Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље резултате препоручујемо да користите новију верзију прегледача (или да искључите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стила или ЈаваСцрипт-а.
Црвени гинсенг се у традиционалној азијској медицини користи стотинама година.У овој студији, проценили смо способност четири врсте црвеног гинсенга (кинески црвени гинсенг, корејски црвени гинсенг А, корејски црвени гинсенг Б и корејски црвени гинсенг Ц) узгајаних у различитим регионима да инхибирају формирање и раст плућа изазваних канцерогеном. тумори.Тест бензо(а)пирена (Б(а)П) спроведен је на А/Ј мишевима, а установљено је да је корејски црвени гинсенг Б најефикаснији у смањењу оптерећења тумором међу четири врсте црвеног гинсенга.Поред тога, анализирали смо садржај различитих гинсенозида (Рг1, Ре, Рц, Рб2, Рб3, Рб1, Рх1, Рд, Рг3, Рх2, Ф1, Рк1 и Рг5) у четири екстракта црвеног гинсенга и открили да корејски црвени гинсенг Б има највише висок ниво гинсенозида Рг3 (Г-Рг3), што сугерише да Г-Рг3 може играти важну улогу у његовој терапијској ефикасности.Овај рад показује да Г-Рг3 има релативно ниску биорасположивост.Међутим, када је Г-Рг3 истовремено примењен са П-гп инхибитором верапамилом, ефлукс Г-Рг3 у Цацо-2 ћелије је смањен, брзина цревне апсорпције Г-Рг3 је повећана на моделу пацова, а Г-Рг3 био повећан.У ћелијама Цацо-2, одлив Рг3 се смањује, а ниво концентрације Рг3 опада.Г-Рг3 је повећан у цревима и плазми, а његова способност да спречи туморе је такође побољшана у моделу Б(а)П-индуковане туморигенезе код пацова.Такође смо открили да је Г-Рг3 смањио Б(а)П-индуковану цитотоксичност и формирање ДНК адукта у људским плућним ћелијама, и обновио експресију и активност ензима фазе ИИ путем Нрф2 пута, што може бити повезано са потенцијалним механизмом деловања. Г инхибиције -Рг3..О појави тумора плућа.Наша студија показује потенцијално важну улогу Г-Рг3 у циљању тумора плућа на моделима миша.Орална биодоступност овог гинсенозида је побољшана циљањем П-гликопротеина, омогућавајући молекулу да испољава антиканцерогене ефекте.
Најчешћи тип рака плућа је карцином плућа не-малих ћелија (НСЦЛЦ), који је један од водећих узрока смрти од рака у Кини и Северној Америци1,2.Главни фактор који повећава ризик од развоја неситноћелијског карцинома плућа је пушење.Дим цигарете садржи више од 60 канцерогених материја, укључујући бензо(а)пирен (Б(а)П), нитрозамине и радиоактивне изотопе од распада радона.3 Полициклични ароматични угљоводоници Б(а)П су главни узрок токсичности у цигаретама дим.Након излагања Б(а)П, цитохром П450 га претвара у Б(а)П-7,8-дихидродиол-9,10-епоксид (БПДЕ), који реагује са ДНК да би формирао БПДЕ-ДНК адукт 4. Поред тога, ови адукти индукују туморигенезу плућа код мишева са стадијумом тумора и хистопатологијом сличним туморима плућа код људи5.Ова карактеристика чини Б(а)П-индуковани модел рака плућа погодним системом за процену једињења са могућим антиканцерогеним својствима.
Једна од могућих стратегија за превенцију развоја карцинома плућа код група са високим ризиком, посебно код пушача, је примена хемопревентивних агенаса за сузбијање развоја интраепителних неопластичних лезија и на тај начин спречавање њиховог каснијег преласка у малигнитет.Студије на животињама показују да су различита хемопревентивна средства ефикасна6.Наш претходни извештај7 је истакао добре превентивне ефекте црвеног гинсенга на рак плућа.Ова биљка се вековима користила у традиционалној азијској медицини за продужење живота и здравља, а документовано је да има антитуморско дејство8.
Активни фактор гинсенга је гинсенозид, који се користи као композитни маркер за процену квалитета екстраката гинсенга.Квантитативна анализа сирових екстраката гинсенга обично укључује употребу неколико гинсенозида, укључујући РК1, Рг1, Ф1, Ре, Рб1, Рб2, Рб3, Рд, Рх1, Рх2, Рг3, Рг5 и Рц9,10.Гинсенозиди имају малу клиничку примену због њихове веома лоше оралне биорасположивости11.Иако механизам за ову лошу биодоступност није јасан, ефлукс гинсенозида изазван П-гликопротеином (П-гп)12 може бити узрок.П-гп је један од најважнијих ефлуксних транспортера у суперфамилији транспортера касета који се везују за АТП, који користи енергију хидролизе АТП-а за ослобађање интрацелуларних супстанци у спољашњу средину.П-гп транспортери су обично широко распрострањени у цревима, бубрезима, јетри и крвно-можданој баријери13.П-гп игра кључну улогу у цревној апсорпцији, а инхибиција П-гп повећава оралну апсорпцију и доступност неких лекова против рака12,14.Примери инхибитора који су претходно коришћени у литератури су верапамил и циклоспорин А15.Овај рад укључује успостављање мишјег система за проучавање Б(а)П-индукованог рака плућа како би се проценила способност различитих екстраката црвеног гинсенга из Кине и Кореје да утичу на малигне болести.Екстракти су појединачно анализирани да би се идентификовали специфични гинсенозиди који могу утицати на канцерогенезу.Верапамил је затим коришћен за циљање П-гп и побољшање оралне биорасположивости и терапеутске ефикасности гинсенозида који циљају на рак.
