Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для отримання найкращих результатів рекомендуємо використовувати новішу версію вашого браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів або JavaScript.
Червоний женьшень використовується в традиційній азіатській медицині протягом сотень років.У цьому дослідженні ми оцінили здатність чотирьох типів червоного женьшеню (китайського червоного женьшеню, корейського червоного женьшеню A, корейського червоного женьшеню B і корейського червоного женьшеню C), вирощених у різних регіонах, пригнічувати утворення та ріст канцерогенних легень. пухлини.Тест на бензо(а)пірен (B(a)P) проводився на мишах A/J, і було встановлено, що корейський червоний женьшень B є найефективнішим у зниженні тягаря пухлини серед чотирьох різновидів червоного женьшеню.Крім того, ми проаналізували вміст різних гінзенозидів (Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 і Rg5) у чотирьох екстрактах червоного женьшеню і виявили, що корейський червоний женьшень B мав найвищі рівні гінзенозиду Rg3 (G-Rg3), що свідчить про те, що G-Rg3 може відігравати важливу роль у його терапевтичній ефективності.Ця робота показує, що G-Rg3 має відносно низьку біодоступність.Однак, коли G-Rg3 вводили разом з інгібітором P-gp верапамілом, відтік G-Rg3 в клітини Caco-2 зменшувався, швидкість кишкового всмоктування G-Rg3 збільшувалася в моделі щурів, і G-Rg3 було збільшено.У клітинах Caco-2 зменшується відтік Rg3, знижується рівень концентрації Rg3.G-Rg3 збільшується в кишечнику та плазмі, і його здатність запобігати пухлинам також посилюється на щурячій моделі B(a)P-індукованого пухлиногенезу.Ми також виявили, що G-Rg3 знижує індуковану B(a)P цитотоксичність і утворення аддукту ДНК у клітинах легенів людини, а також відновлює експресію та активність ферментів фази II через шлях Nrf2, що може бути пов’язано з потенційним механізмом дії інгібування G -Rg3..Про виникнення пухлин легень.Наше дослідження демонструє потенційно важливу роль G-Rg3 у націленні на пухлини легенів у моделях мишей.Біодоступність цього гінзенозиду при пероральному прийомі посилюється шляхом націлювання на Р-глікопротеїн, що дозволяє молекулі проявляти протиракову дію.
Найпоширенішим видом раку легенів є недрібноклітинний рак легенів (НДРЛ), який є однією з основних причин смертності від раку в Китаї та Північній Америці1,2.Основним фактором, що підвищує ризик розвитку недрібноклітинного раку легенів, є куріння.Сигаретний дим містить понад 60 канцерогенів, у тому числі бенз(а)пірен (B(a)P), нітрозаміни та радіоактивні ізотопи, отримані при розпаді радону.3 Поліциклічні ароматичні вуглеводні B(a)P є основною причиною токсичності сигарет. дим.Під впливом B(a)P цитохром P450 перетворює його на B(a)P-7,8-дигідродіол-9,10-епоксид (BPDE), який реагує з ДНК з утворенням аддукту 4 BPDE-ДНК. Крім того, ці адукти індукують пухлиноутворення легенів у мишей зі стадією пухлини та гістопатологією, подібною до пухлин легенів людини5.Ця особливість робить модель B(a)P-індукованого раку легенів придатною системою для оцінки сполук з можливими протираковими властивостями.
Однією з можливих стратегій запобігання розвитку раку легенів у групах високого ризику, особливо курців, є використання хіміопрофілактичних засобів для придушення розвитку інтраепітеліальних неопластичних уражень і, таким чином, запобігання їх подальшого прогресування до злоякісного новоутворення.Дослідження на тваринах показують ефективність різних хіміопрофілактичних засобів6.У нашому попередньому звіті7 було підкреслено хороший профілактичний вплив червоного женьшеню на рак легенів.Цю траву протягом століть використовували в традиційній азіатській медицині для продовження життя та здоров’я, а також задокументовано її протипухлинну дію8.
