Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljše rezultate priporočamo uporabo novejše različice brskalnika (ali izklop načina združljivosti v Internet Explorerju).Medtem, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez oblikovanja ali JavaScripta.
Rdeči ginseng se v tradicionalni azijski medicini uporablja že več sto let.V tej študiji smo ovrednotili sposobnost štirih vrst rdečega ginsenga (kitajski rdeči ginseng, korejski rdeči ginseng A, korejski rdeči ginseng B in korejski rdeči ginseng C), gojenih v različnih regijah, da zavirajo nastanek in rast pljuč, ki jih povzročajo rakotvorne snovi. tumorji.Test benzo(a)pirena (B(a)P) je bil izveden na miših A/J in korejski rdeči ginseng B je bil najučinkovitejši pri zmanjševanju tumorskega bremena med štirimi sortami rdečega ginsenga.Poleg tega smo analizirali vsebnost različnih ginsenozidov (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 in Rg5) v štirih izvlečkih rdečega ginsenga in ugotovili, da ima korejski rdeči ginseng B najvišje ravni ginsenozida Rg3 (G-Rg3), kar kaže, da ima lahko G-Rg3 pomembno vlogo pri njegovi terapevtski učinkovitosti.To delo kaže, da ima G-Rg3 relativno nizko biološko uporabnost.Ko pa je bil G-Rg3 dajan sočasno z zaviralcem P-gp verapamilom, se je izliv G-Rg3 v celice Caco-2 zmanjšal, stopnja absorpcije G-Rg3 v črevesju se je povečala v podganjem modelu in G-Rg3 je bil povečan.V celicah Caco-2 se odtok Rg3 zmanjša, raven koncentracije Rg3 pa se zmanjša.G-Rg3 se poveča v črevesju in plazmi, njegova sposobnost preprečevanja tumorjev pa je povečana tudi pri podganjem modelu tumorigeneze, ki jo povzroči B(a)P.Ugotovili smo tudi, da je G-Rg3 zmanjšal citotoksičnost, ki jo povzroči B(a)P, in tvorbo adukta DNA v človeških pljučnih celicah ter obnovil izražanje in aktivnost encimov faze II prek poti Nrf2, kar je lahko povezano s potencialnim mehanizmom delovanja inhibicije G -Rg3..O pojavu pljučnih tumorjev.Naša študija dokazuje potencialno pomembno vlogo G-Rg3 pri ciljanju na pljučne tumorje pri mišjih modelih.Peroralna biološka uporabnost tega ginsenosida je povečana z usmerjanjem na P-glikoprotein, kar molekuli omogoča, da deluje proti raku.
Najpogostejša vrsta pljučnega raka je nedrobnocelični pljučni rak (NSCLC), ki je eden glavnih vzrokov smrti zaradi raka na Kitajskem in v Severni Ameriki1,2.Glavni dejavnik, ki poveča tveganje za nastanek nedrobnoceličnega pljučnega raka, je kajenje.Cigaretni dim vsebuje več kot 60 rakotvornih snovi, vključno z benzo(a)pirenom (B(a)P), nitrozamini in radioaktivnimi izotopi, ki nastanejo pri razpadu radona.3 Policiklični aromatski ogljikovodiki B(a)P so glavni vzrok za strupenost v cigaretah. dim.Po izpostavitvi B(a)P ga citokrom P450 pretvori v B(a)P-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid (BPDE), ki reagira z DNA in tvori adukt BPDE-DNA 4. Poleg tega ti adukti inducirajo tumorigenezo pljuč pri miših s stopnjo tumorja in histopatologijo, podobno človeškim pljučnim tumorjem5.Zaradi te lastnosti je model pljučnega raka, ki ga povzroča B(a)P, primeren sistem za ocenjevanje spojin z možnimi lastnostmi proti raku.
Ena od možnih strategij za preprečevanje razvoja pljučnega raka pri skupinah z visokim tveganjem, zlasti pri kadilcih, je uporaba kemopreventivnih sredstev za zatiranje razvoja intraepitelnih neoplastičnih lezij in s tem preprečevanje njihovega kasnejšega napredovanja v malignost.Študije na živalih kažejo, da so različna kemopreventivna sredstva učinkovita6.Naše prejšnje poročilo7 je poudarilo dobre preventivne učinke rdečega ginsenga na pljučni rak.To zelišče se že stoletja uporablja v tradicionalni azijski medicini za podaljševanje življenja in zdravja, dokumentirano pa ima tudi protitumorske učinke8.
Aktivni faktor ginsenga je ginsenozid, ki se uporablja kot sestavljeni marker za oceno kakovosti izvlečkov ginsenga.Kvantitativna analiza surovih izvlečkov ginsenga običajno vključuje uporabo več ginsenozidov, vključno z RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 in Rc9,10.Ginsenozidi imajo malo klinične uporabe zaradi zelo slabe peroralne biološke uporabnosti11.Čeprav mehanizem za to slabo biološko uporabnost ni jasen, je lahko vzrok izliv ginsenozidov, ki ga povzroča P-glikoprotein (P-gp)12.P-gp je eden najpomembnejših efluksnih prenašalcev v superdružini kasetnih transporterjev, ki vežejo ATP, ki uporablja energijo hidrolize ATP za sproščanje znotrajceličnih snovi v zunanje okolje.Prenašalci P-gp so običajno široko porazdeljeni v črevesju, ledvicah, jetrih in krvno-možganski pregradi13.P-gp ima ključno vlogo pri absorpciji v črevesju, inhibicija P-gp pa poveča peroralno absorpcijo in razpoložljivost nekaterih zdravil proti raku 12,14.Primera inhibitorjev, ki so bili predhodno uporabljeni v literaturi, sta verapamil in ciklosporin A15.To delo vključuje vzpostavitev mišjega sistema za preučevanje pljučnega raka, ki ga povzroča B(a)P, da bi ocenili sposobnost različnih izvlečkov rdečega ginsenga iz Kitajske in Koreje, da vplivajo na maligne bolezni.Ekstrakti so bili individualno analizirani, da bi identificirali specifične ginsenozide, ki lahko vplivajo na rakotvornost.Verapamil je bil nato uporabljen za ciljanje na P-gp in izboljšanje peroralne biološke uporabnosti in terapevtske učinkovitosti ginsenozidov, usmerjenih proti raku.
