Tack för att du besöker Nature.com.Den version av webbläsaren du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläget i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa kontinuerlig support, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Röd ginseng har använts i traditionell asiatisk medicin i hundratals år.I denna studie utvärderade vi förmågan hos fyra typer av röd ginseng (kinesisk röd ginseng, koreansk röd ginseng A, koreansk röd ginseng B och koreansk röd ginseng C) odlade i olika regioner för att hämma bildandet och tillväxten av cancerframkallad lunga tumörer.Ett benso(a)pyren(B(a)P)-test utfördes på A/J-möss, och koreansk röd ginseng B visade sig vara den mest effektiva för att minska tumörbördan bland de fyra röda ginsengvarianterna.Dessutom analyserade vi innehållet av olika ginsenosider (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 och Rg5) i fyra röda ginsengextrakt och fann att koreansk röd ginseng B hade de högsta nivåerna av ginsenosid Rg3 (G-Rg3), vilket tyder på att G-Rg3 kan spela en viktig roll i dess terapeutiska effekt.Detta arbete visar att G-Rg3 har relativt låg biotillgänglighet.När G-Rg3 administrerades samtidigt med P-gp-hämmaren verapamil minskade emellertid utflödet av G-Rg3 till Caco-2-celler, tarmabsorptionshastigheten av G-Rg3 ökade i en råttmodell och G-Rg3 ökades.I Caco-2-celler minskar utflödet av Rg3, och nivån av Rg3-koncentration minskar.G-Rg3 ökar i tarmen och plasman, och dess förmåga att förhindra tumörer förbättras också i en råttmodell av B(a)P-inducerad tumörbildning.Vi fann också att G-Rg3 minskade B(a)P-inducerad cytotoxicitet och DNA-adduktbildning i mänskliga lungceller och återställde uttrycket och aktiviteten av fas II-enzymer genom Nrf2-vägen, vilket kan vara relaterat till den potentiella verkningsmekanismen av G-inhibering -Rg3..Om förekomsten av lungtumörer.Vår studie visar en potentiellt viktig roll för G-Rg3 vid inriktning på lungtumörer i musmodeller.Den orala biotillgängligheten av denna ginsenosid förbättras genom att rikta in sig på P-glykoprotein, vilket gör att molekylen kan utöva anticancereffekter.
Den vanligaste typen av lungcancer är icke-småcellig lungcancer (NSCLC), som är en av de främsta orsakerna till dödsfall i cancer i Kina och Nordamerika1,2.Den främsta faktorn som ökar risken att utveckla icke-småcellig lungcancer är rökning.Cigarettrök innehåller mer än 60 cancerframkallande ämnen, inklusive benso(a)pyren (B(a)P), nitrosaminer och radioaktiva isotoper från sönderfall av radon.3 Polycykliska aromatiska kolväten B(a)P är den främsta orsaken till toxicitet i cigaretter rök.Vid exponering för B(a)P omvandlar cytokrom P450 det till B(a)P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE), som reagerar med DNA för att bilda BPDE-DNA-addukt 4. Dessutom addukter inducerar lungtumörbildning hos möss med tumörstadium och histopatologi som liknar humana lungtumörer5.Denna egenskap gör den B(a)P-inducerade lungcancermodellen till ett lämpligt system för att utvärdera föreningar med möjliga anticanceregenskaper.
En möjlig strategi för att förhindra utvecklingen av lungcancer i högriskgrupper, särskilt rökare, är användningen av kemopreventiva medel för att undertrycka utvecklingen av intraepitelial neoplastiska lesioner och därigenom förhindra deras efterföljande progression till malignitet.Djurstudier visar att olika kemopreventiva medel är effektiva6.Vår tidigare rapport7 lyfte fram de goda förebyggande effekterna av röd ginseng på lungcancer.Denna ört har använts i århundraden inom traditionell asiatisk medicin för att förlänga liv och hälsa, och har dokumenterats ha antitumöreffekter8.
Den aktiva faktorn för ginseng är ginsenosid, som används som en sammansatt markör för att utvärdera kvaliteten på ginsengextrakt.Kvantitativ analys av råginsengextrakt involverar vanligtvis användningen av flera ginsenosider, inklusive RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 och Rc9,10.Ginsenosider har liten klinisk användning på grund av deras mycket dåliga orala biotillgänglighet11.Även om mekanismen för denna dåliga biotillgänglighet inte är klar, kan utflödet av ginsenosider orsakat av P-glykoprotein (P-gp)12 vara orsaken.P-gp är en av de viktigaste effluxtransportörerna i superfamiljen ATP-bindande kassetttransportörer, som använder energin från ATP-hydrolys för att frigöra intracellulära ämnen i den yttre miljön.P-gp-transportörer är vanligtvis utbredda i tarm-, njur-, lever- och blod-hjärnbarriären13.P-gp spelar en avgörande roll för intestinal absorption, och hämning av P-gp ökar den orala absorptionen och tillgängligheten av vissa anticancerläkemedel12,14.Exempel på inhibitorer som tidigare använts i litteraturen är verapamil och cyklosporin A15.Detta arbete innebär att etablera ett mussystem för att studera B(a)P-inducerad lungcancer för att utvärdera förmågan hos olika röda ginsengextrakt från Kina och Korea att påverka maligniteter.Extrakten analyserades individuellt för att identifiera specifika ginsenosider som kan påverka karcinogenesen.Verapamil användes sedan för att rikta in sig på P-gp och förbättra den orala biotillgängligheten och den terapeutiska effekten av cancerinriktade ginsenosider.