Активним фактором женьшеню є гінзенозид, який використовується як складний маркер для оцінки якості екстрактів женьшеню.Кількісний аналіз сирих екстрактів женьшеню зазвичай передбачає використання кількох гінзенозидів, включаючи RK1, Rg1, F1, Re, Rb1, Rb2, Rb3, Rd, Rh1, Rh2, Rg3, Rg5 і Rc9,10.Гінзенозиди мало застосовуються в клінічній практиці через їх дуже низьку біодоступність при пероральному прийомі11.Хоча механізм такої низької біодоступності не ясний, причиною може бути відтік гінзенозидів, спричинений P-глікопротеїном (P-gp)12.P-gp є одним із найважливіших ефлюксних транспортерів у надродині касетних транспортерів, що зв’язують АТФ, який використовує енергію гідролізу АТФ для вивільнення внутрішньоклітинних речовин у зовнішнє середовище.Транспортери P-gp зазвичай широко поширені в кишечнику, нирках, печінці та гематоенцефалічному бар’єрі13.P-gp відіграє вирішальну роль у кишковому всмоктуванні, а інгібування P-gp збільшує всмоктування при пероральному прийомі та доступність деяких протипухлинних препаратів12,14.Прикладами інгібіторів, які раніше використовувалися в літературі, є верапаміл і циклоспорин А15.Ця робота передбачає створення мишачої системи для вивчення B(a)P-індукованого раку легенів, щоб оцінити здатність різних екстрактів червоного женьшеню з Китаю та Кореї впливати на злоякісні пухлини.Екстракти були індивідуально проаналізовані для визначення конкретних гінзенозидів, які можуть впливати на канцерогенез.Потім верапаміл використовувався для націлювання на P-gp і покращення пероральної біодоступності та терапевтичної ефективності гінзенозидів, спрямованих на рак.
Механізм, за допомогою якого сапоніни женьшеню справляють терапевтичний вплив на канцерогенез, залишається неясним.Дослідження показали, що різні гінзенозиди можуть зменшити пошкодження ДНК, викликане канцерогенами, зменшуючи окислювальний стрес і активуючи ферменти детоксикації II фази, тим самим запобігаючи пошкодженню клітин.Глутатіон-S-трансфераза (GST) є типовим ферментом фази II, необхідним для зменшення пошкодження ДНК, викликаного канцерогенами17.Пов'язаний з ядерним еритроїдом 2 фактор 2 (Nrf2) є важливим фактором транскрипції, який регулює окислювально-відновний гомеостаз і активує експресію ферментів фази II і цитопротекторні антиоксидантні реакції18.Наше дослідження також вивчало вплив ідентифікованих гінзенозидів на зниження B(a)P-індукованої цитотоксичності та утворення аддукту BPDE-ДНК, а також індукцію ферментів фази II шляхом модуляції шляху Nrf2 у нормальних клітинах легенів.
Створення мишачої моделі B(a)P-індукованого раку узгоджується з попередньою роботою5.На малюнку 1A показано експериментальний дизайн 20-тижневого лікування мишачої моделі раку, індукованого B(a)P, водою (контроль), екстрактом китайського червоного женьшеню (CRG), корейським екстрактом червоного женьшеню A (KRGA) і корейським червоним женьшень.Екстракт B (KRGB) і екстракт корейського червоного женьшеню C (KRGC).Після 20 тижнів лікування червоним женьшенем мишей умертвили шляхом задушення CO2.На малюнку 1B показані макроскопічні пухлини легень у тварин, які отримували різні типи червоного женьшеню, а на малюнку 1C показана репрезентативна світлова мікрофотографія зразка пухлини.Пухлинний тягар у тварин, які отримували KRGB (1,5 ± 0,35), був нижчим, ніж у контрольних тварин (0,82 ± 0,2, P <0,05), як показано на малюнку 1D.Середній ступінь інгібування пухлинного навантаження становив 45%.Інші протестовані екстракти червоного женьшеню не показали таких значних змін у навантаженні пухлиною (P> 0,05).Протягом 20 тижнів лікування червоним женьшенем не спостерігалося жодних очевидних побічних ефектів у моделі миші, включаючи відсутність зміни маси тіла (дані не показані) і відсутність токсичності для печінки чи нирок (рис. 1E, F).
Екстракт червоного женьшеню лікує розвиток пухлини легенів у мишей A/J.(A) Експериментальний план.(B) Великі пухлини легенів у моделі миші.Пухлини позначені стрілками.a: Група китайського червоного женьшеню.б: група А корейського червоного женьшеню.c: група корейського червоного женьшеню B. d: група корейського червоного женьшеню C. d: контрольна група.(C) Світлова мікрофотографія, яка показує пухлину легені.Збільшення: 100. b: 400. (D) Пухлинне навантаження в групі екстракту червоного женьшеню.(E) Рівні печінкового ферменту ALT у плазмі.(F) Рівень ниркового ферменту Cr у плазмі.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення.*P <0,05.