Mehanizem, s katerim imajo saponini ginsenga terapevtske učinke na karcinogenezo, ostaja nejasen.Raziskave so pokazale, da lahko različni ginsenozidi zmanjšajo poškodbe DNK, ki jih povzročajo rakotvorne snovi, tako da zmanjšajo oksidativni stres in aktivirajo encime za razstrupljanje faze II, s čimer preprečijo poškodbe celic.Glutation S-transferaza (GST) je tipičen encim faze II, ki je potreben za zmanjšanje poškodb DNK, ki jih povzročajo rakotvorne snovi17.Z jedrskim eritroidom 2 povezan faktor 2 (Nrf2) je pomemben transkripcijski faktor, ki uravnava redoks homeostazo in aktivira izražanje encimov faze II in citoprotektivnih antioksidativnih odzivov18.Naša študija je preučevala tudi učinke identificiranih ginsenozidov na zmanjšanje citotoksičnosti, povzročene z B(a)P, in tvorbo adukta BPDE-DNA, kot tudi na indukcijo encimov faze II z modulacijo poti Nrf2 v normalnih pljučnih celicah.
Vzpostavitev mišjega modela raka, ki ga povzroči B(a)P, je skladna s prejšnjim delom5.Slika 1A prikazuje eksperimentalno zasnovo 20-tedenskega zdravljenja mišjega modela raka, ki ga povzročajo B(a)P, voda (kontrola), ekstrakt kitajskega rdečega ginsenga (CRG), ekstrakt korejskega rdečega ginsenga A (KRGA) in korejski rdeči ginseng.Izvleček B (KRGB) in izvleček korejskega rdečega ginsenga C (KRGC).Po 20 tednih zdravljenja z rdečim ginsengom so miši žrtvovali z zadušitvijo s CO2.Slika 1B prikazuje makroskopske pljučne tumorje pri živalih, zdravljenih z različnimi vrstami rdečega ginsenga, slika 1C pa prikazuje reprezentativni svetlobni mikrograf vzorca tumorja.Obremenitev s tumorjem pri živalih, zdravljenih s KRGB (1,5 ± 0,35), je bila manjša kot pri kontrolnih živalih (0,82 ± 0,2, P <0,05), kot je prikazano na sliki 1D.Povprečna stopnja inhibicije tumorske obremenitve je bila 45 %.Drugi testirani izvlečki rdečega ginsenga niso pokazali tako pomembnih sprememb v obremenitvi tumorja (P > 0,05).Pri mišjem modelu v 20 tednih zdravljenja z rdečim ginsengom niso opazili očitnih stranskih učinkov, vključno z nobeno spremembo telesne teže (podatki niso prikazani) in brez toksičnosti za jetra ali ledvice (slika 1E, F).
Izvleček rdečega ginsenga zdravi razvoj pljučnega tumorja pri A/J miših.(A) Eksperimentalna zasnova.(B) Veliki pljučni tumorji v mišjem modelu.Tumorji so označeni s puščicami.a: skupina kitajskega rdečega ginsenga.b: skupina A korejskega rdečega ginsenga.c: skupina korejskega rdečega ginsenga B. d: skupina korejskega rdečega ginsenga C. d: kontrolna skupina.(C) Svetlobni mikrograf, ki prikazuje pljučni tumor.Povečava: 100. b: 400. (D) Obremenitev tumorja v skupini ekstrakta rdečega ginsenga.(E) Plazemske ravni jetrnega encima ALT.(F) Plazemske ravni ledvičnega encima Cr.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon.*P <0,05.
Ekstrakti rdečega ginsenga, identificirani v tej študiji, so bili analizirani s tandemsko masno spektrometrijo ultra zmogljive tekočinske kromatografije (UPLC-MS/MS), da so kvantificirali naslednje ginsenozide: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 in Rg5.Pogoji UPLC in MS, uporabljeni za merjenje analitov, so bili opisani v prejšnjem poročilu19.UPLC-MS/MS kromatogrami štirih izvlečkov rdečega ginsenga so prikazani na sliki 2A.V skupni vsebnosti ginsenozida so bile pomembne razlike, pri čemer je bila najvišja skupna vsebnost ginsenozida v CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (slika 2B).Pri ocenjevanju posameznih ginsenozidov (slika 2C) je KRGB pokazal najvišjo raven G-Rg3 v primerjavi z drugimi ginsenozidi (58,33 ± 3,81 μmol/L za G-Rg3s in 41,56 ± 2,88 μmol/L za G -Rg3r).L).vrsta rdečega ginsenga (P <0,001).G-Rg3 se pojavlja kot par stereoizomerov G-Rg3r in G-Rg3s, ki se razlikujeta po položaju hidroksilne skupine pri ogljiku 20 (slika 2D).Rezultati kažejo, da imata lahko G-Rg3r ali G-Rg3 pomemben potencial proti raku v mišjem modelu raka, ki ga povzroči B(a)P.