Mekanismen genom vilken ginsengsaponiner utövar terapeutiska effekter på karcinogenesen är fortfarande oklar.Forskning har visat att olika ginsenosider kan minska DNA-skador orsakade av cancerframkallande ämnen genom att minska oxidativ stress och aktivera fas II-avgiftningsenzymer och därigenom förhindra cellskador.Glutation S-transferas (GST) är ett typiskt fas II-enzym som krävs för att minska DNA-skador orsakade av cancerframkallande ämnen17.Nukleär erytroid 2-relaterad faktor 2 (Nrf2) är en viktig transkriptionsfaktor som reglerar redoxhomeostas och aktiverar uttrycket av fas II-enzymer och cytoprotektiva antioxidantsvar18.Vår studie undersökte också effekterna av identifierade ginsenosider på att minska B(a)P-inducerad cytotoxicitet och BPDE-DNA-adduktbildning, samt inducera fas II-enzymer genom att modulera Nrf2-vägen i normala lungceller.
Etableringen av en musmodell av B(a)P-inducerad cancer överensstämmer med tidigare arbete5.Figur 1A visar den experimentella designen av en 20-veckors behandling av en muscancermodell inducerad av B(a)P, vatten (kontroll), kinesiskt rött ginsengextrakt (CRG), koreanskt rött ginsengextrakt A (KRGA) och koreanskt rött ginseng.Extrakt B (KRGB) och koreanskt rött ginsengextrakt C (KRGC).Efter 20 veckors behandling med röd ginseng avlivades mössen genom CO2-kvävning.Figur 1B visar makroskopiska lungtumörer hos djur som behandlats med olika typer av röd ginseng, och figur 1C visar ett representativt ljusmikrofoto av ett tumörprov.Tumörbördan för KRGB-behandlade djur (1,5 ± 0,35) var lägre än den för kontrolldjur (0,82 ± 0,2, P < 0,05), som visas i figur ID.Den genomsnittliga graden av tumörbelastningsinhibering var 45 %.Andra testade röda ginsengextrakt visade inte så signifikanta förändringar i tumörbördan (P > 0,05).Inga uppenbara biverkningar observerades i musmodellen under 20 veckors behandling med röd ginseng, inklusive ingen förändring i kroppsvikt (data visas inte) och ingen lever- eller njurtoxicitet (Figur 1E,F).
Rött ginsengextrakt behandlar lungtumörutveckling hos A/J-möss.(A) Experimentell design.(B) Stora lungtumörer i en musmodell.Tumörer indikeras med pilar.a: Kinesisk röd ginsenggrupp.b: grupp A av koreansk röd ginseng.c: Koreansk röd ginseng grupp B. d: Koreansk röd ginseng grupp C. d: Kontrollgrupp.(C) Ljusmikrofotografi som visar en lungtumör.Förstoring: 100. b: 400. (D) Tumörbelastning i gruppen med röda ginsengextrakt.(E) Plasmanivåer av leverenzymet ALT.(F) Plasmanivåer av njurenzymet Cr.Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse.*P <0,05.
De röda ginsengextrakten som identifierades i denna studie analyserades med ultrapresterande vätskekromatografi tandemmasspektrometri (UPLC-MS/MS) för att kvantifiera följande ginsenosider: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rkl och Rg5.De UPLC- och MS-förhållanden som användes för att mäta analyterna beskrevs i en tidigare rapport19.UPLC-MS/MS-kromatogram av fyra röda ginsengextrakt visas i figur 2A.Det fanns signifikanta skillnader i total ginsenosidhalt, med den högsta totala ginsenosidhalten i CRG (590,27 ± 41,28 μmol/L) (Figur 2B).Vid utvärdering av enskilda ginsenosider (Figur 2C) visade KRGB den högsta nivån av G-Rg3 jämfört med andra ginsenosider (58,33 ± 3,81 μmol/L för G-Rg3s och 41,56 ± 2,88 μmol/L för G-Rg3r).L).röd ginseng typ (P < 0,001).G-Rg3 förekommer som ett par stereoisomerer G-Rg3r och G-Rg3s, som skiljer sig i positionen för hydroxylgruppen vid kol 20 (Fig. 2D).Resultaten indikerar att G-Rg3r eller G-Rg3 kan ha viktig anticancerpotential i en B(a)P-inducerad cancermusmodell.
Innehåll av ginsenosider i olika röda ginsengextrakt.(A) UPLC-MS/MS-kromatogram av fyra röda ginsengextrakt.(B) Uppskattning av den totala ginsenosidhalten i de angivna extrakten.(C) Detektion av enskilda ginsenosider i märkta extrakt.(D) Strukturer av ginsenosid stereoisomerer G-Rg3r och G-Rg3s.Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbla bestämningar.***P <0,001.