Механизам којим сапонини гинсенга врше терапеутске ефекте на карциногенезу остаје нејасан.Истраживања су показала да различити гинсенозиди могу смањити оштећење ДНК узроковано канцерогенима смањењем оксидативног стреса и активирањем ензима за детоксикацију фазе ИИ, чиме се спречава оштећење ћелија.Глутатион С-трансфераза (ГСТ) је типичан ензим фазе ИИ који је неопходан да смањи оштећење ДНК узроковано канцерогенима17.Фактор 2 повезан са нуклеарним еритроидом 2 (Нрф2) је важан фактор транскрипције који регулише редокс хомеостазу и активира експресију ензима фазе ИИ и цитопротективне антиоксидативне одговоре18.Наша студија је такође испитивала ефекте идентификованих гинсенозида на смањење цитотоксичности изазване Б(а)П и формирање адукта БПДЕ-ДНК, као и индукцију ензима фазе ИИ модулацијом Нрф2 пута у нормалним ћелијама плућа.
Успостављање мишјег модела рака изазваног Б(а)П је у складу са претходним радом5.Слика 1А приказује експериментални дизајн 20-недељног третмана модела рака миша изазваног Б(а)П, водом (контрола), екстрактом кинеског црвеног гинсенга (ЦРГ), екстрактом корејског црвеног гинсенга А (КРГА) и корејским црвеним гинсенг.Екстракт Б (КРГБ) и екстракт корејског црвеног гинсенга Ц (КРГЦ).После 20 недеља третмана црвеним гинсенгом, мишеви су жртвовани гушењем ЦО2.Слика 1Б приказује макроскопске туморе плућа код животиња третираних различитим врстама црвеног гинсенга, а слика 1Ц приказује репрезентативну светлосну микрографију узорка тумора.Оптерећење тумором животиња третираних КРГБ-ом (1,5 ± 0,35) било је ниже него код контролних животиња (0,82 ± 0,2, П < 0,05), као што је приказано на слици 1Д.Просечан степен инхибиције оптерећења тумором био је 45%.Други тестирани екстракти црвеног гинсенга нису показали тако значајне промене у оптерећењу тумором (П > 0,05).Нису примећени очигледни нежељени ефекти на моделу миша током 20 недеља лечења црвеним гинсенгом, укључујући без промене телесне тежине (подаци нису приказани) и токсичности за јетру или бубреге (Слика 1Е, Ф).
Екстракт црвеног гинсенга третира развој тумора плућа код А/Ј мишева.(А) Експериментални дизајн.(Б) Велики тумори плућа у моделу миша.Тумори су означени стрелицама.а: Кинески црвени гинсенг група.б: група А корејског црвеног гинсенга.ц: корејски црвени гинсенг група Б. д: корејски црвени гинсенг група Ц. д: контролна група.(Ц) Светлосни микрограф који показује тумор плућа.Увећање: 100. б: 400. (Д) Оптерећење тумором у групи екстракта црвеног гинсенга.(Е) Нивои јетреног ензима АЛТ у плазми.(Ф) Нивои бубрежног ензима у плазми Цр.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација.*П <0,05.
Екстракти црвеног гинсенга идентификовани у овој студији анализирани су тандем масеном спектрометријом ултра-перформансе течне хроматографије (УПЛЦ-МС/МС) да би се квантификовали следећи гинсенозиди: Рг1, Ре, Рц, Рб2, Рб3, Рб1, Рх1, Рд, Рг3, Рх2, Ф1, Рк1 и Рг5.Услови УПЛЦ и МС коришћени за мерење аналита описани су у претходном извештају19.УПЛЦ-МС/МС хроматограми четири екстракта црвеног гинсенга приказани су на слици 2А.Постојале су значајне разлике у садржају укупног гинсенозида, са највећим укупним садржајем гинсенозида у ЦРГ (590,27 ± 41,28 μмол/Л) (Слика 2Б).Приликом процене појединачних гинсенозида (Слика 2Ц), КРГБ је показао највиши ниво Г-Рг3 у поређењу са другим гинсенозидима (58,33 ± 3,81 μмол/Л за Г-Рг3с и 41,56 ± 2,88 μмол/Л за Г-Рг3р).Л).тип црвеног гинсенга (П < 0,001).Г-Рг3 се јавља као пар стереоизомера Г-Рг3р и Г-Рг3с, који се разликују по положају хидроксилне групе на угљенику 20 (слика 2Д).Резултати показују да Г-Рг3р или Г-Рг3 могу имати важан антиканцерогени потенцијал у Б(а)П-индукованом моделу рака миша.
Садржај гинсенозида у разним екстрактима црвеног гинсенга.(А) УПЛЦ-МС/МС хроматограми четири екстракта црвеног гинсенга.(Б) Процена укупног садржаја гинсенозида у наведеним екстрактима.(Ц) Детекција појединачних гинсенозида у обележеним екстрактима.(Д) Структуре гинсенозидних стереоизомера Г-Рг3р и Г-Рг3с.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација троструких одређивања.***П <0,001.