Vsebnost ginsenozidov v različnih ekstraktih rdečega ginsenga.(A) UPLC-MS/MS kromatogrami štirih izvlečkov rdečega ginsenga.(B) Ocena celotne vsebnosti ginsenozida v navedenih izvlečkih.(C) Odkrivanje posameznih ginsenozidov v označenih izvlečkih.(D) Strukture stereoizomerov ginsenozida G-Rg3r in G-Rg3s.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon trojnih določitev.***P <0,001.
Študija UPLC-MS/MS je zahtevala kvantifikacijo ginsenozidov v vzorcih črevesja in krvi po 20 tednih zdravljenja.Zdravljenje s KRGB je pokazalo le 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 v krvi.Preostalih ginsenozidov ni bilo zaznati, kar kaže na slabo peroralno biološko uporabnost in zato zmanjšano izpostavljenost tem ginsenozidom.
Celična linija adenokarcinoma debelega črevesa Caco-2 je morfološko in biokemično podobna človeškim črevesnim epitelnim celicam, kar dokazuje njeno uporabnost pri ocenjevanju transporta enterocitov čez črevesno epitelijsko pregrado.Ta analiza je temeljila na prejšnji študiji 20 .Slike 3A, B, C, D, E, F prikazujejo reprezentativne slike transceličnega transporta G-Rg3r in G-Rg3 z uporabo enoplastnega modela Caco-2.Transcelularni transport G-Rg3r ali G-Rg3 čez monosloje Caco-2 od bazolateralne do apikalne strani (Pb-a) je bil bistveno večji kot od apikalne do bazolateralne strani (Pa-b).Za G-Rg3r je bila povprečna vrednost Pa-b 0,38 ± 0,06, ki se je povečala na 0,73 ± 0,06 po zdravljenju s 50 μmol/L verapamila in na 1,14 ± 0,09 po zdravljenju s 100 μmol/L verapamila (p < 0,01 in 0,001, slika 2).3A).Opazovanja za G-Rg3 so sledila podobnemu vzorcu (slika 3B) in rezultati so pokazali, da je zdravljenje z verapamilom povečalo transport G-Rg3r in G-Rg3.Zdravljenje z verapamilom je povzročilo tudi znatno zmanjšanje povprečnih iztočnih razmerij Pb-a ter G-Rg3r in G-Rg3s (slika 3C, D, E, F), kar kaže, da zdravljenje z verapamilom zmanjša vsebnost ginsenozida v iztočnih celicah Caco-2..
Transcelularni transport G-Rg3 v monoslojih Caco-2 in črevesna absorpcija v perfuzijskem testu pri podganah.(A) Vrednost Pa-b skupine G-Rg3r v monosloju Caco-2.(B) Vrednost Pa-b skupin G-Rg3s v monosloju Caco-2.(C) Pb vrednost skupine G-Rg3r v monosloju Caco-2.(D) Pb vrednost skupin G-Rg3s v monosloju Caco-2.(E) Razmerje izkoristka skupin G-Rg3r v monosloju Caco-2.(F) Razmerje izkoristka skupin G-Rg3 v monosloju Caco-2.(G) Odstotek črevesne absorpcije G-Rg3r v perfuzijskem testu pri podganah.(H) Odstotek črevesne absorpcije G-Rg3 v perfuzijskem testu pri podganah.Primerjali smo prepustnost in absorpcijo brez dodatka verapamila.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon petih neodvisnih poskusov.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
V skladu s prejšnjim delom20 je bila izvedena ortotopna intestinalna perfuzija podgan, da se ugotovi, ali se absorpcija G-Rg3 v črevesju poveča po zdravljenju z verapamilom.Slike 3G, H prikazujejo reprezentativne perfuzijske teste za oceno odstotka črevesne absorpcije G-Rg3r in G-Rg3 pri podganah z modelom raka v zgornjih časovnih obdobjih.Začetni odstotek šibkega privzema G-Rg3r približno 10 % se je povečal na več kot 20 % po zdravljenju s 50 μM verapamila in na več kot 25 % po zdravljenju s 100 μM verapamila.Podobno je G-Rg3, ki je imel začetni privzem 10 %, prav tako pokazal vrh več kot 20 % po zdravljenju s 50 μM verapamila in skoraj 30 % po zdravljenju s 100 μM verapamila, kar kaže na to, da inhibicija P-gp z verapamilom poveča črevesna G-absorpcija Rg3 v mišjem modelu pljučnega raka.