UPLC-MS/MS-studien krävde kvantifiering av ginsenosider i tarm- och blodprover efter 20 veckors behandling.Behandling med KRGB visade närvaron av endast 0,0063 ± 0,0005 μg/ml Rg5 i blodet.Inga kvarvarande ginsenosider upptäcktes, vilket tyder på dålig oral biotillgänglighet och därför minskad exponering för dessa ginsenosider.
Kolonadenokarcinomcellinjen Caco-2 liknar morfologiskt och biokemiskt humana tarmepitelceller, vilket visar dess användbarhet för att bedöma enterocyttransport över tarmepitelbarriären.Denna analys baserades på en tidigare studie 20 .Figurerna 3A, B, C, D, E, F visar representativa bilder av transcellulär transport av G-Rg3r och G-Rg3 med användning av en Caco-2 monolagermodell.Transcellulär transport av G-Rg3r eller G-Rg3 över Caco-2 monolager från den basolaterala till apikala sidan (Pb-a) var signifikant högre än från den apikala till basolaterala sidan (Pa-b).För G-Rg3r var medelvärdet för Pa-b 0,38 ± 0,06, vilket ökade till 0,73 ± 0,06 efter behandling med 50 μmol/L verapamil och till 1,14 ± 0,09 efter behandling med 100 μmol/L verapamil (p < 0,01 och respektive; Figur 2).3A).Observationer för G-Rg3 följde ett liknande mönster (Fig. 3B), och resultaten visade att verapamilbehandling förbättrade transporten av G-Rg3r och G-Rg3.Verapamilbehandling resulterade också i en signifikant minskning av genomsnittliga Pb-a- och G-Rg3r- och G-Rg3s-utflödesförhållanden (Figur 3C,D,E,F), vilket indikerar att verapamilbehandling minskar ginsenosidinnehållet i Caco-2-utflödesceller..
Transcellulär transport av G-Rg3 i Caco-2 monolager och intestinal absorption i en råttperfusionsanalys.(A) Pa-b-värde för G-Rg3r-gruppen i Caco-2-monoskikt.(B) Pa-b-värde för G-Rg3s-grupper i Caco-2-monoskikt.(C) Pb-värde för G-Rg3r-gruppen i Caco-2-monoskikt.(D) Pb-värde för G-Rg3s-grupper i Caco-2-monoskikt.(E) Utbytesförhållande för G-Rg3r-grupper i ett Caco-2-monoskikt.(F) Utbytesförhållande för G-Rg3-grupper i ett Caco-2-monoskikt.(G) Procentandel av intestinal absorption av G-Rg3r i en perfusionsanalys hos råttor.(H) Procentandel av intestinal absorption av G-Rg3 i en perfusionsanalys hos råttor.Permeabilitet och absorption jämfördes utan tillsats av verapamil.Data uttrycks som medel ± standardavvikelse för fem oberoende experiment.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
I enlighet med tidigare arbete20 utfördes ortotopisk tarmperfusion av råttor för att fastställa om G-Rg3-absorptionen i tarmen ökar efter verapamilbehandling.Figurerna 3G, H visar representativa perfusionsanalyser för att utvärdera procentandelen av intestinal absorption av G-Rg3r och G-Rg3 i cancermodellråttor under ovanstående tidsperioder.Den initiala procentandelen av svagt G-Rg3r-upptag på cirka 10 % ökade till mer än 20 % efter behandling med 50 μM verapamil och till mer än 25 % efter behandling med 100 μM verapamil.På samma sätt visade G-Rg3, som hade ett initialt upptag på 10 %, också en topp på över 20 % efter behandling med 50 μM verapamil och nästan 30 % efter behandling med 100 μM verapamil, vilket tyder på att hämning av P-gp av verapamil ökar intestinal G-absorption Rg3 i en musmodell av lungcancer.
Enligt ovanstående metod delades B(a)P-inducerade cancermodellmöss slumpmässigt in i sex grupper, som visas i figur 4A.Inga signifikanta viktminskningar eller kliniska tecken på toxicitet observerades i G-Rg3-behandlingsgruppen jämfört med kontrollgruppen (data visas ej).Efter 20 veckors behandling samlades lungorna hos varje mus.Figur 4B visar makroskopiska lungtumörer hos möss i ovanstående behandlingsgrupper, och figur 4C visar ett representativt ljusmikrofoto av en representativ tumör.När det gäller tumörbördan i varje grupp (Fig. 4D) var värdena för möss behandlade med G-Rg3r och G-Rg3s 0,75 ± 0,29 mm3 respektive 0,81 ± 0,30 mm3, medan värdena för G-möss behandlade med -Rg3s var 1,63 respektive ±0,40 mm3.kontrollmöss (p < 0,001), vilket indikerar att G-Rg3-behandling minskade tumörbördan hos möss.Administrering av verapamil förstärkte denna minskning ytterligare: värdena hos verapamil+ G-Rg3r-möss minskade från 0,75 ± 0,29 mm3 till 0,33 ± 0,25 mm3 (p < 0,01), och värdena för verapamil+ från 0,81 ± 0,30,30 mm3 minskade till 0,00,291 ± 0,29 mm3 i G. -Rg3s-behandlade möss (p < 0,05), vilket indikerar att verapamil kan förstärka den hämmande effekten av G-Rg3 på tumörbildning.Tumörbördan visade inga signifikanta skillnader mellan kontrollgruppen och verapamilgruppen, G-Rg3r-gruppen och G-Rg3s-gruppen och verapamil+G-Rg3r-gruppen och verapamil+G-Rg3s-gruppen.Dessutom fanns det inga signifikanta lever- eller njurtoxiciteter associerade med de utvärderade behandlingarna (Figur 4E, F).