Екстракти червоного женьшеню, ідентифіковані в цьому дослідженні, були проаналізовані за допомогою ультраефективної рідинної хроматографічної тандемної мас-спектрометрії (UPLC-MS/MS) для кількісного визначення таких гінзенозидів: Rg1, Re, Rc, Rb2, Rb3, Rb1, Rh1, Rd, Rg3, Rh2, F1, Rk1 і Rg5.Умови UPLC та MS, що використовуються для вимірювання аналітів, були описані в попередньому звіті19.UPLC-MS/MS хроматограми чотирьох екстрактів червоного женьшеню показані на малюнку 2A.Існували значні відмінності в загальному вмісті гінзенозиду, з найвищим загальним вмістом гінзенозиду в CRG (590,27 ± 41,28 мкмоль/л) (рис. 2B).При оцінці окремих гінзенозидів (рис. 2C) KRGB показав найвищий рівень G-Rg3 порівняно з іншими гінзенозидами (58,33 ± 3,81 мкмоль/л для G-Rg3s і 41,56 ± 2,88 мкмоль/л для G-Rg3r).L).типу червоного женьшеню (P <0,001).G-Rg3 зустрічається як пара стереоізомерів G-Rg3r і G-Rg3s, які відрізняються положенням гідроксильної групи при вуглеці 20 (рис. 2D).Результати показують, що G-Rg3r або G-Rg3 можуть мати важливий протираковий потенціал у B(a)P-індукованої ракової моделі миші.
Вміст гінзенозидів у різних екстрактах червоного женьшеню.(A) UPLC-MS/MS хроматограми чотирьох екстрактів червоного женьшеню.(B) Оцінка загального вмісту гінзенозидів у вказаних екстрактах.(C) Виявлення окремих гінзенозидів у мічених екстрактах.(D) Структури стереоізомерів гінзенозиду G-Rg3r і G-Rg3s.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення трьох повторів.***P <0,001.
Дослідження UPLC-MS/MS вимагало кількісного визначення гінзенозидів у кишкових зразках і зразках крові після 20 тижнів лікування.Лікування KRGB показало наявність лише 0,0063 ± 0,0005 мкг/мл Rg5 у крові.Жодних залишків гінзенозидів виявлено не було, що вказує на низьку біодоступність при пероральному прийомі і, отже, на зниження впливу цих гінзенозидів.
Лінія клітин аденокарциноми товстої кишки Caco-2 морфологічно та біохімічно подібна до епітеліальних клітин кишечника людини, демонструючи її корисність для оцінки транспорту ентероцитів через епітеліальний бар’єр кишечника.Цей аналіз базувався на попередньому дослідженні 20 .На малюнках 3A, B, C, D, E, F показано репрезентативні зображення міжклітинного транспорту G-Rg3r і G-Rg3 з використанням моношарової моделі Caco-2.Трансцелюлярний транспорт G-Rg3r або G-Rg3 через моношари Caco-2 від базолатеральної до апікальної сторони (Pb-a) був значно вищим, ніж від апікальної до базолатеральної сторони (Pa-b).Для G-Rg3r середнє значення Pa-b становило 0,38 ± 0,06, яке зросло до 0,73 ± 0,06 після лікування 50 мкмоль/л верапамілу та до 1,14 ± 0,09 після лікування 100 мкмоль/л верапамілу (p <0,01 і 0,001, відповідно; малюнок 2).3A).Спостереження за G-Rg3 відбувалися за подібною схемою (рис. 3B), і результати показали, що лікування верапамілом посилює транспорт G-Rg3r і G-Rg3.Лікування верапамілом також призвело до значного зниження середніх коефіцієнтів витоку Pb-a і G-Rg3r і G-Rg3s (рис. 3C, D, E, F), що вказує на те, що лікування верапамілом знижує вміст гінзенозиду в ефлюксних клітинах Caco-2..