V skladu z zgornjo metodo so miši modela raka, povzročenega z B(a)P, naključno razdelili v šest skupin, kot je prikazano na sliki 4A.V skupini, ki je prejemala G-Rg3, v primerjavi s kontrolno skupino niso opazili pomembne izgube teže ali kliničnih znakov toksičnosti (podatki niso prikazani).Po 20 tednih zdravljenja so bila zbrana pljuča vsake miši.Slika 4B prikazuje makroskopske pljučne tumorje pri miših v zgornjih zdravljenih skupinah, slika 4C pa prikazuje reprezentativni svetlobni mikrograf reprezentativnega tumorja.Kar zadeva obremenitev tumorja v vsaki skupini (slika 4D), so bile vrednosti za miši, zdravljene z G-Rg3r in G-Rg3s, 0,75 ± 0,29 mm3 oziroma 0,81 ± 0,30 mm3, medtem ko so bile vrednosti za G miši, zdravljene z z -Rg3s so bili 1,63 oziroma ±0,40 mm3.kontrolnih miših (p <0,001), kar kaže, da je zdravljenje z G-Rg3 zmanjšalo obremenitev tumorja pri miših.Dajanje verapamila je to znižanje še povečalo: vrednosti pri miših verapamil+ G-Rg3r so se znižale z 0,75 ± 0,29 mm3 na 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), vrednosti za verapamil+ z 0,81 ± 0,30 mm3 pa so se zmanjšale na 0,29 ± 0,21 mm3 pri miših, zdravljenih z G. -Rg3s (p < 0,05), kar kaže, da lahko verapamil poveča zaviralni učinek G-Rg3 na tumorigenezo.Tumorsko breme ni pokazalo pomembnih razlik med kontrolno skupino in skupino z verapamilom, skupino z G-Rg3r in skupino z G-Rg3s ter skupino z verapamilom + G-Rg3r in skupino z verapamilom + G-Rg3s.Poleg tega ni bilo pomembnih toksičnosti za jetra ali ledvice, povezanih z ocenjenimi zdravljenji (slika 4E, F).
Tumorsko breme po zdravljenju z G-Rg3 in ravni G-Rg3r in G-Rg3 v plazmi ali črevesju v navedenih skupinah.(A) Eksperimentalna zasnova.(B) Makroskopski tumorji v mišjem modelu.Tumorji so označeni s puščicami.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r v kombinaciji z verapamilom.d: G-Rg3 v kombinaciji z verapamilom.d: Verapamil.e: nadzor.(C) Optični mikrograf tumorja pri povečavi.Odgovor: 100x.b: 400X.(D) Vpliv zdravljenja z G-Rg3 + verapamilom na obremenitev tumorja pri miših A/J.(E) Plazemske ravni jetrnega encima ALT.(F) Plazemske ravni ledvičnega encima Cr.(G) Plazemske ravni G-Rg3r ali G-Rg3 navedenih skupin.(H) Ravni G-Rg3r ali G-Rg3s v črevesju navedenih skupin.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon trojnih določitev.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ravni G-Rg3 pri modelih miših z B(a)P-induciranim rakom so bile ocenjene z UPLC-MS/MS po 20-tedenskem obdobju zdravljenja v skladu z metodo, opisano v razdelku Metode.Sliki 4G in H prikazujeta ravni G-Rg3 v plazmi in črevesju.Koncentracije G-Rg3r v plazmi so bile 0,44 ± 0,32 μmol/L in so se ob sočasnem jemanju verapamila povečale na 1,17 ± 0,47 μmol/L (p < 0,001), ravni G-Rg3r v črevesju pa 0,53 ± 0,08 µg/l.V kombinaciji z verapamilom se je g povečal na 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).Za G-Rg3 so rezultati sledili podobnemu vzorcu, kar kaže, da je zdravljenje z verapamilom povečalo peroralno biološko uporabnost G-Rg3 pri miših A/J.
Test viabilnosti celic je bil uporabljen za oceno citotoksičnosti B(a)P in G-Rg3 na celicah hEL.Citotoksičnost, ki jo povzroči B(a)P v celicah hEL, je prikazana na sliki 5A, medtem ko so netoksične lastnosti G-Rg3r in G-Rg3 prikazane na slikah 5A in 5B.5B, C. Za ovrednotenje citoprotektivnega učinka G-Rg3 smo B(a)P dajali sočasno z različnimi koncentracijami G-Rg3r ali G-Rg3 v celice hEL.Kot je prikazano na sliki 5D, je G-Rg3r pri koncentracijah 5 μM, 10 μM in 20 μM obnovil viabilnost celic na 58,3 %, 79,3 % oziroma 77,3 %.Podobne rezultate lahko vidimo tudi v skupini G-Rg3s.Ko so bile koncentracije G-Rg3s 5 µM, 10 µM in 20 µM, je bila viabilnost celic obnovljena na 58,3 %, 72,7 % oziroma 76,7 % (slika 5E).).Prisotnost aduktov BPDE-DNA smo izmerili s kompletom ELISA.Naši rezultati so pokazali, da so bile ravni adukta BPDE-DNA povečane v skupini, zdravljeni z B(a)P, v primerjavi s kontrolno skupino, vendar so bile v primerjavi s sočasnim zdravljenjem z G-Rg3 ravni adukta BPDE-DNA v skupini z B(a)P B v zdravljeni skupini so bile ravni aduktov DNA znatno zmanjšane.Rezultati zdravljenja samo z B(a)P so prikazani na sliki 5F (1,87 ± 0,33 v primerjavi s 3,77 ± 0,42 za G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 v primerjavi s 3,77 ± 0,42 za G -Rg3s, p < 0,001).