УПЛЦ-МС/МС студија је захтевала квантификацију гинсенозида у узорцима црева и крви након 20 недеља лечења.Третман КРГБ-ом показао је присуство само 0,0063 ± 0,0005 μг/мл Рг5 у крви.Нису откривени преостали гинсенозиди, што указује на лошу оралну биорасположивост и стога смањену изложеност овим гинсенозидима.
Ћелијска линија аденокарцинома дебелог црева Цацо-2 је морфолошки и биохемијски слична епителним ћелијама црева човека, што показује њену корисност у процени транспорта ентероцита кроз цревну епителну баријеру.Ова анализа је заснована на ранијој студији 20 .Слике 3А,Б,Ц,Д,Е,Ф приказују репрезентативне слике трансћелијског транспорта Г-Рг3р и Г-Рг3 коришћењем Цацо-2 монослојног модела.Трансћелијски транспорт Г-Рг3р или Г-Рг3 преко Цацо-2 монослојева од базолатералне до апикалне стране (Пб-а) био је значајно већи него са апикалне на базолатералну страну (Па-б).За Г-Рг3р, средња вредност Па-б била је 0,38 ± 0,06, која се повећала на 0,73 ± 0,06 након третмана са 50 μмол/Л верапамила и на 1,14 ± 0,09 након третмана са 100 μмол/Л верапамила (п < 0,01 и 0,01, 0,01). односно слика 2).3А).Посматрања за Г-Рг3 су пратила сличан образац (слика 3Б), а резултати су показали да третман верапамилом побољшава транспорт Г-Рг3р и Г-Рг3.Третман верапамилом је такође резултирао значајним смањењем средњих односа Пб-а и Г-Рг3р и Г-Рг3с ефлукса (Слика 3Ц,Д,Е,Ф), што указује да третман верапамилом смањује садржај гинсенозида у ћелијама ефлукса Цацо-2..
Трансцелуларни транспорт Г-Рг3 у монослојевима Цацо-2 и интестинална апсорпција у тесту перфузије пацова.(А) Па-б вредност Г-Рг3р групе у монослоју Цацо-2.(Б) Па-б вредност Г-Рг3с група у Цацо-2 монослоју.(Ц) Пб вредност Г-Рг3р групе у Цацо-2 монослоју.(Д) Пб вредност Г-Рг3с група у Цацо-2 монослоју.(Е) Однос приноса Г-Рг3р група у Цацо-2 монослоју.(Ф) Однос приноса Г-Рг3 група у Цацо-2 монослоју.(Г) Проценат интестиналне апсорпције Г-Рг3р у тесту перфузије код пацова.(Х) Проценат интестиналне апсорпције Г-Рг3 у тесту перфузије код пацова.Пропустљивост и апсорпција су упоређени без додатка верапамила.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација пет независних експеримената.*П <0,05, **П <0,01, ***П <0,001.
У складу са ранијим радом20, извршена је ортотопска цревна перфузија пацова да би се утврдило да ли се апсорпција Г-Рг3 у цревима повећава након третмана верапамилом.Слике 3Г,Х показују репрезентативне тестове перфузије за процену процента интестиналне апсорпције Г-Рг3р и Г-Рг3 код пацова модела рака током горе наведених временских периода.Почетни проценат слабог уноса Г-Рг3р од приближно 10% порастао је на више од 20% након третмана са 50 μМ верапамила и на више од 25% након третмана са 100 μМ верапамила.Слично, Г-Рг3, који је имао почетно узимање од 10%, такође је показао врхунац од преко 20% након третмана са 50 μМ верапамила и скоро 30% након третмана са 100 μМ верапамила, што сугерише да инхибиција П-гп верапамилом повећава цревна Г-апсорпција Рг3 у мишјем моделу рака плућа.
Према горе наведеној методи, Б(а)П-индуковани модел мишеви су насумично подељени у шест група, као што је приказано на слици 4А.Није примећен значајан губитак тежине или клинички знаци токсичности у групи која је третирана Г-Рг3 у поређењу са контролном групом (подаци нису приказани).После 20 недеља третмана, сакупљена су плућа сваког миша.Слика 4Б приказује макроскопске туморе плућа код мишева у горњим групама за лечење, а Слика 4Ц приказује репрезентативну светлосну микрографију репрезентативног тумора.Што се тиче оптерећења тумором у свакој групи (слика 4Д), вредности за мишеве третиране Г-Рг3р и Г-Рг3с су биле 0,75 ± 0,29 мм3 и 0,81 ± 0,30 мм3, респективно, док су вредности за Г мишеве третиране са -Рг3с су 1,63 односно ±0,40 мм3.контролни мишеви (п < 0,001), што указује да третман Г-Рг3 смањује оптерећење тумором код мишева.Примена верапамила је додатно побољшала ово смањење: вредности код верапамил+ Г-Рг3р мишева су се смањиле са 0,75 ± 0,29 мм3 на 0,33 ± 0,25 мм3 (п < 0,01), а вредности за верапамил+ са 0,81 ± 0,30 мм3 ± 0,29 су смањене на ± 0,29 мм3 (п < 0,01). мм3 код мишева третираних Г. -Рг3с (п < 0,05), што указује да верапамил може да појача инхибиторни ефекат Г-Рг3 на туморигенезу.Оптерећење тумором није показало значајне разлике између контролне групе и верапамил групе, групе Г-Рг3р и Г-Рг3с групе, и групе верапамил+Г-Рг3р и групе верапамил+Г-Рг3с.Штавише, није било значајних токсичности за јетру или бубреге повезане са процењеним третманима (Слика 4Е, Ф).