Трансцелюлярний транспорт G-Rg3 в моношарах Caco-2 і кишкова абсорбція в аналізі перфузії щурів.(A) Значення Pa-b групи G-Rg3r у моношарі Caco-2.(B) Значення Pa-b груп G-Rg3s у моношарі Caco-2.(C) Значення Pb групи G-Rg3r у моношарі Caco-2.(D) Значення Pb груп G-Rg3s у моношарі Caco-2.(E) Коефіцієнт виходу груп G-Rg3r у моношарі Caco-2.(F) Коефіцієнт виходу груп G-Rg3 у моношарі Caco-2.(G) Відсоток кишкової абсорбції G-Rg3r в аналізі перфузії у щурів.(H) Відсоток кишкової абсорбції G-Rg3 в аналізі перфузії у щурів.Проникність і всмоктування порівнювали без додавання верапамілу.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення п'яти незалежних експериментів.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Відповідно до попередньої роботи20, ортотопічна кишкова перфузія щурів була проведена, щоб визначити, чи збільшується всмоктування G-Rg3 у кишечнику після лікування верапамілом.Фігури 3G, H показують репрезентативні аналізи перфузії для оцінки відсотка кишкового всмоктування G-Rg3r і G-Rg3 у щурів на моделі раку протягом зазначених вище періодів часу.Початковий відсоток слабкого поглинання G-Rg3r приблизно на 10% збільшився до більш ніж 20% після лікування 50 мкМ верапамілу та до більш ніж 25% після лікування 100 мкМ верапамілу.Подібним чином G-Rg3, який мав початкове поглинання 10%, також продемонстрував пік понад 20% після лікування 50 мкМ верапамілом і майже 30% після лікування 100 мкМ верапамілом, що свідчить про те, що інгібування P-gp верапамілом посилює Кишкова G-абсорбція Rg3 в мишачій моделі раку легенів.
Відповідно до вищеописаного методу мишей моделі раку, індукованого B(a)P, випадковим чином розділили на шість груп, як показано на малюнку 4A.У групі лікування G-Rg3 не спостерігалося значної втрати ваги або клінічних ознак токсичності порівняно з контрольною групою (дані не показані).Після 20 тижнів лікування легені кожної миші були зібрані.На Фігурі 4B показані макроскопічні пухлини легенів у мишей у вищевказаних групах лікування, а на Фігурі 4C показана репрезентативна світлова мікрофотографія типової пухлини.Що стосується пухлинного навантаження в кожній групі (рис. 4D), значення для мишей, які отримували G-Rg3r і G-Rg3s, становили 0,75 ± 0,29 мм3 і 0,81 ± 0,30 мм3 відповідно, тоді як значення для мишей, які отримували G-Rg3r і G-Rg3s, відповідно. з -Rg3s були 1,63 відповідно ±0,40 мм3.контрольних мишей (p <0,001), що вказує на те, що лікування G-Rg3 зменшило тягар пухлини у мишей.Введення верапамілу ще більше посилювало це зниження: значення у мишей верапамілу+ G-Rg3r знизилися з 0,75 ± 0,29 мм3 до 0,33 ± 0,25 мм3 (p < 0,01), а значення для верапамілу+ з 0,81 ± 0,30 мм3 знизилися до 0,29 ± 0,21 мм3 у мишей, які отримували G. -Rg3s (p <0,05), що вказує на те, що верапаміл може посилити інгібуючу дію G-Rg3 на пухлиноутворення.Пухлинний тягар не показав істотних відмінностей між контрольною групою та групою верапамілу, групою G-Rg3r та групою G-Rg3s, а також групою верапаміл+G-Rg3r та групою верапаміл+G-Rg3s.Крім того, не було виявлено значних токсичних впливів на печінку або нирки, пов’язаних з оцінюваними методами лікування (рис. 4E, F).
Пухлинний тягар після лікування G-Rg3 і рівні G-Rg3r і G-Rg3 у плазмі або кишечнику у зазначених групах.(A) Експериментальний план.(B) Макроскопічні пухлини в моделі миші.Пухлини позначені стрілками.a: G-Rg3r.b: G-Rg3s.c: G-Rg3r у комбінації з верапамілом.d: G-Rg3 у комбінації з верапамілом.г: Верапаміл.е: контроль.(C) Оптична мікрофотографія пухлини при збільшенні.Відповідь: 100x.b: 400X.(D) Вплив лікування G-Rg3 + верапамілом на пухлинний тягар у мишей A/J.(E) Рівні печінкового ферменту ALT у плазмі.(F) Рівень ниркового ферменту Cr у плазмі.(G) Рівні G-Rg3r або G-Rg3 зазначених груп у плазмі.(H) Рівні G-Rg3r або G-Rg3s в кишечнику вказаних груп.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення трьох повторів.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Рівні G-Rg3 у B(a)P-індукованих модельних мишей раку оцінювали за допомогою UPLC-MS/MS після 20-тижневого періоду лікування згідно з методом, описаним у розділі «Методи».Фігури 4G і H показують рівні G-Rg3 у плазмі та кишечнику відповідно.Рівень G-Rg3r у плазмі становив 0,44 ± 0,32 мкмоль/л і підвищувався до 1,17 ± 0,47 мкмоль/л при одночасному застосуванні верапамілу (p < 0,001), тоді як рівень G-Rg3r у кишечнику становив 0,53 ± 0,08 мкг/л.При поєднанні з верапамілом g збільшувався до 1,35 ± 0,13 мкг/г (p < 0,001).Для G-Rg3 результати були аналогічні, вказуючи на те, що лікування верапамілом збільшило біодоступність G-Rg3 при пероральному прийомі у мишей A/J.