Viabilnost celic in tvorba adukta BPDE-DNA v celicah hEL, obdelanih z G-Rg3 in B(a)P.(A) Sposobnost preživetja celic hEL, obdelanih z B(a)P.(B) Sposobnost preživetja celic hEL, obdelanih z G-Rg3r.(C) Sposobnost preživetja celic hEL, obdelanih z G-Rg3.(D) Sposobnost preživetja celic hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3r.(E) Sposobnost preživetja celic hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3.(F) Ravni adukta BPDE-DNA v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon trojnih določitev.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ekspresija encima GST je bila odkrita po sočasnem zdravljenju z 10 μM B(a)P in 10 μM G-Rg3r ali G-Rg3s.Naši rezultati so pokazali, da je B(a)P zaviral ekspresijo GST (59,7 ± 8,2 % v skupini G-Rg3r in 39 ± 4,5 % v skupini G-Rg3s), B(a)P pa je bil povezan bodisi z G-Rg3r , ali z G-Rg3r ali z G-Rg3r.Sočasno zdravljenje z G-Rg3s je obnovilo izražanje GST.Izražanje GST (103,7 ± 15,5 % v skupini G-Rg3r in 110 ± 11,1 % v skupini G-Rg3s, p <0,05 oziroma p <0,001, sl. 6A, B in C).Aktivnost GST je bila ocenjena s kompletom za testiranje aktivnosti.Naši rezultati so pokazali, da je imela skupina kombiniranega zdravljenja višjo aktivnost GST v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo B(a)P (96,3 ± 6,6 % v primerjavi s 35,7 ± 7,8 % v skupini G-Rg3r v primerjavi z 92,3 ± 6,5 v skupini G-Rg3r ).% v primerjavi s 35,7 ± 7,8 % v skupini G-Rg3s, p < 0,001, slika 6D).
Izražanje GST in Nrf2 v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3.(A) Odkrivanje ekspresije GST z Western blotom.(B) Kvantitativna ekspresija GST v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3r.(C) Kvantitativna ekspresija GST v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3s.(D) Aktivnost GST v celicah hEL, zdravljenih z B(a)P in G-Rg3.(E) Odkrivanje ekspresije Nrf2 z Western blotom.(F) Kvantitativna ekspresija Nrf2 v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3r.(G) Kvantitativna ekspresija Nrf2 v celicah hEL, obdelanih z B(a)P in G-Rg3s.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon trojnih določitev.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Za razjasnitev poti, vključenih v supresijo tumorigeneze, ki jo povzroča G-Rg3, je bila ekspresija Nrf2 ocenjena z Western blottingom.Kot je prikazano na slikah 6E, F, G, se je v primerjavi s kontrolno skupino znižala le raven Nrf2 v zdravljeni skupini z B(a)P;vendar so bile v primerjavi s skupino, zdravljeno z B(a)P, ravni B(a) Nrf2 v skupini PG-Rg3 povečane (106 ± 9,5 % za G-Rg3r v primerjavi z 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6,2 % za G-Rg3r v primerjavi z 41 ± 9,8 % za G-Rg3s, p < 0,01).
Potrdili smo preventivno vlogo Nrf2 z zatiranjem izražanja Nrf2 z uporabo specifične majhne moteče RNA (siRNA).Knockdown Nrf2 je bil potrjen z Western blottingom (sl. 7A, B).Kot je prikazano na slikah 7C,D, je sočasno zdravljenje celic hEL z B(a)P in G-Rg3 povzročilo zmanjšanje števila aduktov BPDE-DNA (1,47 ± 0,21) v primerjavi z zdravljenjem z B(a)P sam v kontrolni skupini siRNA.) G-Rg3r je bil 4,13 ± 0,49, G-Rg3s je bil 1,8 ± 0,32 in 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Vendar pa je bil zaviralni učinek G-Rg3 na tvorbo BPDE-DNA odpravljen s knockdownom Nrf2.V skupini siNrf2 ni bilo pomembne razlike v tvorbi adukta BPDE-DNA med sočasnim zdravljenjem z B(a)P in G-Rg3 ter samim zdravljenjem z B(a)P (3,0 ± 0,21 za G-Rg3r v primerjavi s 3,56 ± 0,32 ).za G-Rg3r v primerjavi s 3,6 za G-Rg3s v primerjavi z ±0,45 v primerjavi s 4,0±0,37, p > 0,05).
Učinek knockdowna Nrf2 na tvorbo adukta BPDE-DNA v celicah hEL.(A) Knockdown Nrf2 je bil potrjen z Western blottingom.(B) Kvantifikacija intenzivnosti pasu Nrf2.(C) Učinek knockdowna Nrf2 na ravni adukta BPDE-DNA v celicah hEL, zdravljenih z B(a)P in G-Rg3r.(D) Učinek knockdowna Nrf2 na ravni adukta BPDE-DNA v celicah hEL, zdravljenih z B(a)P in G-Rg3.Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon trojnih določitev.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ta študija je ovrednotila preventivne učinke različnih izvlečkov rdečega ginsenga na mišjem modelu pljučnega raka, povzročenega z B(a)P, zdravljenje s KRGB pa je bistveno zmanjšalo obremenitev tumorja.Glede na to, da ima G-Rg3 najvišjo vsebnost v tem izvlečku ginsenga, je bila raziskana pomembna vloga tega ginsenozida pri zaviranju tumorigeneze.Tako G-Rg3r kot G-Rg3 (dva epimera G-Rg3) sta znatno zmanjšala obremenitev tumorja v mišjem modelu raka, ki ga povzroči B(a)P.G-Rg3r in G-Rg3 delujeta proti raku tako, da inducirata apoptozo tumorskih celic21, zavirata rast tumorja22, zaustavita celični cikel23 in vplivata na angiogenezo24.Pokazalo se je tudi, da G-Rg3 zavira celične metastaze25, in sposobnost G-Rg3, da poveča učinke kemoterapije in radioterapije, je bila dokumentirana26,27.Poon in drugi so dokazali, da lahko zdravljenje z G-Rg3 zmanjša genotoksične učinke B(a)P28.Ta študija prikazuje terapevtski potencial G-Rg3 pri usmerjanju okoljskih rakotvornih molekul in preprečevanju raka.
