nádory.Extrakty boli individuálne analyzované, aby sa identifikovali špecifické ginsenosidy, ktoré môžu ovplyvniť karcinogenézu.Verapamil sa potom použil na zacielenie P-gp a zlepšenie orálnej biologickej dostupnosti a terapeutickej účinnosti ginsenosidov zameraných na rakovinu.
Mechanizmus, ktorým saponíny ženšenu uplatňujú terapeutické účinky na karcinogenézu, zostáva nejasný.Výskum ukázal, že rôzne ginsenosidy môžu znížiť poškodenie DNA spôsobené karcinogénmi znížením oxidačného stresu a aktiváciou detoxikačných enzýmov fázy II, čím sa zabráni poškodeniu buniek.Glutatión S-transferáza (GST) je typický enzým fázy II, ktorý je potrebný na zníženie poškodenia DNA spôsobeného karcinogénmi17.Nukleárny erytroidný 2-príbuzný faktor 2 (Nrf2) je dôležitý transkripčný faktor, ktorý reguluje redoxnú homeostázu a aktivuje expresiu enzýmov fázy II a cytoprotektívne antioxidačné reakcie18.Naša štúdia tiež skúmala účinky identifikovaných ginsenosidov na zníženie cytotoxicity indukovanej B(a)P a tvorbu aduktov BPDE-DNA, ako aj indukciu enzýmov fázy II moduláciou dráhy Nrf2 v normálnych pľúcnych bunkách.
Vytvorenie myšacieho modelu B(a)P-indukovanej rakoviny je v súlade s predchádzajúcou prácou5.Obrázok 1A ukazuje experimentálny dizajn 20-týždňovej liečby modelu rakoviny u myší vyvolanej B(a)P, vodou (kontrola), extraktom z čínskeho červeného ženšenu (CRG), extraktom z kórejského červeného ženšenu A (KRGA) a kórejskou červenou Ženšeň.Extrakt B (KRGB) a extrakt C z kórejského červeného ženšenu (KRGC).Po 20 týždňoch liečby červeným ženšenom boli myši usmrtené zadusením CO2.Obrázok 1B ukazuje makroskopické nádory pľúc u zvierat liečených rôznymi typmi červeného ženšenu a obrázok 1C ukazuje reprezentatívny svetelný mikrosnímok vzorky nádoru.Nádorová záťaž zvierat liečených KRGB (1,5 ± 0,35) bola nižšia ako u kontrolných zvierat (0,82 ± 0,2, P < 0,05), ako je znázornené na obrázku 1D.Priemerný stupeň inhibície nádorovej záťaže bol 45 %.Ostatné testované extrakty červeného ženšenu nevykazovali také významné zmeny v nádorovej záťaži (P > 0,05).Na myšom modeli neboli počas 20 týždňov liečby červeným ženšenom pozorované žiadne zjavné vedľajšie účinky, vrátane žiadnej zmeny telesnej hmotnosti (údaje nie sú uvedené) a žiadnej toxicity pre pečeň alebo obličky (obrázok 1E,F).
Extrakt z červeného ženšenu lieči rozvoj pľúcneho nádoru u A/J myší.(A) Experimentálny dizajn.(B) Veľké pľúcne nádory v myšom modeli.Nádory sú označené šípkami.a: Skupina čínskeho červeného ženšenu.b: skupina A kórejského červeného ženšenu.c: Kórejský červený ženšen skupina B. d: Kórejský červený ženšen skupina C. d: Kontrolná skupina.(C) Svetelná mikrofotografie zobrazujúca nádor pľúc.Zväčšenie: 100. b: 400. (D) Nádorová záťaž v skupine s extraktom z červeného ženšenu.(E) Hladiny pečeňového enzýmu ALT v plazme.(F) Plazmatické hladiny renálneho enzýmu Cr.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka.*P <0,05.
Extrakty z červeného ženšenu identifikované v tejto štúdii boli analyzované tandemovou hmotnostnou spektrometriou s ultravýkonnou kvapalinovou chromatografiou (UPLC-MS/MS), aby sa kvantifikovali nasledujúce ginsenosidy: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 a Rg5.Podmienky UPLC a MS použité na meranie analytov boli opísané v predchádzajúcej správe19.UPLC-MS/MS chromatogramy štyroch extraktov červeného ženšenu sú znázornené na obrázku 2A.V celkovom obsahu ginsenosidu boli významné rozdiely, pričom najvyšší obsah celkového ginsenosidu bol v CRG (590,27 ± 41,28 μmol/l) (obrázok 2B).Pri hodnotení jednotlivých ginsenosidov (obrázok 2C) vykazoval KRGB najvyššiu hladinu G-Rg3 v porovnaní s ostatnými ginsenosidmi (58,33 ± 3,81 μmol/l pre G-Rg3s a 41,56 ± 2,88 μmol/l pre G -Rg3r).L).typ červený ženšen (P < 0,001).G-Rg3 sa vyskytuje ako pár stereoizomérov G-Rg3r a G-Rg3s, ktoré sa líšia polohou hydroxylovej skupiny na uhlíku 20 (obr. 2D).Výsledky naznačujú, že G-Rg3r alebo G-Rg3 môžu mať dôležitý protirakovinový potenciál v myšom modeli rakoviny indukovanej B(a)P.