Аналіз життєздатності клітин використовували для оцінки цитотоксичності B(a)P і G-Rg3 на клітинах hEL.Цитотоксичність, індукована B(a)P у клітинах hEL, показана на малюнку 5A, тоді як нетоксичні властивості G-Rg3r та G-Rg3 показані на малюнках 5A та 5B.5B, C. Щоб оцінити цитопротекторний ефект G-Rg3, B(a)P вводили разом з різними концентраціями G-Rg3r або G-Rg3 у клітини hEL.Як показано на малюнку 5D, G-Rg3r у концентраціях 5 мкМ, 10 мкМ і 20 мкМ відновив життєздатність клітин до 58,3%, 79,3% і 77,3% відповідно.Подібні результати також можна побачити в групі G-Rg3s.Коли концентрації G-Rg3s становили 5 мкМ, 10 мкМ і 20 мкМ, життєздатність клітин відновилася до 58,3%, 72,7% і 76,7% відповідно (Малюнок 5E).).Наявність адуктів BPDE-ДНК вимірювали за допомогою набору ELISA.Наші результати показали, що рівні аддукту BPDE-ДНК були підвищені в групі, яка отримувала B(a)P, порівняно з контрольною групою, але порівняно з сумісним лікуванням G-Rg3 рівні аддукту BPDE-ДНК у групі B(a)P B у групі лікування рівні аддукту ДНК були значно знижені.Результати лікування лише B(a)P показано на малюнку 5F (1,87 ± 0,33 проти 3,77 ± 0,42 для G-Rg3r, 1,93 ± 0,48 проти 3,77 ± 0,42 для G -Rg3s, p < 0,001).
Життєздатність клітин і утворення аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL, оброблених G-Rg3 і B(a)P.(A) Життєздатність клітин hEL, оброблених B(a)P.(B) Життєздатність клітин hEL, оброблених G-Rg3r.(C) Життєздатність клітин hEL, оброблених G-Rg3.(D) Життєздатність клітин hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3r.(E) Життєздатність клітин hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3.(F) Рівні аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL, оброблених B(a)P та G-Rg3.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення трьох повторів.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Експресію ферменту GST було виявлено після спільної обробки 10 мкМ B(a)P і 10 мкМ G-Rg3r або G-Rg3s.Наші результати показали, що B(a)P пригнічує експресію GST (59,7 ± 8,2% у групі G-Rg3r і 39 ± 4,5% у групі G-Rg3s), а B(a)P асоціюється або з G-Rg3r , або з G-Rg3r, або з G-Rg3r.Спільне лікування G-Rg3s відновило експресію GST.Експресія GST (103,7 ± 15,5 % у групі G-Rg3r і 110 ± 11,1 % у групі G-Rg3s, p < 0,05 і p < 0,001 відповідно, рис. 6A, B і C).Активність GST оцінювали за допомогою набору для аналізу активності.Наші результати показали, що група комбінованого лікування мала вищу активність GST порівняно з групою лише B(a)P (96,3 ± 6,6% проти 35,7 ± 7,8% у групі G-Rg3r проти 92,3 ± 6,5 у групі G-Rg3r ).% проти 35,7 ± 7,8 % у групі G-Rg3s, p < 0,001, рис. 6D).