Оптерећење тумором након третмана Г-Рг3 и нивои Г-Рг3р и Г-Рг3 у плазми или цревима у назначеним групама.(А) Експериментални дизајн.(Б) Макроскопски тумори у моделу миша.Тумори су означени стрелицама.а: Г-Рг3р.б: Г-Рг3с.ц: Г-Рг3р у комбинацији са верапамилом.д: Г-Рг3 у комбинацији са верапамилом.д: Верапамил.е: контрола.(Ц) Оптички микрограф тумора при увећању.Одговор: 100к.б: 400Кс.(Д) Ефекат третмана Г-Рг3 + верапамилом на оптерећење тумором код А/Ј мишева.(Е) Нивои јетреног ензима АЛТ у плазми.(Ф) Нивои бубрежног ензима у плазми Цр.(Г) Нивои Г-Рг3р или Г-Рг3 у плазми наведених група.(Х) Нивои Г-Рг3р или Г-Рг3с у цревима наведених група.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација троструких одређивања.*П <0,05, **П <0,01, ***П <0,001.
Нивои Г-Рг3 код Б(а)П-индукованог модела карцинома мишева су процењени помоћу УПЛЦ-МС/МС након 20-недељног периода лечења у складу са методом описаном у одељку Методе.Слике 4Г и Х приказују нивое Г-Рг3 у плазми и цревима, респективно.Ниво Г-Рг3р у плазми био је 0,44 ± 0,32 μмол/Л и повећан на 1,17 ± 0,47 μмол/Л уз истовремену примену верапамила (п < 0,001), док је ниво Г-Рг3р у цревима био 0,53 ± µг/л.Када се комбинује са верапамилом, г се повећао на 1,35 ± 0,13 μг/г (п < 0,001).За Г-Рг3, резултати су пратили сличан образац, што указује да третман верапамилом повећава оралну биорасположивост Г-Рг3 код А/Ј мишева.
Тест виталности ћелија је коришћен за процену цитотоксичности Б(а)П и Г-Рг3 на хЕЛ ћелијама.Цитотоксичност изазвана Б(а)П у хЕЛ ћелијама приказана је на слици 5А, док су нетоксична својства Г-Рг3р и Г-Рг3 приказана на сликама 5А и 5Б.5Б, Ц. Да би се проценио цитопротективни ефекат Г-Рг3, Б(а)П је истовремено примењен са различитим концентрацијама Г-Рг3р или Г-Рг3 у хЕЛ ћелије.Као што је приказано на слици 5Д, Г-Рг3р у концентрацијама од 5 μМ, 10 μМ и 20 μМ обновио је виталност ћелије на 58,3%, 79,3% и 77,3%, респективно.Слични резултати се такође могу видети у групи Г-Рг3с.Када су концентрације Г-Рг3 биле 5 µМ, 10 µМ и 20 µМ, виталност ћелија је враћена на 58,3%, 72,7% и 76,7%, респективно (Слика 5Е).).Присуство БПДЕ-ДНК адуката је мерено коришћењем ЕЛИСА комплета.Наши резултати су показали да су нивои адукта БПДЕ-ДНК повећани у групи која је третирана Б(а)П у поређењу са контролном групом, али у поређењу са заједничким третманом Г-Рг3, нивои адукта БПДЕ-ДНК у Б(а)П групи Б у третираној групи, нивои адукта ДНК су значајно смањени.Резултати третмана само са Б(а)П приказани су на слици 5Ф (1,87 ± 0,33 према 3,77 ± 0,42 за Г-Рг3р, 1,93 ± 0,48 наспрам 3,77 ± 0,42 за Г -Рг3с, п < 0,001).
Вијабилност ћелије и формирање адукта БПДЕ-ДНК у хЕЛ ћелијама третираним са Г-Рг3 и Б(а)П.(А) Виабилност хЕЛ ћелија третираних са Б(а)П.(Б) Виабилност хЕЛ ћелија третираних са Г-Рг3р.(Ц) Виабилност хЕЛ ћелија третираних са Г-Рг3.(Д) Вијабилност хЕЛ ћелија третираних са Б(а)П и Г-Рг3р.(Е) Вијабилност хЕЛ ћелија третираних са Б(а)П и Г-Рг3.(Ф) Нивои БПДЕ-ДНК адукта у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација троструких одређивања.*П <0,05, **П <0,01, ***П <0,001.
Експресија ГСТ ензима је откривена након заједничког третмана са 10 μМ Б(а)П и 10 μМ Г-Рг3р или Г-Рг3с.Наши резултати су показали да је Б(а)П потиснуо експресију ГСТ (59,7 ± 8,2% у групи Г-Рг3р и 39 ± 4,5% у групи Г-Рг3с), а Б(а)П је био повезан са било којим од Г-Рг3р , или са Г-Рг3р, или са Г-Рг3р.Заједнички третман са Г-Рг3с повратио је ГСТ експресију.Експресија ГСТ (103,7 ± 15,5% у Г-Рг3р групи и 110 ± 11,1% у Г-Рг3с групи, п < 0,05 и п < 0,001, респективно, слике 6А, Б и Ц).ГСТ активност је процењена коришћењем комплета за анализу активности.Наши резултати су показали да је група за комбиновани третман имала већу ГСТ активност у поређењу са групом која је примала само Б(а)П (96,3 ± 6,6% наспрам 35,7 ± 7,8% у групи Г-Рг3р наспрам 92,3 ± 6,5 у групи Г-Рг3р). ).% наспрам 35,7 ± 7,8% у групи Г-Рг3с, п < 0,001, Слика 6Д).