Kljub njihovemu dobremu profilaktičnemu potencialu predstavlja slaba peroralna biološka uporabnost ginsenozidov izziv za klinično uporabo teh molekul.Farmakokinetična analiza peroralnega dajanja ginsenozidov pri podganah je pokazala, da je njegova biološka uporabnost še vedno manjša od 5 %29.Ti testi so pokazali, da so se po 20-tedenskem obdobju zdravljenja znižale samo ravni Rg5 v krvi.Čeprav osnovni mehanizem slabe biološke uporabnosti še ni pojasnjen, se domneva, da je P-gp vpleten v iztok ginsenozidov.To delo je prvič pokazalo, da dajanje verapamila, blokatorja P-gp, poveča peroralno biološko uporabnost G-Rg3r in G-Rg3s.Tako ta ugotovitev nakazuje, da G-Rg3r in G-Rg3 delujeta kot substrata P-gp za uravnavanje njegovega iztoka.
To delo dokazuje, da kombinirano zdravljenje z verapamilom poveča peroralno biološko uporabnost G-Rg3 v mišjem modelu pljučnega raka.To ugotovitev podpira povečan črevesni transcelularni transport G-Rg3 po blokadi P-gp, s čimer se poveča njegova absorpcija.Testi v celicah Caco2 so pokazali, da je zdravljenje z verapamilom zmanjšalo iztok G-Rg3r in G-Rg3s, hkrati pa izboljšalo prepustnost membrane.Študija Yang et al.Študije so pokazale, da zdravljenje s ciklosporinom A (drugim zaviralcem P-gp) poveča biološko uporabnost ginsenozida Rh2 z izhodiščne vrednosti 1 %20 na več kot 30 %.Ginsenozidne spojine K in Rg1 so prav tako pokazale podobne rezultate30,31.Pri sočasni uporabi verapamila in ciklosporina A se je iztok spojine K v celicah Caco-2 znatno zmanjšal s 26,6 na manj kot 3, medtem ko so se njene znotrajcelične ravni povečale za 40-krat30.V prisotnosti verapamila so se ravni Rg1 povečale v epitelijskih celicah pljuč podgan, kar kaže na vlogo P-gp pri izlivu ginsenozida, kot so pokazali Meng et al.31.Vendar pa verapamil ni imel enakega učinka na iztok nekaterih ginsenozidov (kot so Rg1, F1, Rh1 in Re), kar kaže, da nanje ne vplivajo substrati P-gp, kot so pokazali Liang et al.32.Ta ugotovitev je lahko povezana z vpletenostjo drugih prenašalcev in alternativnih struktur ginsenozida.
Mehanizem preventivnega učinka G-Rg3 na raka ni jasen.Prejšnje študije so pokazale, da G-Rg3 preprečuje poškodbe DNA in apoptozo z zmanjšanjem oksidativnega stresa in vnetja 16, 33, kar je lahko osnovni mehanizem za preprečevanje tumorigeneze, ki jo povzroča B(a)P.Nekatera poročila kažejo, da je genotoksičnost, ki jo povzroča B(a)P, mogoče zmanjšati z modulacijo encimov faze II, da se tvori BPDE-DNA34.GST je tipičen encim faze II, ki zavira tvorbo adukta BPDE-DNA s spodbujanjem vezave GSH na BPDE, s čimer zmanjša poškodbe DNA, ki jih povzroči B(a)P35.Naši rezultati kažejo, da zdravljenje z G-Rg3 zmanjša citotoksičnost, ki jo povzroči B(a)P, in tvorbo adukta BPDE-DNA v celicah hEL ter obnovi ekspresijo in aktivnost GST in vitro.Vendar pa teh učinkov ni bilo v odsotnosti Nrf2, kar kaže na to, da G-Rg3 inducira citoprotektivne učinke prek poti Nrf2.Nrf2 je glavni transkripcijski faktor za razstrupljevalne encime faze II, ki pospešuje očistek ksenobiotikov36.Aktivacija poti Nrf2 inducira citoprotekcijo in zmanjša poškodbe tkiva37.Poleg tega je več poročil podprlo vlogo Nrf2 kot tumorskega supresorja pri karcinogenezi38.Naša študija kaže, da ima indukcija poti Nrf2 z G-Rg3 pomembno regulativno vlogo pri genotoksičnosti, ki jo povzroči B(a)P, tako da povzroči razstrupljanje B(a)P z aktiviranjem encimov faze II, s čimer zavira proces tumorigeneze.
Naše delo razkriva potencial rdečega ginsenga pri preprečevanju pljučnega raka, ki ga povzroči B(a)P, pri miših s pomembno vpletenostjo ginsenozida G-Rg3.Slaba peroralna biološka uporabnost te molekule ovira njeno klinično uporabo.Vendar pa ta študija prvič kaže, da je G-Rg3 substrat P-gp in dajanje zaviralca P-gp poveča biološko uporabnost G-Rg3 in vitro in in vivo.G-Rg3 zmanjša citotoksičnost, ki jo povzroči B(a)P, z uravnavanjem poti Nrf2, kar je lahko potencialni mehanizem za njegovo preventivno delovanje.Naša študija potrjuje potencial ginsenozida G-Rg3 za preprečevanje in zdravljenje pljučnega raka.