Tumörbörda efter G-Rg3-behandling och plasma- eller tarmnivåer av G-Rg3r och G-Rg3 i de angivna grupperna.(A) Experimentell design.(B) Makroskopiska tumörer i en musmodell.Tumörer indikeras med pilar.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r i kombination med verapamil.d: G-Rg3 i kombination med verapamil.d: Verapamil.e: kontroll.(C) Optisk mikrofotografi av tumören vid förstoring.Svar: 100x.b: 400X.(D) Effekt av behandling med G-Rg3 + verapamil på tumörbelastning hos A/J-möss.(E) Plasmanivåer av leverenzymet ALT.(F) Plasmanivåer av njurenzymet Cr.(G) Plasmanivåer av G-Rg3r eller G-Rg3 i de angivna grupperna.(H) Nivåer av G-Rg3r eller G-Rg3s i tarmarna i de angivna grupperna.Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbla bestämningar.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
G-Rg3-nivåer i B(a)P-inducerade cancermodellmöss bedömdes med UPLC-MS/MS efter en 20-veckors behandlingsperiod enligt metoden som beskrivs i avsnittet Metoder.Figurerna 4G och H visar plasma- respektive intestinala G-Rg3-nivåer.Plasma-G-Rg3r-nivåerna var 0,44 ± 0,32 μmol/L och ökade till 1,17 ± 0,47 μmol/L med samtidig administrering av verapamil (p < 0,001), medan intestinala G-Rg3r-nivåer var 0,53 ± 0,08 µg/l.I kombination med verapamil ökade g till 1,35 ± 0,13 μg/g (p < 0,001).För G-Rg3 följde resultaten ett liknande mönster, vilket tyder på att verapamilbehandling ökade den orala biotillgängligheten av G-Rg3 i A/J-möss.
Cellviabilitetsanalys användes för att utvärdera cytotoxiciteten av B(a)P och G-Rg3 på hEL-celler.Cytotoxiciteten inducerad av B(a)P i hEL-celler visas i figur 5A, medan de icke-toxiska egenskaperna hos G-Rg3r och G-Rg3 visas i figurerna 5A och 5B.5B, C. För att utvärdera den cytoskyddande effekten av G-Rg3, administrerades B(a)P samtidigt med olika koncentrationer av G-Rg3r eller G-Rg3 i hEL-celler.Som visas i figur 5D återställde G-Rg3r vid koncentrationer av 5 μM, 10 μM och 20 μM cellviabiliteten till 58,3 %, 79,3 % respektive 77,3 %.Liknande resultat kan också ses i G-Rg3s-gruppen.När koncentrationerna av G-Rg3s var 5 µM, 10 µM och 20 µM, återställdes cellviabiliteten till 58,3 %, 72,7 % respektive 76,7 % (Figur 5E).).Närvaron av BPDE-DNA-addukter mättes med användning av ett ELISA-kit.Våra resultat visade att BPDE-DNA-adduktnivåerna ökade i den B(a)P-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen, men jämfört med G-Rg3-sambehandlingen, BPDE-DNA-adduktnivåerna i B(a)P-gruppen B i den behandlade gruppen minskade DNA-adduktnivåerna signifikant.Resultaten av behandling med enbart B(a)P visas i figur 5F (1,87 ± 0,33 vs. 3,77 ± 0,42 för G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 vs. 3,77 ± 0,42 för G-Rg3s, p < 0,001).