Експресија ГСТ и Нрф2 у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3.(А) Детекција ГСТ експресије Вестерн блоттингом.(Б) Квантитативна експресија ГСТ у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3р.(Ц) Квантитативна експресија ГСТ-а у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3с.(Д) ГСТ активност у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3.(Е) Детекција експресије Нрф2 помоћу Вестерн блотинга.(Ф) Квантитативна експресија Нрф2 у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3р.(Г) Квантитативна експресија Нрф2 у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3с.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација троструких одређивања.*П <0,05, **П <0,01, ***П <0,001.
Да би се разјаснили путеви укључени у Г-Рг3 посредовану супресију туморигенезе изазване Б(а)П, експресија Нрф2 је процењена Вестерн блот-ом.Као што је приказано на сликама 6Е,Ф,Г, у поређењу са контролном групом, смањен је само ниво Нрф2 у групи третмана Б(а)П;међутим, у поређењу са групом која је третирана Б(а)П, нивои Б(а) Нрф2 у ПГ-Рг3 групи су повећани (106 ± 9,5% за Г-Рг3р наспрам 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% за Г-Рг3р наспрам 41 ± 9,8% за Г-Рг3с, п < 0,01).
Потврдили смо превентивну улогу Нрф2 супресијом експресије Нрф2 користећи специфичну малу интерферирајућу РНК (сиРНА).Нокдаун Нрф2 је потврђен Вестерн блотингом (слика 7А,Б).Као што је приказано на сликама 7Ц,Д, заједнички третман хЕЛ ћелија са Б(а)П и Г-Рг3 резултирао је смањењем броја адуката БПДЕ-ДНК (1,47 ± 0,21) у поређењу са третманом са Б(а)П сам у контролној сиРНА групи.) Г-Рг3р је био 4,13 ± 0,49, Г-Рг3с је био 1,8 ± 0,32 и 4,1 ± 0,57, п < 0,01).Међутим, инхибиторни ефекат Г-Рг3 на формирање БПДЕ-ДНК је укинут обарањем Нрф2.У групи сиНрф2, није било значајне разлике у формирању адукта БПДЕ-ДНК између заједничког третмана Б(а)П и Г-Рг3 и самог Б(а)П третмана (3,0 ± 0,21 за Г-Рг3р наспрам 3,56 ± 0,32 ).за Г-Рг3р наспрам 3,6 за Г-Рг3с наспрам ±0,45 наспрам 4,0±0,37, п > 0,05).
Ефекат обарања Нрф2 на формирање адукта БПДЕ-ДНК у хЕЛ ћелијама.(А) Нокдаун Нрф2 је потврђен Вестерн блотингом.(Б) Квантификација интензитета Нрф2 траке.(Ц) Ефекат обарања Нрф2 на нивое адукта БПДЕ-ДНК у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3р.(Д) Ефекат обарања Нрф2 на нивое адукта БПДЕ-ДНК у хЕЛ ћелијама третираним са Б(а)П и Г-Рг3.Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација троструких одређивања.*П <0,05, **П <0,01, ***П <0,001.
Ова студија је проценила превентивне ефекте различитих екстраката црвеног гинсенга на мишјем моделу Б(а)П-индукованог карцинома плућа, а третман КРГБ значајно је смањио оптерећење тумором.С обзиром да Г-Рг3 има највећи садржај у овом екстракту гинсенга, проучавана је значајна улога овог гинсенозида у инхибицији туморигенезе.И Г-Рг3р и Г-Рг3 (два епимера Г-Рг3) значајно су смањили оптерећење тумором у мишјем моделу Б(а)П-индукованог рака.Г-Рг3р и Г-Рг3 испољавају антиканцерогене ефекте индукујући апоптозу туморских ћелија21, инхибирају раст тумора22, заустављају ћелијски циклус23 и утичу на ангиогенезу24.Такође се показало да Г-Рг3 инхибира ћелијске метастазе25, а документована је и способност Г-Рг3 да појача ефекте хемотерапије и радиотерапије26,27.Поон и сарадници су показали да третман Г-Рг3 може смањити генотоксичне ефекте Б(а)П28.Ова студија показује терапеутски потенцијал Г-Рг3 у циљању канцерогених молекула у животној средини и превенцији рака.
Упркос њиховом добром профилактичком потенцијалу, лоша орална биорасположивост гинсенозида представља изазов за клиничку употребу ових молекула.Фармакокинетичка анализа оралне примене гинсенозида код пацова показала је да је његова биорасположивост још увек мања од 5%29.Ови тестови су показали да се после 20-недељног периода лечења смањио само ниво Рг5 у крви.Иако основни механизам слабе биорасположивости тек треба да се разјасни, сматра се да је П-гп укључен у ефлукс гинсенозида.Овај рад је по први пут показао да примена верапамила, блокатора П-гп, повећава оралну биорасположивост Г-Рг3р и Г-Рг3с.Дакле, овај налаз сугерише да Г-Рг3р и Г-Рг3с делују као супстрати П-гп да регулишу његов ефлукс.