Експресія GST і Nrf2 в клітинах hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3.(A) Виявлення експресії GST методом Вестерн-блот.(B) Кількісна експресія GST в клітинах hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3r.(C) Кількісна експресія GST в клітинах hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3s.(D) Активність GST в клітинах hEL, оброблених B(a)P і G-Rg3.(E) Виявлення експресії Nrf2 методом Вестерн-блот.(F) Кількісна експресія Nrf2 у клітинах hEL, оброблених B(a)P та G-Rg3r.(G) Кількісна експресія Nrf2 у клітинах hEL, оброблених B(a)P та G-Rg3s.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення трьох повторів.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Для з’ясування шляхів, залучених до опосередкованого G-Rg3 пригнічення B(a)P-індукованого пухлинотворення, експресію Nrf2 оцінювали за допомогою вестерн-блоттингу.Як показано на малюнках 6E, F, G, порівняно з контрольною групою, лише рівень Nrf2 у групі лікування B(a)P був знижений;однак, порівняно з групою лікування B(a)P, рівні B(a) Nrf2 у групі PG-Rg3 були підвищені (106 ± 9,5% для G-Rg3r проти 51,3 ± 6,8%, 117 ± 6,2% для G-Rg3r проти 41 ± 9,8% для G-Rg3s, p < 0,01).
Ми підтвердили профілактичну роль Nrf2, пригнічуючи експресію Nrf2 за допомогою специфічної малої інтерферуючої РНК (siRNA).Нокдаун Nrf2 підтверджено вестерн-блоттингом (рис. 7A, B).Як показано на малюнках 7C, D, спільне лікування клітин hEL B(a)P і G-Rg3 призвело до зменшення кількості адуктів BPDE-ДНК (1,47 ± 0,21) порівняно з лікуванням B(a)P тільки в контрольній групі siRNA.) G-Rg3r становив 4,13 ± 0,49, G-Rg3s становив 1,8 ± 0,32 і 4,1 ± 0,57, p < 0,01).Однак інгібуючий ефект G-Rg3 на утворення BPDE-ДНК був скасований нокдауном Nrf2.У групі siNrf2 не було значної різниці в утворенні аддукту BPDE-ДНК між сумісним лікуванням B(a)P і G-Rg3 і лікуванням лише B(a)P (3,0 ± 0,21 для G-Rg3r проти 3,56 ± 0,32 ).для G-Rg3r проти 3,6 для G-Rg3s проти ±0,45 проти 4,0±0,37, p > 0,05).
Вплив нокдауну Nrf2 на утворення аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL.(A) Нокдаун Nrf2 підтверджено вестерн-блоттингом.(B) Кількісна оцінка інтенсивності смуги Nrf2.(C) Вплив нокдауну Nrf2 на рівні аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL, оброблених B(a)P та G-Rg3r.(D) Вплив нокдауну Nrf2 на рівні аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL, оброблених B(a)P та G-Rg3.Дані виражені як середнє ± стандартне відхилення трьох повторів.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Це дослідження оцінювало профілактичні ефекти різних екстрактів червоного женьшеню на мишачій моделі B(a)P-індукованого раку легенів, і лікування KRGB значно зменшило тягар пухлини.Враховуючи, що G-Rg3 має найвищий вміст у цьому екстракті женьшеню, була вивчена важлива роль цього гінзенозиду в інгібуванні пухлиноутворення.І G-Rg3r, і G-Rg3 (два епімери G-Rg3) значно зменшили пухлинний тягар у мишачій моделі B(a)P-індукованого раку.G-Rg3r і G-Rg3 виявляють протипухлинну дію, індукуючи апоптоз пухлинних клітин21, пригнічуючи ріст пухлини22, зупиняючи клітинний цикл23 і впливаючи на ангіогенез24.Також було показано, що G-Rg3 пригнічує клітинні метастази25, а також задокументовано здатність G-Rg3 посилювати ефекти хіміотерапії та променевої терапії26,27.Пун та інші продемонстрували, що лікування G-Rg3 може зменшити генотоксичні ефекти B(a)P28.Це дослідження демонструє терапевтичний потенціал G-Rg3 у націленні на канцерогенні молекули навколишнього середовища та запобіганні раку.
Незважаючи на хороший профілактичний потенціал, низька біодоступність гінзенозидів при пероральному прийомі створює проблему для клінічного використання цих молекул.Фармакокінетичний аналіз перорального введення гінзенозидів щурам показав, що його біодоступність все ще становить менше 5%29.Ці тести показали, що після 20-тижневого періоду лікування знизився лише рівень Rg5 у крові.Хоча основний механізм низької біодоступності ще належить з’ясувати, вважається, що P-gp бере участь у виведенні гінзенозидів.Ця робота вперше продемонструвала, що введення верапамілу, блокатора P-gp, підвищує пероральну біодоступність G-Rg3r і G-Rg3s.Таким чином, це відкриття свідчить про те, що G-Rg3r і G-Rg3s діють як субстрати P-gp для регулювання його витоку.