Šest tednov stare samice miši A/J (20 ± 1 g) in 7 tednov stare samce podgan Wistar (250 ± 20 g) so pridobili iz laboratorija Jackson (Bar Harbor, ZDA) in Inštituta za zoologijo Wuhan.Univerza (Wuhan, Kitajska).Zbirni center za kitajske tipske kulture (Wuhan, Kitajska) nam je priskrbel celice Caco-2 in hEL.Sigma-Aldrich (St. Louis, ZDA) je vir B(a)P in trikaprina.Prečiščeni ginsenozidi G-Rg3r in G-Rg3s, dimetil sulfoksid (DMSO), komplet za testiranje proliferacije CellTiter-96 (MTS), verapamil, minimalni esencialni medij (MEM) in fetalni goveji serum (FBS) so bili kupljeni pri Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Kitajska).Mini komplet QIAamp DNA in komplet ELISA z dodatkom BPDE-DNA sta bila kupljena pri Qiagenu (Stanford, CA, ZDA) in Cell Biolabs (San Diego, CA, ZDA).Komplet za analizo aktivnosti GST in komplet za analizo skupnih beljakovin (standardna metoda BCA) sta bila kupljena pri Solarbio (Peking, Kitajska).Vsi izvlečki rdečega ginsenga so shranjeni v laboratoriju Mingyu 7. Hongkong Baptist University (Hong Kong, Kitajska) in Korea Cancer Center (Seul, Koreja) sta komercialna vira izvlečka CRG in različnih izvlečkov rdečega ginsenga različnih korejskih porekel (vključno s KRGA, KRGB). in KRGC).Rdeči ginseng je narejen iz korenine 6 let starega svežega ginsenga.Izvleček rdečega ginsenga se pridobiva tako, da se ginseng trikrat spere z vodo, nato se vodni izvleček koncentrira in na koncu posuši pri nizki temperaturi, da dobimo izvleček ginsenga v prahu.Protitelesa (anti-Nrf2, anti-GST in β-aktin), anti-kunčji imunoglobulin G (IgG), konjugiran s hrenovo peroksidazo, transfekcijski reagent, kontrolna siRNA in Nrf2 siRNA so bili kupljeni pri Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). .), ZDA).
Celice Caco2 in hEL smo gojili v 100 mm2 posodah za celične kulture z MEM, ki je vsebovala 10 % FBS pri 37 °C v vlažni atmosferi s 5 % CO2.Za določitev učinka pogojev zdravljenja smo celice hEL inkubirali z različnimi koncentracijami B(a)P in G-Rg3 v MEM 48 ur.Celice je mogoče nadalje analizirati ali zbrati za pripravo izvlečkov brez celic.
Vse poskuse je odobril Odbor za etiko eksperimentalnih živali medicinske fakultete Tongji, Univerza za znanost in tehnologijo Huazhong (št. odobritve 2019; registracijska št. 4587TH).Vsi poskusi so bili izvedeni v skladu z ustreznimi smernicami in predpisi, študija pa je bila izvedena v skladu s smernicami Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Osem tednov starim A/J mišim smo najprej intraperitonealno injicirali B(a)P v raztopini trikaprina (100 mg/kg, 0,2 ml).Po enem tednu so miši naključno razdelili v kontrolne skupine in različne skupine za zdravljenje, po 15 miši v vsaki skupini, in jim dali enkrat na dan.Po 20 tednih zdravljenja so bile živali žrtvovane z zadušitvijo s CO2.Pljuča so bila zbrana in fiksirana za 24 ur.Število površinskih tumorjev in posamezne velikosti tumorjev so kvantificirali za vsako pljučo pod disekcijskim mikroskopom.Ocene volumna tumorja (V) so bile izračunane z naslednjim izrazom: V (mm3) = 4/3πr3, kjer je r premer tumorja.Neto vsota vseh volumnov tumorja v pljučih miši je predstavljala skupni volumen tumorja, povprečni skupni volumen tumorja v vsaki skupini pa je predstavljal obremenitev tumorja.Vzorci polne krvi in črevesja so bili zbrani in shranjeni pri –80 °C za določanje UPLC-MS/MS.Zbrali smo serum in uporabili avtomatski kemijski analizator za analizo ravni alanin aminotransferaze (ALT) in serumskega kreatinina (Cr) za oceno delovanja jeter in ledvic.
Zbrane vzorce smo vzeli iz hladilnice, odmrznili, stehtali in dali v epruvete, kot je opisano zgoraj.Temu smo dodali 0,5 μM florizina (notranji standard) v 0,8 ml raztopine metanola.Tkivo smo nato homogenizirali z uporabo Tissue-Tearor in homogenat nato prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirno epruveto.Zmes centrifugiramo pri 15500 obratih na minuto 15 minut.Po odstranitvi 1,0 ml supernatanta posušimo z dušikom.Za rekuperacijo smo uporabili dvesto mikrolitrov metanola.Kri se zbira in obdeluje na eni liniji ter se uporablja kot referenca za vse meritve.
Plošče Transwell s 24 vdolbinicami so bile zasejane z 1,0 × 105 celic Caco-2 na vdolbinico, da bi ocenili potencialno povečanje transporta G-Rg3 z dodatkom verapamila.Po 3 tednih gojenja celice speremo s HBSS in predhodno inkubiramo pri 37 °C.400 μL 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s ali mešanica s 50 ali 100 μM verapamila) je bilo injicirano na bazolateralno ali apikalno stran monosloja, 600 μL raztopine HBSS pa je bilo dodanih drugi strani.Zberite 100 µl gojišča ob predvidenih časih (0, 15, 30, 45, 60, 90 in 120 minut) in dodajte 100 µl HBSS, da dopolnite ta volumen.Vzorci so bili shranjeni pri –4 °C do detekcije z UPLC-MS/MS.Izraz Papp = dQ/(dT × A × C0) se uporablja za kvantifikacijo navidezne enosmerne apikalne in bazolateralne prepustnosti in obratno (Pa-b oziroma Pb-a);dQ/dT je sprememba koncentracije, A (0,6 cm2) je površina monosloja in C0 je začetna koncentracija darovalca.Razmerje iztoka se izračuna kot Pb-a/Pa-b, kar predstavlja stopnjo iztoka preiskovanega zdravila.