Овај рад показује да комбиновано лечење верапамилом повећава оралну биорасположивост Г-Рг3 у мишјем моделу рака плућа.Овај налаз је подржан повећаним интестиналним трансцелуларним транспортом Г-Рг3 након блокаде П-гп, чиме се повећава његова апсорпција.Тестови на Цацо2 ћелијама су показали да третман верапамилом смањује ефлукс Г-Рг3р и Г-Рг3с уз побољшање пропусности мембране.Студија Јанга и сар.Студије су показале да третман циклоспорином А (још један блокатор П-гп) повећава биорасположивост гинсенозида Рх2 са почетне вредности од 1%20 на више од 30%.Гинсенозидна једињења К и Рг1 су такође показала сличне резултате30,31.Када су верапамил и циклоспорин А истовремено давани, ефлукс једињења К у Цацо-2 ћелије је значајно смањен са 26,6 на мање од 3, док су се његови интрацелуларни нивои повећали 40 пута30.У присуству верапамила, нивои Рг1 су се повећали у епителним ћелијама плућа пацова, што указује на улогу П-гп у ефлуксу гинсенозида, као што су показали Менг ет ал.31.Међутим, верапамил није имао исти ефекат на ефлукс неких гинсенозида (као што су Рг1, Ф1, Рх1 и Ре), што указује да на њих не утичу П-гп супстрати, као што су показали Лианг ет ал.32 .Ово запажање може бити повезано са укључивањем других транспортера и алтернативних структура гинсенозида.
Механизам превентивног дејства Г-Рг3 на рак је нејасан.Претходне студије су показале да Г-Рг3 спречава оштећење ДНК и апоптозу смањењем оксидативног стреса и упале16,33, што може бити основни механизам за спречавање Б(а)П-индуковане туморигенезе.Неки извештаји указују да се генотоксичност изазвана Б(а)П може смањити модулацијом ензима фазе ИИ да би се формирао БПДЕ-ДНК34.ГСТ је типичан ензим фазе ИИ који инхибира формирање адукта БПДЕ-ДНК промовишући везивање ГСХ за БПДЕ, чиме се смањује оштећење ДНК изазвано Б(а)П35.Наши резултати показују да третман Г-Рг3 смањује Б(а)П-индуковану цитотоксичност и формирање адукта БПДЕ-ДНК у хЕЛ ћелијама и обнавља експресију и активност ГСТ ин витро.Међутим, ови ефекти су изостали у одсуству Нрф2, што сугерише да Г-Рг3 индукује цитопротективне ефекте путем Нрф2 пута.Нрф2 је главни фактор транскрипције за ензиме детоксикације фазе ИИ који промовише уклањање ксенобиотика36.Активација Нрф2 пута индукује цитопротекцију и смањује оштећење ткива37.Штавише, неколико извештаја је подржало улогу Нрф2 као супресора тумора у карциногенези38.Наша студија показује да индукција Нрф2 пута помоћу Г-Рг3 игра важну регулаторну улогу у генотоксичности изазваној Б(а)П изазивањем детоксикације Б(а)П активирањем ензима фазе ИИ, чиме се инхибира процес туморигенезе.
Наш рад открива потенцијал црвеног гинсенга у превенцији Б(а)П-индукованог рака плућа код мишева кроз важно учешће гинсенозида Г-Рг3.Лоша орална биодоступност овог молекула отежава његову клиничку примену.Међутим, ова студија по први пут показује да је Г-Рг3 супстрат П-гп, а примена П-гп инхибитора повећава биорасположивост Г-Рг3 ин витро и ин виво.Г-Рг3 смањује Б(а)П-индуковану цитотоксичност регулацијом Нрф2 пута, што може бити потенцијални механизам за његову превентивну функцију.Наша студија потврђује потенцијал гинсенозида Г-Рг3 за превенцију и лечење рака плућа.
Шестонедељне женке А/Ј мишева (20 ± 1 г) и 7-недељни мужјаци пацова Вистар (250 ± 20 г) добијени су из Џексон лабораторије (Бар Харбор, САД) и Института за зоологију Вухан.Универзитет (Вухан, Кина).Центар за сакупљање кинеских типских култура (Вухан, Кина) обезбедио нам је Цацо-2 и хЕЛ ћелије.Сигма-Алдрицх (Сент Луис, САД) је извор Б(а)П и трикаприна.Пречишћени гинсенозиди Г-Рг3р и Г-Рг3с, диметил сулфоксид (ДМСО), комплет за испитивање пролиферације ЦеллТитер-96 (МТС), верапамил, минимални есенцијални медијум (МЕМ) и фетални говеђи серум (ФБС) купљени су од Цхенгду Муст Био-Тецхнологи .Цо.,Лтд.(Ченгду, Кина).КИАамп ДНК мини комплет и комплет ЕЛИСА адукта БПДЕ-ДНК купљени су од компаније Киаген (Станфорд, Калифорнија, САД) и Целл Биолабс (Сан Дијего, Калифорнија, САД).Комплет за испитивање ГСТ активности и комплет за анализу укупног протеина (стандардна БЦА метода) купљени су од Соларбио (Пекинг, Кина).Сви екстракти црвеног гинсенга се чувају у лабораторији Мингиу 7. Баптистички универзитет у Хонг Конгу (Хонг Конг, Кина) и Корејски центар за рак (Сеул, Кореја) су комерцијални извори ЦРГ екстракта и разних екстраката црвеног гинсенга различитог корејског порекла (укључујући КРГА, КРГБ и КРГЦ).Црвени гинсенг се прави од корена 6-годишњег свежег гинсенга.Екстракт црвеног гинсенга се добија испирањем гинсенга водом три пута, затим концентровањем воденог екстракта и коначно сушењем на ниској температури да би се добио прах екстракта гинсенга.Антитела (анти-Нрф2, анти-ГСТ и β-актин), анти-зечји имуноглобулин Г (ИгГ), коњугован са пероксидазом рена, реагенс за трансфекцију, контролна сиРНА и Нрф2 сиРНА су купљени од Санта Цруз Биотецхнологи (Санта Круз, Калифорнија) .), САД).