Ця робота демонструє, що комбіноване лікування верапамілом підвищує пероральну біодоступність G-Rg3 у мишачої моделі раку легенів.Цей висновок підтверджується посиленням кишкового трансцелюлярного транспорту G-Rg3 після блокади P-gp, тим самим збільшуючи його всмоктування.Дослідження на клітинах Caco2 показали, що лікування верапамілом зменшує відтік G-Rg3r і G-Rg3s, одночасно покращуючи проникність мембрани.Дослідження Yang et al.Дослідження показали, що лікування циклоспорином А (іншим блокатором P-gp) підвищує біодоступність гінзенозиду Rh2 з вихідного значення 1%20 до понад 30%.Гінзенозидні сполуки K і Rg1 також показали подібні результати30,31.При одночасному введенні верапамілу та циклоспорину А відтік сполуки K у клітинах Caco-2 значно зменшився з 26,6 до менше 3, тоді як його внутрішньоклітинні рівні зросли в 40 разів30.У присутності верапамілу рівень Rg1 підвищувався в епітеліальних клітинах легенів щурів, що свідчить про роль P-gp у витоці гінзенозиду, як показали Meng et al.31.Однак верапаміл не мав такого ж впливу на витікання деяких гінзенозидів (таких як Rg1, F1, Rh1 і Re), що вказує на те, що на них не впливають субстрати P-gp, як показано Liang et al.32 .Це спостереження може бути пов’язане із залученням інших транспортерів та альтернативних гінзенозидних структур.
Механізм профілактичного впливу G-Rg3 на рак неясний.Попередні дослідження показали, що G-Rg3 запобігає пошкодженню ДНК і апоптозу, зменшуючи окислювальний стрес і запалення16,33, що може бути основним механізмом запобігання B(a)P-індукованого пухлиногенезу.Деякі звіти показують, що генотоксичність, спричинену B(a)P, може бути зменшена шляхом модуляції ферментів фази II для утворення BPDE-DNA34.GST є типовим ферментом фази II, який інгібує утворення аддукту BPDE-ДНК шляхом сприяння зв’язуванню GSH з BPDE, таким чином зменшуючи пошкодження ДНК, викликане B(a)P35.Наші результати показують, що лікування G-Rg3 зменшує B(a)P-індуковану цитотоксичність і утворення аддукту BPDE-ДНК у клітинах hEL і відновлює експресію та активність GST in vitro.Однак ці ефекти були відсутні за відсутності Nrf2, що свідчить про те, що G-Rg3 індукує цитопротекторні ефекти через шлях Nrf2.Nrf2 є основним фактором транскрипції для ферментів фази II детоксикації, який сприяє виведенню ксенобіотиків36.Активація шляху Nrf2 індукує цитозахист і зменшує пошкодження тканин37.Крім того, кілька звітів підтверджують роль Nrf2 як супресора пухлини в канцерогенезі38.Наше дослідження показує, що індукція шляху Nrf2 за допомогою G-Rg3 відіграє важливу регуляторну роль у B(a)P-індукованій генотоксичності, викликаючи детоксикацію B(a)P шляхом активації ферментів фази II, тим самим пригнічуючи процес пухлиноутворення.
Наша робота розкриває потенціал червоного женьшеню в запобіганні B(a)P-індукованого раку легенів у мишей через важливу участь гінзенозиду G-Rg3.Погана пероральна біодоступність цієї молекули перешкоджає її клінічному застосуванню.Однак це дослідження вперше показує, що G-Rg3 є субстратом P-gp, і введення інгібітора P-gp збільшує біодоступність G-Rg3 in vitro та in vivo.G-Rg3 зменшує B(a)P-індуковану цитотоксичність, регулюючи шлях Nrf2, що може бути потенційним механізмом його профілактичної функції.Наше дослідження підтверджує потенціал гінзенозиду G-Rg3 для профілактики та лікування раку легенів.