Cellviabilitet och BPDE-DNA-adduktbildning i hEL-celler behandlade med G-Rg3 och B(a)P.(A) Viabilitet av hEL-celler behandlade med B(a)P.(B) Viabilitet av hEL-celler behandlade med G-Rg3r.(C) Viabilitet av hEL-celler behandlade med G-Rg3.(D) Viabilitet av hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3r.(E) Viabilitet av hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3.(F) Nivåer av BPDE-DNA-addukt i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3.Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbla bestämningar.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
GST-enzymuttryck detekterades efter samtidig behandling med 10 μM B(a)P och 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.Våra resultat visade att B(a)P undertryckte GST-uttryck (59,7 ± 8,2 % i G-Rg3r-gruppen och 39 ± 4,5 % i G-Rg3s-gruppen), och B(a)P var associerat med antingen G-Rg3r , eller med G-Rg3r, eller med G-Rg3r.Sambehandling med G-Rg3s återställde GST-uttryck.GST-uttryck (103,7 ± 15,5 % i G-Rg3r-gruppen och 110 ± 11,1 % i G-Rg3s-gruppen, p < 0,05 respektive p < 0,001, Fig. 6A, B och C).GST-aktivitet utvärderades med användning av ett aktivitetsanalyskit.Våra resultat visade att kombinationsbehandlingsgruppen hade högre GST-aktivitet jämfört med endast B(a)P-gruppen (96,3 ± 6,6 % vs. 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3r-gruppen vs. 92,3 ± 6,5 i G-Rg3r-gruppen ).% vs 35,7 ± 7,8 % i G-Rg3s-gruppen, p < 0,001, figur 6D).
Uttryck av GST och Nrf2 i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3.(A) Detektion av GST-uttryck genom Western blotting.(B) Kvantitativt uttryck av GST i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3r.(C) Kvantitativt uttryck av GST i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3s.(D) GST-aktivitet i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3.(E) Detektion av Nrf2-uttryck genom Western blotting.(F) Kvantitativt uttryck av Nrf2 i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3r.(G) Kvantitativt uttryck av Nrf2 i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3s.Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbla bestämningar.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
För att klargöra de vägar som är involverade i G-Rg3-medierad suppression av B(a)P-inducerad tumörbildning, bedömdes Nrf2-uttryck med Western blotting.Såsom visas i figurerna 6E,F,G, jämfört med kontrollgruppen, minskade endast nivån av Nrf2 i B(a)P-behandlingsgruppen;Jämfört med B(a)P-behandlingsgruppen ökade dock B(a) Nrf2-nivåerna i PG-Rg3-gruppen (106 ± 9,5 % för G-Rg3r vs. 51,3 ± 6,8 %, 117 ± 6, 2 % för G-Rg3r vs. 41 ± 9,8 % för G-Rg3s, p < 0,01).
Vi bekräftade den förebyggande rollen för Nrf2 genom att undertrycka Nrf2-uttryck med hjälp av specifikt litet störande RNA (siRNA).Nrf2 knockdown bekräftades genom Western blotting (Fig. 7A, B).Som visas i figurerna 7C,D resulterade sambehandling av hEL-celler med B(a)P och G-Rg3 i en minskning av antalet BPDE-DNA-addukter (1,47 ± 0,21) jämfört med behandling med B(a)P enbart i kontroll-siRNA-gruppen.) G-Rg3r var 4,13 ± 0,49, G-Rg3s var 1,8 ± 0,32 och 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Den hämmande effekten av G-Rg3 på BPDE-DNA-bildning avskaffades dock genom Nrf2 knockdown.I siNrf2-gruppen fanns det ingen signifikant skillnad i BPDE-DNA-adduktbildning mellan B(a)P- och G-Rg3-sambehandling och enbart B(a)P-behandling (3,0 ± 0,21 för G-Rg3r vs. 3,56 ± 0,32 ).för G-Rg3r mot 3,6 för G-Rg3s mot ±0,45 mot 4,0±0,37, p > 0,05).
Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktbildning i hEL-celler.(A) Nrf2 knockdown bekräftades genom Western blotting.(B) Kvantifiering av Nrf2-bandintensitet.(C) Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktnivåer i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3r.(D) Effekt av Nrf2 knockdown på BPDE-DNA-adduktnivåer i hEL-celler behandlade med B(a)P och G-Rg3.Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbla bestämningar.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Denna studie utvärderade de förebyggande effekterna av olika röda ginsengextrakt på en musmodell av B(a)P-inducerad lungcancer och KRGB-behandling minskade signifikant tumörbördan.Med tanke på att G-Rg3 har det högsta innehållet i detta ginsengextrakt, har den viktiga rollen för denna ginsenosid för att hämma tumörbildning studerats.Både G-Rg3r och G-Rg3 (två epimerer av G-Rg3) minskade signifikant tumörbördan i en musmodell av B(a)P-inducerad cancer.G-Rg3r och G-Rg3 utövar anticancereffekter genom att inducera apoptos av tumörceller21, hämma tumörtillväxt22, stoppa cellcykeln23 och påverka angiogenes24.G-Rg3 har också visat sig hämma cellulär metastas25, och förmågan hos G-Rg3 att förstärka effekterna av kemoterapi och strålbehandling har dokumenterats26,27.Poon et al visade att G-Rg3-behandling kunde minska de genotoxiska effekterna av B(a)P28.Denna studie visar den terapeutiska potentialen hos G-Rg3 för att rikta cancerframkallande molekyler i miljön och förebygga cancer.