Цацо2 и хЕЛ ћелије су култивисане у посудама за ћелијску културу од 100 мм2 са МЕМ који садржи 10% ФБС на 37 ° Ц у влажној атмосфери од 5% ЦО2.Да би се одредио ефекат услова лечења, хЕЛ ћелије су инкубиране са различитим концентрацијама Б(а)П и Г-Рг3 у МЕМ током 48 х.Ћелије се могу даље анализирати или сакупљати да би се припремили екстракти без ћелија.
Све експерименте је одобрио Комитет за експерименталну етику животиња Медицинског колеџа Тонгји, Универзитета науке и технологије Хуазхонг (одобрење бр. 2019; регистрацијски број 4587ТХ).Сви експерименти су изведени у складу са релевантним смерницама и прописима, а студија је спроведена у складу са смерницама Анимал Ресеарцх: Репортинг оф Ин виво Екпериментс (АРРИВЕ).Осмонедељним А/Ј мишевима је прво интраперитонеално убризган Б(а)П у раствору трикаприна (100 мг/кг, 0,2 мл).После недељу дана, мишеви су насумично подељени у контролне групе и различите групе за третман, по 15 мишева у свакој групи, и давани су једном дневно.После 20 недеља третмана, животиње су жртвоване гушењем ЦО2.Плућа су сакупљена и фиксирана 24 сата.Број површинских тумора и појединачне величине тумора квантификовани су за свако плућно крило под микроскопом за сецирање.Процене запремине тумора (В) су израчунате коришћењем следећег израза: В (мм3) = 4/3πр3, где је р пречник тумора.Нето збир свих запремина тумора у плућима мишева представља укупну запремину тумора, а просечна укупна запремина тумора у свакој групи представља оптерећење тумором.Узорци пуне крви и црева су сакупљени и чувани на -80°Ц за УПЛЦ-МС/МС одређивање.Серум је сакупљен и аутоматизовани хемијски анализатор је коришћен за анализу нивоа аланин аминотрансферазе (АЛТ) и креатинина у серуму (Цр) за процену функције јетре и бубрега.
Прикупљени узорци су уклоњени из хладњаче, одмрзнути, извагани и стављени у епрувете као што је горе описано.Овоме је додато 0,5 μМ флоризина (интерни стандард) у 0,8 мл раствора метанола.Ткиво је затим хомогенизовано коришћењем Тиссуе-Теарор-а и хомогенат је затим пребачен у епрувету за микроцентрифугу од 1,5 мл.Смеша је центрифугирана на 15500 рпм током 15 минута.Након уклањања 1,0 мл супернатанта, осушити азотом.За опоравак је коришћено двеста микролитара метанола.Крв се сакупља и обрађује на једној линији и користи се као референца за сва мерења.
Трансвелл плоче са 24 бунара су засејане са 1,0 × 105 Цацо-2 ћелија по бунарчићу да би се проценило потенцијално побољшање транспорта Г-Рг3 додавањем верапамила.После 3 недеље културе, ћелије су испране са ХБСС и претходно инкубиране на 37°Ц.400 μЛ 10 μМ Г-Рг3 (Г-Рг3р, Г-Рг3с, или смеша са 50 или 100 μМ верапамила) је убризгано на базолатералну или апикалну страну монослоја, а 600 μЛ раствора ХБСС је додато у други страна.Сакупите 100 µл медијума за културу у назначено време (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минута) и додајте 100 µл ХБСС-а да бисте добили ову запремину.Узорци су чувани на -4 °Ц до детекције помоћу УПЛЦ-МС/МС.Израз Папп = дК/(дТ × А × Ц0) се користи за квантификацију привидне једносмерне апикалне и базолатералне пермеабилности и обрнуто (Па-б и Пб-а, респективно);дК/дТ је промена концентрације, А (0,6 цм2) је површина монослоја, а Ц0 је почетна концентрација донора.Однос ефлукса се израчунава као Пб-а/Па-б, што представља брзину ефлукса испитиваног лека.