Samci podgan Wistar so bili tešči 24 ur, pili so samo vodo in anestezirali z intravensko injekcijo 3,5 % raztopine pentobarbitala.Intubirana silikonska cevka ima konec dvanajstnika kot vhod in konec ileuma kot izhod.Uporabite peristaltično črpalko za črpanje dovoda z 10 µM G-Rg3r ali G-Rg3s v izotoničnem HBSS pri pretoku 0,1 ml/min.Učinek verapamila je bil ocenjen z dodajanjem 50 μM ali 100 μM spojine k 10 μM G-Rg3r ali G-Rg3s.UPLC-MS/MS smo izvedli na perfuzijskih ekstraktih, zbranih v časovnih točkah 60, 90, 120 in 150 minut po začetku perfuzije.Odstotek absorpcije je kvantificiran s formulo % absorpcije = (1 – Cout/Cin) × 100 %;koncentracija G-Rg3 na izstopu in vstopu je izražena s Cout oziroma Cin.
hEL celice so bile posejane v plošče s 96 vdolbinicami z gostoto 1 × 104 celic na vdolbinico in obdelane z B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) ali G-Rg3, raztopljenim v DMSO .Zdravila smo nato razredčili z gojiščem do različnih koncentracij (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) v 48 urah.Z uporabo komercialno dostopnega testnega kompleta MTS so bile celice izpostavljene standardnemu protokolu in nato izmerjene z uporabo bralnika mikroplošč pri 490 nm.Stopnja viabilnosti celic skupin, sočasno zdravljenih z B(a)P (10 μM) in G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM), je bila ocenjena v skladu z zgornjo metodo in primerjana z neobdelano skupino.
Celice hEL so bile posejane v plošče s 6 vdolbinicami pri gostoti 1 × 105 celic/vdolbinico in obdelane z 10 μMB(a)P v prisotnosti ali odsotnosti 10 μM G-Rg3.Po 48 urah obdelave smo DNK ekstrahirali iz celic hEL z uporabo QIAamp DNA Mini Kit v skladu s protokolom proizvajalca.Tvorba aduktov BPDE-DNA je bila odkrita s kompletom ELISA za adukt BPDE-DNA.Relativne ravni adukta BPDE-DNA smo izmerili z uporabo bralnika mikroplošč z merjenjem absorbance pri 450 nm.
Celice hEL so bile posejane v plošče s 96 vdolbinicami pri gostoti 1 × 104 celic na vdolbinico in obdelane z 10 μMB(a)P v odsotnosti ali prisotnosti 10 μM G-Rg3 48 ur.Aktivnost GST je bila izmerjena s komercialnim kompletom za testiranje aktivnosti GST v skladu s protokolom proizvajalca.Relativno GST aktivacijo smo izmerili z absorbanco pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč.
hEL celice smo sprali z ledeno mrzlim PBS in nato lizirali z uporabo pufra za radioimunoprecipitacijski test, ki je vseboval inhibitorje proteaze in inhibitorje fosfataze.Po kvantificiranju beljakovin z uporabo kompleta za analizo skupnih beljakovin smo 30 μg beljakovin v vsakem vzorcu ločili z 12 % SDS-PAGE in z elektroforezo prenesli na PVDF membrano.Membrane so bile blokirane s 5 % posnetim mlekom in inkubirane s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 °C.Po inkubaciji s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo, smo dodali izboljšane kemiluminescenčne reagente za vizualizacijo veznega signala.Intenzivnost vsakega proteinskega pasu je bila kvantificirana s programsko opremo ImageJ.
Za analizo vseh podatkov, izraženih kot povprečje ± standardni odklon, je bila uporabljena programska oprema GraphPad Prism 7.0.Variacijo med zdravljenimi skupinami so ocenili s Studentovim t testom ali enosmerno analizo variance, pri čemer vrednost P <0,05 kaže na statistično pomembnost.
Vsi podatki, pridobljeni ali analizirani med to študijo, so vključeni v ta objavljeni članek in datoteke z dodatnimi informacijami.
Torre, LA, Siegel, RL in Jemal, A. Statistika pljučnega raka.prislovpotekelzdravilo.biologija.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tobačni karcinogeni, njihovi biomarkerji in rak, ki ga povzroča tobak.Nat.Rakov kaplan.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH in Venitt, S. DNA in beljakovinski adukti v človeških tkivih, ki so posledica izpostavljenosti tobačnemu dimu.mednarodnost.J. Rak.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA in Yu M. Učinek Houttuynia cordata in silibinina na tumorigenezo pljuč, ki jo povzroča benzo(a)piren, pri A/J miših.Rak 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Naravni izdelek proti raku, izoliran iz kitajskih medicinskih materialov.čeljust.zdravilo.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Učinkovitost polifenona E, rdečega ginsenga in rapamicina na tumorigenezo pljuč, ki jo povzroča benzo(a)piren, pri miših A/J.Rak 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS in Yuan, KS Red, sodelovanje pri zdravljenju raka.čeljust.J. Nutt.zdravilo.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS in Gao, L. Ginsenosides v koreninah in listih ameriškega ginsenga.J. Agric.Kemija hrane.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA in Yuan KS Farmakologija ginsenga: številne komponente in številni učinki.biokemija.farmakologija.58, 1685–1693 (1999).
Čas objave: 17. september 2023