Trots deras goda profylaktiska potential utgör den dåliga orala biotillgängligheten av ginsenosider en utmaning för den kliniska användningen av dessa molekyler.Farmakokinetisk analys av oral administrering av ginsenosider hos råttor visade att dess biotillgänglighet fortfarande är mindre än 5 %29.Dessa tester visade att efter den 20 veckor långa behandlingsperioden minskade endast blodnivåerna av Rg5.Även om den underliggande mekanismen för dålig biotillgänglighet återstår att belysa, tros P-gp vara involverad i utflödet av ginsenosider.Detta arbete visade för första gången att administrering av verapamil, en P-gp-blockerare, ökar den orala biotillgängligheten av G-Rg3r och G-Rg3s.Således tyder detta fynd på att G-Rg3r och G-Rg3s fungerar som substrat för P-gp för att reglera dess utflöde.
Detta arbete visar att kombinationsbehandling med verapamil ökar den orala biotillgängligheten av G-Rg3 i en musmodell av lungcancer.Detta fynd stöds av ökad intestinal transcellulär transport av G-Rg3 vid P-gp-blockad, vilket ökar dess absorption.Analyser i Caco2-celler visade att verapamilbehandling minskade utflödet av G-Rg3r och G-Rg3s samtidigt som membranpermeabiliteten förbättrades.En studie av Yang et al.Studier har visat att behandling med ciklosporin A (en annan P-gp-blockerare) ökar biotillgängligheten av ginsenosid Rh2 från ett baslinjevärde på 1%20 till mer än 30%.Ginsenosiderföreningarna K och Rg1 visade också liknande resultat30,31.När verapamil och ciklosporin A administrerades samtidigt minskade utflödet av förening K i Caco-2-celler signifikant från 26,6 till mindre än 3, medan dess intracellulära nivåer ökade 40-faldigt30.I närvaro av verapamil ökade Rg1-nivåerna i lungepitelceller från råtta, vilket tyder på en roll för P-gp i ginsenosidutflöde, vilket visas av Meng et al.31.Verapamil hade dock inte samma effekt på utflödet av vissa ginsenosider (såsom Rg1, F1, Rh1 och Re), vilket tyder på att de inte påverkas av P-gp-substrat, vilket visas av Liang et al.32 .Denna observation kan vara relaterad till inblandning av andra transportörer och alternativa ginsenosidstrukturer.
Mekanismen för den förebyggande effekten av G-Rg3 på cancer är oklar.Tidigare studier har visat att G-Rg3 förhindrar DNA-skador och apoptos genom att minska oxidativ stress och inflammation16,33, vilket kan vara den underliggande mekanismen för att förhindra B(a)P-inducerad tumörbildning.Vissa rapporter indikerar att genotoxicitet inducerad av B(a)P kan reduceras genom att modulera fas II-enzymer för att bilda BPDE-DNA34.GST är ett typiskt fas II-enzym som hämmar bildning av BPDE-DNA-addukt genom att främja bindningen av GSH till BPDE, och därigenom reducera DNA-skada inducerad av B(a)P35.Våra resultat visar att G-Rg3-behandling minskar B(a)P-inducerad cytotoxicitet och BPDE-DNA-adduktbildning i hEL-celler och återställer GST-uttryck och aktivitet in vitro.Dessa effekter var dock frånvarande i frånvaro av Nrf2, vilket tyder på att G-Rg3 inducerar cytoprotektiva effekter genom Nrf2-vägen.Nrf2 är en viktig transkriptionsfaktor för fas II-avgiftningsenzymer som främjar clearance av xenobiotika36.Aktivering av Nrf2-vägen inducerar cytoskydd och minskar vävnadsskada37.Dessutom har flera rapporter stött rollen av Nrf2 som en tumörsuppressor i karcinogenes38.Vår studie visar att induktion av Nrf2-väg av G-Rg3 spelar en viktig regulatorisk roll i B(a)P-inducerad genotoxicitet genom att orsaka B(a)P-avgiftning genom att aktivera fas II-enzymer, och därigenom hämma tumörbildningsprocessen.
Vårt arbete avslöjar potentialen hos röd ginseng för att förebygga B(a)P-inducerad lungcancer hos möss genom den viktiga involveringen av ginsenosid G-Rg3.Den dåliga orala biotillgängligheten för denna molekyl hämmar dess kliniska tillämpning.Denna studie visar dock för första gången att G-Rg3 är ett substrat för P-gp, och administrering av en P-gp-hämmare ökar biotillgängligheten av G-Rg3 in vitro och in vivo.G-Rg3 minskar B(a)P-inducerad cytotoxicitet genom att reglera Nrf2-vägen, vilket kan vara en potentiell mekanism för dess förebyggande funktion.Vår studie bekräftar potentialen hos ginsenosid G-Rg3 för förebyggande och behandling av lungcancer.