Obsah ginsenosidov v rôznych extraktoch z červeného ženšenu.(A) UPLC-MS/MS chromatogramy štyroch extraktov červeného ženšenu.(B) Odhad celkového obsahu ginsenosidu v uvedených extraktoch.(C) Detekcia jednotlivých ginsenosidov v označených extraktoch.(D) Štruktúry ginsenozidových stereoizomérov G-Rg3r a G-Rg3s.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka trojnásobných stanovení.***P <0,001.
Štúdia UPLC-MS/MS vyžadovala kvantifikáciu ginsenosidov vo vzorkách čriev a krvi po 20 týždňoch liečby.Liečba KRGB ukázala prítomnosť iba 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 v krvi.Nezistili sa žiadne zostávajúce ginsenosidy, čo naznačuje slabú perorálnu biologickú dostupnosť, a teda zníženú expozíciu týmto ginsenosidom.
Bunková línia adenokarcinómu hrubého čreva Caco-2 je morfologicky a biochemicky podobná ľudským intestinálnym epitelovým bunkám, čo demonštruje jej užitočnosť pri hodnotení transportu enterocytov cez črevnú epitelovú bariéru.Táto analýza bola založená na predchádzajúcej štúdii 20 .Obrázky 3A,B,C,D,E,F znázorňujú reprezentatívne obrázky transcelulárneho transportu G-Rg3r a G-Rg3 s použitím modelu monovrstvy Caco-2.Transcelulárny transport G-Rg3r alebo G-Rg3 cez monovrstvy Caco-2 z bazolaterálnej na apikálnu stranu (Pb-a) bol významne vyšší ako z apikálnej na bazolaterálnu stranu (Pa-b).Pre G-Rg3r bola priemerná hodnota Pa-b 0,38 ± 0,06, ktorá sa zvýšila na 0,73 ± 0,06 po liečbe 50 μmol/l verapamilu a na 1,14 ± 0,09 po liečbe 100 μmol/l verapamilu (p < 0,01 a obr. 2).3A).Pozorovania pre G-Rg3 sledovali podobný vzor (obr. 3B) a výsledky ukázali, že liečba verapamilom zvýšila transport G-Rg3r a G-Rg3.Liečba verapamilom tiež viedla k významnému zníženiu priemerných efluxných pomerov Pb-a a G-Rg3r a G-Rg3s (obrázok 3C, D, E, F), čo naznačuje, že liečba verapamilom znižuje obsah ginsenosidu v efluxných bunkách Caco-2..
Transcelulárny transport G-Rg3 v monovrstvách Caco-2 a intestinálna absorpcia v teste perfúzie potkanov.(A) Hodnota Pa-b skupiny G-Rg3r v monovrstve Caco-2.(B) Hodnota Pa-b skupín G-Rg3s v monovrstve Caco-2.(C) Hodnota Pb skupiny G-Rg3r v monovrstve Caco-2.(D) Hodnota Pb skupín G-Rg3s v monovrstve Caco-2.(E) Pomer výťažku skupín G-Rg3r v monovrstve Caco-2.(F) Pomer výťažku skupín G-Rg3 v monovrstve Caco-2.(G) Percento črevnej absorpcie G-Rg3r v perfúznom teste u potkanov.(H) Percento črevnej absorpcie G-Rg3 v perfúznom teste u potkanov.Permeabilita a absorpcia sa porovnávali bez pridania verapamilu.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka piatich nezávislých experimentov.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
V súlade s predchádzajúcou prácou20 sa uskutočnila ortotopická intestinálna perfúzia potkanov, aby sa určilo, či sa absorpcia G-Rg3 v čreve zvyšuje po liečbe verapamilom.Obrázky 3G,H znázorňujú reprezentatívne perfúzne testy na vyhodnotenie percenta intestinálnej absorpcie G-Rg3r a G-Rg3 u potkanieho modelu rakoviny počas vyššie uvedených časových období.Počiatočné percento slabého vychytávania G-Rg3r približne 10 % sa zvýšilo na viac ako 20 % po liečbe 50 μM verapamilom a na viac ako 25 % po liečbe 100 μM verapamilom.Podobne G-Rg3, ktorý mal počiatočnú absorpciu 10 %, tiež vykázal vrchol nad 20 % po liečbe 50 μM verapamilom a takmer 30 % po liečbe 100 μM verapamilom, čo naznačuje, že inhibícia P-gp verapamilom sa zvyšuje črevná G-absorpcia Rg3 na myšom modeli rakoviny pľúc.