Мужјаци Вистар пацова су гладни 24 сата, пили су само воду и анестезирали интравенском ињекцијом 3,5% раствора пентобарбитала.Интубирана силиконска цев има крај дуоденума као улаз и крај илеума као излаз.Користите перисталтичку пумпу за пумпање улаза са 10 µМ Г-Рг3р или Г-Рг3с у изотоничном ХБСС при брзини протока од 0,1 мл/мин.Ефекат верапамила је процењен додавањем 50 μМ или 100 μМ једињења у 10 μМ Г-Рг3р или Г-Рг3с.УПЛЦ-МС/МС је изведен на перфузионим екстрактима сакупљеним у временским тачкама 60, 90, 120 и 150 минута након почетка перфузије.Проценат апсорпције је квантификован формулом % апсорпције = (1 – Цоут/Цин) × 100%;концентрација Г-Рг3 на излазу и улазу је изражена са Цоут и Цин, респективно.
хЕЛ ћелије су засејане у плоче са 96 јажица при густини од 1 × 104 ћелије по бунарчићу и третиране са Б(а)П (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μМ) или Г-Рг3 раствореним у ДМСО .Лекови су затим разблажени медијумом за културу до различитих концентрација (0, 1, 2, 5, 10, 20 μМ) током 48 сати.Коришћењем комерцијално доступног комплета за тестирање МТС, ћелије су подвргнуте стандардном протоколу, а затим измерене коришћењем читача микроплоче на 490 нм.Ниво виталности ћелија група које су истовремено третиране са Б(а)П (10 μМ) и Г-Рг3 (0, 1, 5, 10, 20 μМ) је процењен према горе наведеној методи и упоређен са нетретираном групом.
хЕЛ ћелије су засејане у плоче са 6 бунарчића при густини од 1 × 105 ћелија / бунар и третиране са 10 μМБ (а) П у присуству или одсуству 10 μМ Г-Рг3.После 48 сати третмана, ДНК је екстрахована из хЕЛ ћелија коришћењем КИАамп ДНА Мини Кита у складу са протоколом произвођача.Формирање БПДЕ-ДНК адуката је детектовано коришћењем ЕЛИСА комплета БПДЕ-ДНК адукта.Релативни нивои адукта БПДЕ-ДНК мерени су помоћу читача микроплоче мерењем апсорбанције на 450 нм.
хЕЛ ћелије су засејане у плоче са 96 јажица при густини од 1 × 104 ћелије по бунарчићу и третиране са 10 μМБ (а) П у одсуству или присуству 10 μМ Г-Рг3 током 48 х.ГСТ активност је мерена коришћењем комерцијалног комплета за анализу ГСТ активности према протоколу произвођача.Релативна ГСТ активација је мерена апсорбанцијом на 450 нм коришћењем читача микроплоче.
хЕЛ ћелије су испране ледено хладним ПБС и затим лизиране коришћењем пуфера за радиоимунопреципитацију који садржи инхибиторе протеазе и инхибиторе фосфатазе.Након квантификације протеина коришћењем комплета за анализу укупног протеина, 30 μг протеина у сваком узорку је одвојено са 12% СДС-ПАГЕ и пребачено на ПВДФ мембрану електрофорезом.Мембране су блокиране са 5% обраног млека и инкубиране са примарним антителима преко ноћи на 4°Ц.После инкубације са секундарним антителима коњугованим с пероксидазом рена, додани су реагенси побољшане хемилуминисценције да би се визуелизовао сигнал везивања.Интензитет сваке протеинске траке је квантификован коришћењем софтвера ИмагеЈ.
За анализу свих података коришћен је софтвер ГрапхПад Присм 7.0, изражен као средња вредност ± стандардна девијација.Варијација између третираних група је процењена коришћењем Студентовог т теста или једносмерне анализе варијансе, са П вредношћу <0,05 што указује на статистичку значајност.
Сви подаци добијени или анализирани током ове студије укључени су у овај објављен чланак и датотеке са додатним информацијама.
Торре, ЛА, Сиегел, РЛ и Јемал, А. Статистика рака плућа.прилог.Истекао.лек.биологија.893, 1–19 (2016).
Хецхт, С. Карциногени дувана, њихови биомаркери и рак изазван дуваном.Нат.Рак капелан.3, 733–744 (2003).
Пхиллипс, ДХ и Венитт, С. ДНК и протеински адукти у људским ткивима настали као резултат излагања дуванском диму.интернационалност.Ј. Цанцер.131, 2733–2753 (2012).
Ианг И., Ванг И., Танг К., Лубет РА и Иу М. Ефекат Хоуттуиниа цордата и силибинина на туморигенезу плућа изазвану бензо(а)пиреном код А/Ј мишева.Цанцер 7, 1053–1057 (2005).
Танг, В. ет ал.Природни производ против рака изолован од кинеских медицинских материјала.вилица.лек.6, 27 (2011).
Ианг, И. ет ал.Ефикасност полифенона Е, црвеног гинсенга и рапамицина на туморигенезу плућа изазвану бензо(а)пиреном код А/Ј мишева.Цанцер 8, 52–58 (2006).
Ванг, ЦЗ, Андерсон, С., Ду, В., Хе, ТС и Јуан, КС Ред, учешће у терапији рака.вилица.Ј. Нутт.лек.14, 7–16 (2016).
Лее, ТС, Мазза, Г., Цоттрелл, АС и Гао, Л. Гинсеносидес ин тхе роотс анд леавес оф Америцан гинсенг.Ј. Агриц.Хемија хране.44, 717–720 (1996).
Аттеле АС, Ву ЈА и Иуан КС Фармакологија гинсенга: многе компоненте и многи ефекти.биохемија.фармакологија.58, 1685–1693 (1999).
Време поста: 17.09.2023