Sex veckor gamla A/J-honmöss (20 ± 1 g) och 7 veckor gamla Wistar-hanråttor (250 ± 20 g) erhölls från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA) och Wuhan Institute of Zoology.universitet (Wuhan, Kina).Chinese Type Culture Collection Center (Wuhan, Kina) försåg oss med Caco-2- och hEL-celler.Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) är en källa till B(a)P och trikaprin.Renade ginsenosider G-Rg3r och G-Rg3s, dimetylsulfoxid (DMSO), CellTiter-96 proliferation assay kit (MTS), verapamil, minimal essential medium (MEM) och fetalt bovint serum (FBS) köptes från Chengdu Must Bio-Technology .Co., Ltd.(Chengdu, Kina).QIAamp DNA mini kit och BPDE-DNA addukt ELISA kit köptes från Qiagen (Stanford, CA, USA) och Cell Biolabs (San Diego, CA, USA).GST-aktivitetsanalyskit och totalproteinanalyskit (standard BCA-metod) köptes från Solarbio (Beijing, Kina).Alla röda ginsengextrakt lagras i Mingyu Laboratory 7. Hong Kong Baptist University (Hong Kong, Kina) och Korea Cancer Center (Seoul, Korea) är kommersiella källor till CRG-extrakt och olika röda ginsengextrakt av olika koreanska ursprung (inklusive KRGA, KRGB och KRGC).Röd ginseng är gjord av rötterna av 6-årig färsk ginseng.Rött ginsengextrakt erhålls genom att tvätta ginseng med vatten tre gånger, sedan koncentrera det vattenhaltiga extraktet och slutligen torka vid låg temperatur för att erhålla ginsengextraktpulver.Antikroppar (anti-Nrf2, anti-GST och β-aktin), pepparrotsperoxidas-konjugerat anti-kanin immunoglobulin G (IgG), transfektionsreagens, kontroll siRNA och Nrf2 siRNA köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .), USA).
Caco2- och hEL-celler odlades i 100 mm2 cellodlingsskålar med MEM innehållande 10% FBS vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.För att bestämma effekten av behandlingsförhållanden inkuberades hEL-celler med olika koncentrationer av B(a)P och G-Rg3 i MEM under 48 timmar.Celler kan ytterligare analyseras eller samlas in för att framställa cellfria extrakt.
Alla experiment godkändes av Experimental Animal Ethics Committee vid Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (Godkännande nr 2019; registreringsnummer 4587TH).Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter, och studien genomfördes i enlighet med riktlinjerna Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Åtta veckor gamla A/J-möss injicerades först intraperitonealt med B(a)P i trikaprinlösning (100 mg/kg, 0,2 ml).Efter en vecka delades mössen slumpmässigt in i kontrollgrupper och olika behandlingsgrupper, 15 möss i varje grupp, och gavs en gång om dagen.Efter 20 veckors behandling avlivades djuren genom CO2-kvävning.Lungorna samlades upp och fixerades under 24 timmar.Antalet ytliga tumörer och individuella tumörstorlekar kvantifierades för varje lunga under ett dissekerande mikroskop.Tumörvolymuppskattningar (V) beräknades med hjälp av följande uttryck: V (mm3) = 4/3πr3, där r är tumördiametern.Nettosumman av alla tumörvolymer i lungorna hos möss representerade den totala tumörvolymen, och den genomsnittliga totala tumörvolymen i varje grupp representerade tumörbelastningen.Helblods- och tarmprover samlades in och lagrades vid -80 °C för UPLC-MS/MS-bestämning.Serum samlades in och en automatiserad kemianalysator användes för att analysera nivåerna av alaninaminotransferas (ALT) och serumkreatinin (Cr) för att bedöma lever- och njurfunktion.
Insamlade prover togs bort från kylförvaring, tinades, vägdes och placerades i rör såsom beskrivits ovan.Till detta sattes 0,5 μM florizin (intern standard) i 0,8 ml metanollösning.Vävnaden homogeniserades sedan med användning av Tissue-Tearor och homogenatet överfördes därefter till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.Blandningen centrifugerades vid 15500 rpm under 15 minuter.Efter att ha avlägsnat 1,0 ml supernatant, torka med kväve.Tvåhundra mikroliter metanol användes för utvinning.Blodet samlas upp och behandlas på en rad och används som referens för alla mätningar.
24-brunnars Transwell-plattor såddes med 1,0 × 105 Caco-2-celler per brunn för att utvärdera den potentiella förbättringen av G-Rg3-transport genom tillsats av verapamil.Efter 3 veckors odling tvättades cellerna med HBSS och förinkuberades vid 37°C.400 μL av 10 μM G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s eller en blandning med 50 eller 100 μM verapamil) injicerades på den basolaterala eller apikala sidan av monoskiktet, och 600 μL HBSS-lösning sattes till den andra sida.Samla upp 100 µl odlingsmedium vid de angivna tidpunkterna (0, 15, 30, 45, 60, 90 och 120 minuter) och tillsätt 100 µl HBSS för att kompensera denna volym.Prover lagrades vid -4 ° C tills detektering med UPLC-MS/MS.Uttrycket Papp = dQ/(dT × A × CO) används för att kvantifiera den skenbara enkelriktade apikala och basolaterala permeabiliteten och vice versa (Pa-b respektive Pb-a);dQ/dT är förändringen i koncentrationen, A (0,6 cm2) är monoskiktets ytarea och CO är den initiala donatorkoncentrationen.Utflödesförhållandet beräknas som Pb-a/Pa-b, vilket representerar utflödeshastigheten för studieläkemedlet.