Podľa vyššie uvedeného spôsobu boli myši s modelom rakoviny indukované B(a)P náhodne rozdelené do šiestich skupín, ako je znázornené na obrázku 4A.V skupine liečenej G-Rg3 sa nepozorovala žiadna významná strata hmotnosti alebo klinické príznaky toxicity v porovnaní s kontrolnou skupinou (údaje nie sú uvedené).Po 20 týždňoch liečby sa odobrali pľúca každej myši.Obrázok 4B ukazuje makroskopické nádory pľúc u myší vo vyššie uvedených liečebných skupinách a obrázok 4C ukazuje reprezentatívny svetelný mikrosnímok reprezentatívneho nádoru.Čo sa týka nádorovej záťaže v každej skupine (obr. 4D), hodnoty pre myši liečené G-Rg3r a G-Rg3s boli 0,75 ± 0,29 mm3 a 0,81 ± 0,30 mm3, zatiaľ čo hodnoty pre G-myši liečené s -Rg3s boli 1,63 resp. ±0,40 mm3.kontrolné myši (p < 0,001), čo naznačuje, že liečba G-Rg3 znížila nádorovú záťaž u myší.Podávanie verapamilu ďalej posilnilo toto zníženie: hodnoty u verapamil+ G-Rg3r myší klesli z 0,75 ± 0,29 mm3 na 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01) a hodnoty verapamilu+ z 0,81 ± 0,30 mm3 klesli na 0,2. mm3 u myší liečených G.-Rg3s (p < 0,05), čo naznačuje, že verapamil môže zvýšiť inhibičný účinok G-Rg3 na tumorigenézu.Nádorová záťaž nepreukázala žiadne významné rozdiely medzi kontrolnou skupinou a verapamilovou skupinou, G-Rg3r a G-Rg3s skupinou a verapamil+G-Rg3r a verapamil+G-Rg3s skupinou.Okrem toho sa nevyskytli žiadne významné pečeňové alebo obličkové toxicity spojené s hodnotenými liečbami (obrázok 4E, F).
Nádorová záťaž po liečbe G-Rg3 a plazmatické alebo črevné hladiny G-Rg3r a G-Rg3 v uvedených skupinách.(A) Experimentálny dizajn.(B) Makroskopické nádory v myšom modeli.Nádory sú označené šípkami.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r v kombinácii s verapamilom.d: G-Rg3 v kombinácii s verapamilom.d: Verapamil.e: kontrola.(C) Optická mikrofotografia nádoru pri zväčšení.Odpoveď: 100x.b: 400X.(D) Účinok liečby G-Rg3 + verapamilom na nádorovú záťaž u A/J myší.(E) Hladiny pečeňového enzýmu ALT v plazme.(F) Plazmatické hladiny renálneho enzýmu Cr.(G) Plazmatické hladiny G-Rg3r alebo G-Rg3 uvedených skupín.(H) Hladiny G-Rg3r alebo G-Rg3s v črevách uvedených skupín.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka trojnásobných stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Hladiny G-Rg3 v modeli B(a)P-indukovanej rakoviny u myší boli hodnotené pomocou UPLC-MS/MS po 20-týždňovom liečebnom období podľa spôsobu opísaného v časti Metódy.Obrázky 4G a H ukazujú hladiny G-Rg3 v plazme a v čreve.Hladiny G-Rg3r v plazme boli 0,44 ± 0,32 μmol/l a zvýšili sa na 1,17 ± 0,47 μmol/l pri súbežnom podávaní verapamilu (p < 0,001), zatiaľ čo hladiny G-Rg3r v čreve boli 0,53 ± 0,08 μg/l.Pri kombinácii s verapamilom sa g zvýšilo na 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Pre G-Rg3 výsledky sledovali podobný vzor, čo naznačuje, že liečba verapamilom zvýšila orálnu biologickú dostupnosť G-Rg3 u A/J myší.
Test bunkovej životaschopnosti sa použil na vyhodnotenie cytotoxicity B(a)P a G-Rg3 na hEL bunkách.Cytotoxicita indukovaná B(a)P v hEL bunkách je znázornená na obrázku 5A, zatiaľ čo netoxické vlastnosti G-Rg3r a G-Rg3 sú znázornené na obrázkoch 5A a 5B.5B, C. Na vyhodnotenie cytoprotektívneho účinku G-Rg3 sa B(a)P súčasne podával s rôznymi koncentráciami G-Rg3r alebo G-Rg3 do buniek hEL.Ako je znázornené na obrázku 5D, G-Rg3r v koncentráciách 5 uM, 10 uM a 20 uM obnovil životaschopnosť buniek na 58,3 %, 79,3 % a 77,3 %.Podobné výsledky možno vidieť aj v skupine G-Rg3s.Keď koncentrácie G-Rg3 boli 5 uM, 10 uM a 20 uM, životaschopnosť buniek sa obnovila na 58,3 %, 72,7 % a 76,7 %, v danom poradí (obrázok 5E).).Prítomnosť aduktov BPDE-DNA sa merala pomocou súpravy ELISA.Naše výsledky ukázali, že hladiny aduktu BPDE-DNA boli zvýšené v skupine liečenej B(a)P v porovnaní s kontrolnou skupinou, ale v porovnaní so súčasnou liečbou G-Rg3 boli hladiny aduktu BPDE-DNA v skupine B(a)P B v liečenej skupine boli hladiny aduktov DNA významne znížené.Výsledky liečby samotným B(a)P sú znázornené na obrázku 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 pre G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 pre G-Rg3s, p < 0,001).
Životaschopnosť buniek a tvorba aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL ošetrených G-Rg3 a B(a)P.(A) Životaschopnosť buniek hEL ošetrených B(a)P.(B) Životaschopnosť buniek hEL ošetrených G-Rg3r.(C) Životaschopnosť buniek hEL ošetrených G-Rg3.(D) Životaschopnosť buniek hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3r.(E) Životaschopnosť buniek hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3.(F) Hladiny aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka trojnásobných stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Expresia enzýmu GST bola detegovaná po spoločnej liečbe s 10 uM B(a)P a 10 uM G-Rg3r alebo G-Rg3s.Naše výsledky ukázali, že B(a)P potlačil expresiu GST (59,7 ± 8,2 % v skupine G-Rg3r a 39 ± 4,5 % v skupine G-Rg3s) a B(a)P bol spojený buď s G-Rg3r alebo s G-Rg3r, alebo s G-Rg3r.Spoločná liečba s G-Rg3 obnovila expresiu GST.Expresia GST (103,7 ± 15,5 % v skupine G-Rg3r a 110 ± 11,1 % v skupine G-Rg3s, p < 0,05 a p < 0,001, v tomto poradí, obr. 6A, B a C).Aktivita GST bola hodnotená pomocou súpravy na testovanie aktivity.Naše výsledky ukázali, že skupina s kombinovanou liečbou mala vyššiu aktivitu GST v porovnaní so skupinou len s B(a)P (96,3 ± 6,6 % oproti 35,7 ± 7,8 % v skupine G-Rg3r oproti 92,3 ± 6,5 % v skupine G-Rg3r ).% oproti 35,7 ± 7,8 % v skupine G-Rg3s, p < 0,001, obrázok 6D).
Expresia GST a Nrf2 v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3.(A) Detekcia expresie GST pomocou Western blottingu.(B) Kvantitatívna expresia GST v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3r.(C) Kvantitatívna expresia GST v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3s.(D) Aktivita GST v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3.(E) Detekcia expresie Nrf2 pomocou Western blottingu.(F) Kvantitatívna expresia Nrf2 v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3r.(G) Kvantitatívna expresia Nrf2 v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3s.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka trojnásobných stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Na objasnenie dráh zapojených do G-Rg3-sprostredkovanej supresie B(a)P-indukovanej tumorigenézy sa expresia Nrf2 hodnotila pomocou Western blottingu.Ako je znázornené na obrázkoch 6E,F,G, v porovnaní s kontrolnou skupinou bola znížená iba hladina Nrf2 v skupine liečenej B(a)P;avšak v porovnaní s liečenou skupinou B(a)P boli hladiny B(a) Nrf2 v skupine PG-Rg3 zvýšené (106 ± 9,5 % pre G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6,2 % pre G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % pre G-Rg3s, p < 0,01).
Preventívnu úlohu Nrf2 sme potvrdili potlačením expresie Nrf2 pomocou špecifickej malej interferujúcej RNA (siRNA).Knockdown Nrf2 bol potvrdený Western blotovaním (obr. 7A,B).Ako je znázornené na obrázkoch 7C, D, spoločná liečba buniek hEL s B(a)P a G-Rg3 viedla k zníženiu počtu aduktov BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) v porovnaní s liečbou B(a)P samostatne v kontrolnej skupine siRNA.) G-Rg3r bol 4,13 ± 0,49, G-Rg3s bol 1,8 ± 0,32 a 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Avšak inhibičný účinok G-Rg3 na tvorbu BPDE-DNA bol zrušený knockdownom Nrf2.V skupine siNrf2 nebol žiadny významný rozdiel v tvorbe aduktu BPDE-DNA medzi súbežnou liečbou B(a)P a G-Rg3 a samotnou liečbou B(a)P (3,0 ± 0,21 pre G-Rg3r oproti 3,56 ± 0,32 ).pre G-Rg3r verzus 3,6 pre G-Rg3s verzus ± 0,45 verzus 4,0 ± 0,37, p > 0,05).