Wistar-hanråttor fastade i 24 timmar, drack endast vatten och bedövades med en intravenös injektion av 3,5 % pentobarbitallösning.Det intuberade silikonröret har änden av duodenum som ingång och änden av ileum som utgång.Använd en peristaltisk pump för att pumpa inloppet med 10 µM G-Rg3r eller G-Rg3s i isotoniskt HBSS med en flödeshastighet på 0,1 ml/min.Effekten av verapamil utvärderades genom att tillsätta 50 μM eller 100 μM av föreningen till 10 μM G-Rg3r eller G-Rg3s.UPLC-MS/MS utfördes på perfusionsextrakt uppsamlade vid tidpunkterna 60, 90, 120 och 150 minuter efter starten av perfusionen.Procentandelen absorption kvantifieras med formeln % absorption = (1 – Cout/Cin) × 100 %;koncentrationen av G-Rg3 vid utloppet och inloppet uttrycks av Cout respektive Cin.
hEL-celler såddes i 96-brunnars plattor med en densitet av 1 × 104 celler per brunn och behandlades med B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 μM) eller G-Rg3 löst i DMSO .Läkemedlen späddes sedan ut med odlingsmedium till olika koncentrationer (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM) under 48 timmar.Med användning av ett kommersiellt tillgängligt MTS-analyskit utsattes cellerna för ett standardprotokoll och mättes sedan med en mikroplattläsare vid 490 nm.Cellviabilitetsnivån för grupperna som samtidigt behandlades med B(a)P (10 μM) och G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 μM) bedömdes enligt ovanstående metod och jämfördes med den obehandlade gruppen.
hEL-celler såddes i 6-brunnars plattor med en densitet av 1 × 105 celler/brunn och behandlades med 10 μMB(a)P i närvaro eller frånvaro av 10 μM G-Rg3.Efter 48 timmars behandling extraherades DNA från hEL-celler med QIAamp DNA Mini Kit enligt tillverkarens protokoll.Bildandet av BPDE-DNA-addukter detekterades med användning av ett BPDE-DNA-addukt-ELISA-kit.Relativa nivåer av BPDE-DNA-addukt mättes med användning av en mikroplattläsare genom att mäta absorbansen vid 450 nm.
hEL-celler såddes i 96-brunnars plattor med en densitet av 1 × 104 celler per brunn och behandlades med 10 μMB(a)P i frånvaro eller närvaro av 10 μM G-Rg3 under 48 timmar.GST-aktivitet mättes med användning av ett kommersiellt GST-aktivitetsanalyskit enligt tillverkarens protokoll.Relativ GST-aktivering mättes genom absorbans vid 450 nm med användning av en mikroplattläsare.
hEL-celler tvättades med iskall PBS och lyserades sedan med användning av radioimmunoutfällningsanalysbuffert innehållande proteashämmare och fosfatasinhibitorer.Efter proteinkvantifiering med användning av ett totalt proteinanalyskit separerades 30 μg protein i varje prov med 12% SDS-PAGE och överfördes till ett PVDF-membran genom elektrofores.Membran blockerades med 5 % skummjölk och inkuberades med primära antikroppar över natten vid 4°C.Efter inkubation med pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar tillsattes förstärkta kemiluminescensreagenser för att visualisera bindningssignalen.Intensiteten för varje proteinband kvantifierades med hjälp av ImageJ-mjukvara.
GraphPad Prism 7.0 programvara användes för att analysera all data, uttryckt som medelvärde ± standardavvikelse.Variation mellan behandlingsgrupper utvärderades med Students t-test eller envägsanalys av varians, med ett P-värde <0,05 som indikerar statistisk signifikans.
All data som erhållits eller analyserats under denna studie ingår i denna publicerade artikel och kompletterande informationsfiler.
Torre, LA, Siegel, RL och Jemal, A. Lungcancerstatistik.adverb.Utgånget.medicin.biologi.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Tobakscarcinogener, deras biomarkörer och tobaksinducerad cancer.Nat.Cancerpräst.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH och Venitt, S. DNA och proteinaddukter i mänskliga vävnader till följd av exponering för tobaksrök.internationalitet.J. Cancer.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA och Yu M. Effekt av Houttuynia cordata och silibinin på benso(a)pyren-inducerad lungtumörbildning hos A/J-möss.Cancer 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. et al.Anticancer naturlig produkt isolerad från kinesiska medicinska material.käke.medicin.6, 27 (2011).
Yang, Y. et al.Effekten av polyfenon E, röd ginseng och rapamycin på benso(a)pyreninducerad lungtumörbildning hos A/J-möss.Cancer 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS och Yuan, KS Red, engagemang i cancerterapi.käke.J. Nutt.medicin.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS och Gao, L. Ginsenosider i rötter och blad av amerikansk ginseng.J. Agric.Matkemi.44, 717-720 (1996).
Attele AS, Wu JA och Yuan KS Farmakologi av ginseng: många komponenter och många effekter.biokemi.farmakologi.58, 1685-1693 (1999).
Posttid: 2023-09-17