Účinok knockdownu Nrf2 na tvorbu aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL.(A) Knockdown Nrf2 bol potvrdený Western blotovaním.(B) Kvantifikácia intenzity pásma Nrf2.(C) Účinok knockdownu Nrf2 na hladiny aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3r.(D) Účinok knockdownu Nrf2 na hladiny aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL ošetrených B(a)P a G-Rg3.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka trojnásobných stanovení.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Táto štúdia hodnotila preventívne účinky rôznych extraktov červeného ženšenu na myšom modeli B(a)P-indukovanej rakoviny pľúc a liečba KRGB významne znížila nádorovú záťaž.Vzhľadom na to, že G-Rg3 má najvyšší obsah v tomto ženšenovom extrakte, bola študovaná dôležitá úloha tohto ginsenosidu pri inhibícii tumorigenézy.G-Rg3r aj G-Rg3 (dva epiméry G-Rg3) významne znížili nádorovú záťaž v myšom modeli B(a)P-indukovanej rakoviny.G-Rg3r a G-Rg3 majú protirakovinové účinky tým, že indukujú apoptózu nádorových buniek21, inhibujú rast nádoru22, zastavujú bunkový cyklus23 a ovplyvňujú angiogenézu24.Ukázalo sa tiež, že G-Rg3 inhibuje bunkové metastázy25 a schopnosť G-Rg3 zvyšovať účinky chemoterapie a rádioterapie bola zdokumentovaná26,27.Poon a kol. preukázali, že liečba G-Rg3 môže znížiť genotoxické účinky B(a)P28.Táto štúdia demonštruje terapeutický potenciál G-Rg3 pri zacielení na environmentálne karcinogénne molekuly a pri prevencii rakoviny.
Napriek ich dobrému profylaktickému potenciálu predstavuje slabá perorálna biologická dostupnosť ginsenosidov výzvu pre klinické použitie týchto molekúl.Farmakokinetická analýza perorálneho podávania ginsenosidov u potkanov ukázala, že ich biologická dostupnosť je stále nižšia ako 5 %29.Tieto testy ukázali, že po 20-týždňovom období liečby sa znížili iba hladiny Rg5 v krvi.Hoci základný mechanizmus zlej biologickej dostupnosti zostáva ešte objasniť, predpokladá sa, že P-gp sa podieľa na efluxe ginsenosidov.Táto práca prvýkrát preukázala, že podávanie verapamilu, blokátora P-gp, zvyšuje orálnu biologickú dostupnosť G-Rg3r a G-Rg3s.Toto zistenie teda naznačuje, že G-Rg3r a G-Rg3s pôsobia ako substráty P-gp na reguláciu jeho efluxu.
Táto práca ukazuje, že kombinovaná liečba verapamilom zvyšuje orálnu biologickú dostupnosť G-Rg3 na myšom modeli rakoviny pľúc.Toto zistenie je podporené zvýšeným intestinálnym transcelulárnym transportom G-Rg3 po blokáde P-gp, čím sa zvyšuje jeho absorpcia.Testy na bunkách Caco2 ukázali, že liečba verapamilom znížila eflux G-Rg3r a G-Rg3s a zároveň zlepšila priepustnosť membrány.Štúdia Yang a kol.Štúdie ukázali, že liečba cyklosporínom A (ďalší blokátor P-gp) zvyšuje biologickú dostupnosť ginsenosidu Rh2 z východiskovej hodnoty 1 %20 na viac ako 30 %.Ginsenozidové zlúčeniny K a Rg1 tiež vykazovali podobné výsledky30,31.Keď sa verapamil a cyklosporín A podávali súčasne, eflux zlúčeniny K v bunkách Caco-2 sa významne znížil z 26,6 na menej ako 3, zatiaľ čo jej intracelulárne hladiny sa zvýšili 40-násobne30.V prítomnosti verapamilu sa hladiny Rg1 zvýšili v potkaních pľúcnych epiteliálnych bunkách, čo naznačuje úlohu P-gp pri efluxe ginsenosidu, ako ukázali Meng et al.31.Verapamil však nemal rovnaký účinok na eflux niektorých ginsenosidov (ako sú Rg1, F1, Rh1 a Re), čo naznačuje, že nie sú ovplyvnené substrátmi P-gp, ako ukázali Liang et al.32.Toto pozorovanie môže súvisieť so zapojením iných transportérov a alternatívnych ginsenosidových štruktúr.
Mechanizmus preventívneho účinku G-Rg3 na rakovinu je nejasný.Predchádzajúce štúdie ukázali, že G-Rg3 zabraňuje poškodeniu DNA a apoptóze znížením oxidačného stresu a zápalu16, 33, čo môže byť základný mechanizmus prevencie tumorigenézy indukovanej B(a)P.Niektoré správy naznačujú, že genotoxicitu indukovanú B(a)P možno znížiť moduláciou enzýmov fázy II za vzniku BPDE-DNA34.GST je typický enzým fázy II, ktorý inhibuje tvorbu aduktu BPDE-DNA podporovaním väzby GSH na BPDE, čím sa znižuje poškodenie DNA vyvolané B(a)P35.Naše výsledky ukazujú, že ošetrenie G-Rg3 znižuje cytotoxicitu indukovanú B(a)P a tvorbu aduktu BPDE-DNA v bunkách hEL a obnovuje expresiu a aktivitu GST in vitro.Tieto účinky však chýbali v neprítomnosti Nrf2, čo naznačuje, že G-Rg3 indukuje cytoprotektívne účinky prostredníctvom dráhy Nrf2.Nrf2 je hlavným transkripčným faktorom pre detoxikačné enzýmy fázy II, ktorý podporuje klírens xenobiotík36.Aktivácia dráhy Nrf2 indukuje cytoprotekciu a znižuje poškodenie tkaniva37.Okrem toho niekoľko správ podporilo úlohu Nrf2 ako supresora nádoru pri karcinogenéze38.Naša štúdia ukazuje, že indukcia dráhy Nrf2 pomocou G-Rg3 hrá dôležitú regulačnú úlohu v genotoxicite indukovanej B(a)P tým, že spôsobuje detoxikáciu B(a)P aktiváciou enzýmov fázy II, čím inhibuje proces tumorigenézy.
Naša práca odhaľuje potenciál červeného ženšenu pri prevencii rakoviny pľúc vyvolanej B(a)P u myší prostredníctvom dôležitého zapojenia ginsenosidu G-Rg3.Zlá orálna biologická dostupnosť tejto molekuly bráni jej klinickej aplikácii.Táto štúdia však po prvýkrát ukazuje, že G-Rg3 je substrátom P-gp a podávanie inhibítora P-gp zvyšuje biologickú dostupnosť G-Rg3 in vitro a in vivo.G-Rg3 znižuje B(a)P-indukovanú cytotoxicitu reguláciou dráhy Nrf2, čo môže byť potenciálny mechanizmus jeho preventívnej funkcie.Naša štúdia potvrdzuje potenciál ginsenosidu G-Rg3 na prevenciu a liečbu rakoviny pľúc.
Šesťtýždňové samice myší A/J (20 ± 1 g) a 7 týždňov staré samce potkanov Wistar (250 ± 20 g) boli získané z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) a Wuhan Institute of Zoology.Univerzita (Wuhan, Čína).Čínske centrum zberu typových kultúr (Wuhan, Čína) nám poskytlo bunky Caco-2 a hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) je zdrojom B(a)P a trikaprinu.Purifikované ginsenosidy G-Rg3r a G-Rg3s, dimetylsulfoxid (DMSO), súprava na testovanie proliferácie CellTiter-96 (MTS), verapamil, minimálne esenciálne médium (MEM) a fetálne bovinné sérum (FBS) boli zakúpené od Chengdu Must Bio-Technology .Spol., s.r.o.(Chengdu, Čína).QIAamp DNA mini kit a BPDE-DNA adukt ELISA kit boli zakúpené od Qiagen (Stanford, CA, USA) a Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).Súprava na stanovenie aktivity GST a súprava na stanovenie celkového proteínu (štandardná metóda BCA) boli zakúpené od spoločnosti Solarbio (Peking, Čína).Všetky extrakty červeného ženšenu sú uložené v laboratóriu Mingyu 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Čína) a Korea Cancer Center (Soul, Kórea) sú komerčné zdroje extraktu CRG a rôznych extraktov červeného ženšenu rôzneho kórejského pôvodu (vrátane KRGA, KRGB a KRGC).Červený ženšen sa vyrába z koreňov 6-ročného čerstvého ženšenu.Extrakt z červeného ženšenu sa získava premytím ženšenu vodou trikrát, potom zahustením vodného extraktu a nakoniec sušením pri nízkej teplote, čím sa získa prášok z extraktu ženšenu.Protilátky (anti-Nrf2, anti-GST a β-aktín), anti-králičí imunoglobulín G (IgG) konjugovaný s chrenovou peroxidázou, transfekčné činidlo, kontrolná siRNA a Nrf2 siRNA boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Bunky Caco2 a hEL sa kultivovali v 100 mm2 bunkových kultivačných miskách s MEM obsahujúcim 10 % FBS pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére 5 % C02.Na stanovenie účinku podmienok liečby sa bunky hEL inkubovali s rôznymi koncentráciami B(a)P a G-Rg3 v MEM počas 48 hodín.Bunky môžu byť ďalej analyzované alebo zhromaždené na prípravu bezbunkových extraktov.
Všetky experimenty boli schválené Výborom pre etiku experimentálnych zvierat Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (č. schválenia 2019; registračné číslo 4587TH).Všetky experimenty sa uskutočňovali v súlade s príslušnými smernicami a predpismi a štúdia sa uskutočnila v súlade s usmerneniami Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE).Osemtýždňovým A/J myšiam sa najskôr intraperitoneálne injikoval B(a)P v roztoku trikaprinu (100 mg/kg, 0,2 ml).Po týždni boli myši náhodne rozdelené do kontrolných skupín a rôznych liečebných skupín, 15 myší v každej skupine, a raz denne im bola podávaná sonda.Po 20 týždňoch liečby boli zvieratá usmrtené asfyxiou CO2.Pľúca sa odobrali a fixovali na 24 hodín.Počet povrchových nádorov a jednotlivé veľkosti nádorov boli kvantifikované pre každé pľúca pod disekčným mikroskopom.Odhad objemu nádoru (V) sa vypočítal pomocou nasledujúceho výrazu: V (mm3) = 4/3πr3, kde r je priemer nádoru.Čistý súčet všetkých objemov nádorov v pľúcach myší predstavoval celkový objem nádoru a priemerný celkový objem nádoru v každej skupine predstavoval zaťaženie nádorom.Vzorky plnej krvi a čriev sa odobrali a skladovali pri -80 °C na stanovenie UPLC-MS/MS.Odobralo sa sérum a použil sa automatický chemický analyzátor na analýzu hladín alanínaminotransferázy (ALT) a sérového kreatinínu (Cr) na posúdenie funkcie pečene a obličiek.
Zozbierané vzorky boli vybraté z chladiaceho skladu, rozmrazené, odvážené a umiestnené do skúmaviek, ako je opísané vyššie.K tomu sa pridal 0,5 uM florizín (vnútorný štandard) v 0,8 ml roztoku metanolu.Tkanivo sa potom homogenizovalo použitím Tissue-Tearor a homogenát sa následne preniesol do 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky.Zmes sa centrifugovala pri 15 500 ot./min. počas 15 minút.Po odstránení 1,0 ml supernatantu sa vysuší dusíkom.Na regeneráciu sa použilo dvesto mikrolitrov metanolu.Krv sa odoberá a spracováva na jednej linke a používa sa ako referencia pre všetky merania.
24-jamkové doštičky Transwell sa naočkovali 1,0 x 105 Caco-2 buniek na jamku, aby sa vyhodnotilo potenciálne zvýšenie transportu G-Rg3 pridaním verapamilu.Po 3 týždňoch kultivácie boli bunky premyté HBSS a preinkubované pri 37 °C.400 μl 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s alebo zmes s 50 alebo 100 μM verapamilu) sa injikovalo na bazolaterálnu alebo apikálnu stranu monovrstvy a do druhej sa pridalo 600 μl roztoku HBSS. strane.Odoberte 100 µl kultivačného média v určených časoch (0, 15, 30, 45, 60, 90 a 120 minút) a pridajte 100 µl HBSS na doplnenie tohto objemu.Vzorky sa skladovali pri -4 °C až do detekcie pomocou UPLC-MS/MS.Výraz Papp = dQ/(dT × A × C0) sa používa na kvantifikáciu zjavnej jednosmernej apikálnej a bazolaterálnej permeability a naopak (Pa-b a Pb-a);dQ/dT je zmena koncentrácie, A (0,6 cm2) je povrchová plocha monovrstvy a C0 je počiatočná koncentrácia darcu.Pomer efluxu sa vypočíta ako Pb-a/Pa-b, čo predstavuje rýchlosť efluxu študovaného liečiva.
Samce krýs Wistar boli 24 hodín nalačno, pili iba vodu a anestetizovali intravenóznou injekciou 3,5 % roztoku pentobarbitalu.Intubovaná silikónová hadička má koniec dvanástnika ako vstup a koniec ilea ako výstup.Použite peristaltickú pumpu na čerpanie vstupu s 10 µM G-Rg3r alebo G-Rg3s v izotonickom HBSS pri prietoku 0,1 ml/min.Účinok verapamilu bol hodnotený pridaním 50 μM alebo 100 μM zlúčeniny k 10 μM G-Rg3r alebo G-Rg3s.UPLC-MS/MS sa uskutočnila na perfúznych extraktoch zozbieraných v časových bodoch 60, 90, 120 a 150 minút po začiatku perfúzie.Percento absorpcie sa kvantifikuje vzorcom % absorpcie = (1 – Cout/Cin) × 100 %;koncentrácia G-Rg3 na výstupe a vstupe je vyjadrená pomocou Cout a Cin.
hEL bunky sa naočkovali na 96-jamkové doštičky v hustote 1 x 104 buniek na jamku a ošetrili B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) alebo G-Rg3 rozpusteným v DMSO .Liečivá sa potom zriedili kultivačným médiom na rôzne koncentrácie (0, 1, 2, 5, 10, 20 uM) počas 48 hodín.Pomocou komerčne dostupnej testovacej súpravy MTS sa bunky podrobili štandardnému protokolu a potom sa merali pomocou čítačky mikrodoštičiek pri 490 nm.Úroveň životaschopnosti buniek v skupinách súčasne liečených B(a)P (10 uM) a G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 uM) bola hodnotená podľa vyššie uvedeného spôsobu a porovnaná s neošetrenou skupinou.
hEL bunky sa naočkovali na 6-jamkové platne v hustote 1 x 105 buniek/jamku a ošetrili 10 uMB (a) P v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 uM G-Rg3.Po 48 hodinách pôsobenia sa DNA extrahovala z buniek hEL pomocou súpravy QIAamp DNA Mini Kit podľa protokolu výrobcu.Tvorba aduktov BPDE-DNA sa detegovala pomocou súpravy ELISA aduktu BPDE-DNA.Relatívne hladiny aduktu BPDE-DNA sa merali pomocou čítačky mikrodoštičiek meraním absorbancie pri 450 nm.
Bunky hEL sa naočkovali na 96-jamkové platne v hustote 1 x 104 buniek na jamku a ošetrili 10 uMB (a) P v neprítomnosti alebo prítomnosti 10 uM G-Rg3 počas 48 hodín.Aktivita GST sa merala pomocou komerčnej súpravy na testovanie aktivity GST podľa protokolu výrobcu.Relatívna aktivácia GST sa merala absorbanciou pri 450 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek.
hEL bunky boli premyté ľadovo studeným PBS a potom lyzované s použitím rádioimunoprecipitačného testovacieho pufra obsahujúceho inhibítory proteázy a inhibítory fosfatázy.Po kvantifikácii proteínu pomocou súpravy na stanovenie celkového proteínu sa 30 ug proteínu v každej vzorke oddelilo pomocou 12 % SDS-PAGE a prenieslo sa na PVDF membránu elektroforézou.Membrány boli blokované 5% odstredeným mliekom a inkubované s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C.Po inkubácii so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou sa pridali zosilnené chemiluminiscenčné činidlá na vizualizáciu väzbového signálu.Intenzita každého proteínového pásu bola kvantifikovaná pomocou softvéru ImageJ.
Na analýzu všetkých údajov sa použil softvér GraphPad Prism 7.0 vyjadrený ako priemer ± štandardná odchýlka.Variácie medzi liečebnými skupinami sa hodnotili pomocou Studentovho t testu alebo jednosmernej analýzy rozptylu, s hodnotou P <0,05, čo naznačuje štatistickú významnosť.
Všetky údaje získané alebo analyzované počas tejto štúdie sú zahrnuté v tomto publikovanom článku a doplnkových informačných súboroch.
Torre, LA, Siegel, RL a Jemal, A. Štatistika rakoviny pľúc.príslovka.Platnosť vypršala.liek.biológia.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tabakové karcinogény, ich biomarkery a rakovina vyvolaná tabakom.Nat.Kaplán pre rakovinu.3, 733-744 (2003).
Phillips, DH a Venitt, S. DNA a proteínové adukty v ľudských tkanivách v dôsledku vystavenia tabakovému dymu.medzinárodnosť.J. Cancer.131, 2733 – 2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA a Yu M. Účinok Houttuynia cordata a silibinínu na benzo(a)pyrénom indukovanú tumorigenézu pľúc u A/J myší.Rakovina 7, 1053-1057 (2005).
Tang, W. a kol.Protirakovinový prírodný produkt izolovaný z čínskych liečivých materiálov.čeľusť.liek.6, 27 (2011).
Yang, Y. a kol.Účinnosť polyfenónu E, červeného ženšenu a rapamycínu na benzo(a)pyrénom indukovanú tumorigenézu pľúc u A/J myší.Cancer 8, 52-58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., On, TS a Yuan, KS Red, účasť na liečbe rakoviny.čeľusť.J. Nutt.liek.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS a Gao, L. Ginsenosides v koreňoch a listoch amerického ženšenu.J. Agric.Chémia potravín.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA a Yuan KS Farmakológia ženšenu: veľa zložiek a veľa účinkov.biochémia.farmakológie.58, 1685-1693 (1999).
Čas odoslania: 17. september 2023