Шеститижневі самки мишей A/J (20 ± 1 г) і 7-тижневі самці щурів Wistar (250 ± 20 г) були отримані з Джексонівської лабораторії (Бар-Харбор, США) та Уханьського інституту зоології.ун-ту (м. Ухань, Китай).Китайський центр збору типових культур (Ухань, Китай) надав нам клітини Caco-2 і hEL.Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, США) є джерелом B(a)P і трикаприну.Очищені гінзенозиди G-Rg3r і G-Rg3s, диметилсульфоксид (DMSO), набір для аналізу проліферації CellTiter-96 (MTS), верапаміл, мінімальне незамінне середовище (MEM) і фетальну бичачу сироватку (FBS) були придбані в Chengdu Must Bio-Technology. .Лтд.(Ченду, Китай).Міні-набір QIAamp DNA і BPDE-DNA аддукт ELISA набір були придбані у Qiagen (Стенфорд, Каліфорнія, США) і Cell Biolabs (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).Набір для аналізу активності GST і набір для аналізу загального білка (стандартний метод BCA) були придбані в компанії Solarbio (Пекін, Китай).Усі екстракти червоного женьшеню зберігаються в лабораторії Mingyu 7. Гонконгський баптистський університет (Гонконг, Китай) і Корейський онкологічний центр (Сеул, Корея) є комерційними джерелами екстракту CRG і різноманітних екстрактів червоного женьшеню різного корейського походження (включаючи KRGA, KRGB). і KRGC).Червоний женьшень виготовляється з коренів 6-річного свіжого женьшеню.Екстракт червоного женьшеню отримують шляхом тричі промивання женьшеню водою, потім концентрування водного екстракту і, нарешті, висушування при низькій температурі для отримання порошку екстракту женьшеню.Антитіла (анти-Nrf2, анти-GST і β-актин), кон’югований з пероксидазою хрону антикролячий імуноглобулін G (IgG), реагент для трансфекції, контрольна siRNA і Nrf2 siRNA були придбані в Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Каліфорнія) .), США).
Клітини Caco2 і hEL культивували в чашках для культур клітин 100 мм2 з MEM, що містить 10% FBS, при 37 °C у зволоженій атмосфері з 5% CO2.Щоб визначити вплив умов лікування, клітини hEL інкубували з різними концентраціями B(a)P і G-Rg3 в MEM протягом 48 годин.Клітини можна додатково проаналізувати або зібрати для приготування безклітинних екстрактів.
Усі експерименти були схвалені Комітетом з етики експериментальних тварин Медичного коледжу Тунцзі Науково-технологічного університету Хуачжонг (Схвалення № 2019; Реєстраційний № 4587TH).Усі експерименти проводилися згідно з відповідними рекомендаціями та правилами, а дослідження проводилося відповідно до рекомендацій Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE).Восьмитижневим мишам A/J спочатку внутрішньочеревно вводили B(a)P у розчині трикаприну (100 мг/кг, 0,2 мл).Через тиждень мишей випадковим чином розділили на контрольні групи та різні групи лікування, по 15 мишей у кожній групі, і їм давали зонд один раз на день.Після 20 тижнів лікування тварин умертвляли шляхом CO2-асфіксії.Легені збирали і фіксували протягом 24 годин.Кількість поверхневих пухлин та розміри окремих пухлин кількісно визначали для кожної легені під розсікаючим мікроскопом.Оцінки об’єму пухлини (V) розраховували за таким виразом: V (мм3) = 4/3πr3, де r – діаметр пухлини.Чиста сума всіх об’ємів пухлини в легенях мишей представляла загальний об’єм пухлини, а середній загальний об’єм пухлини в кожній групі представляв пухлинне навантаження.Зразки цільної крові та кишечника збирали та зберігали при -80°C для визначення UPLC-MS/MS.Було зібрано сироватку крові та використано автоматизований хімічний аналізатор для аналізу рівнів аланінамінотрансферази (ALT) і креатиніну (Cr) у сироватці крові для оцінки функції печінки та нирок.
Зібрані зразки виймали з холодного сховища, розморожували, зважували та поміщали в пробірки, як описано вище.До цього додавали 0,5 мкМ флоризин (внутрішній стандарт) у 0,8 мл розчину метанолу.Потім тканину гомогенізували за допомогою Tissue-Tearor, а потім гомогенат переносили в мікроцентрифужну пробірку на 1,5 мл.Суміш центрифугували при 15500 об/хв протягом 15 хвилин.Після видалення 1,0 мл супернатанту висушити азотом.Для відновлення було використано двісті мікролітрів метанолу.Кров збирається та обробляється на одній лінії та використовується як еталон для всіх вимірювань.
24-лункові планшети Transwell засівали 1,0 × 105 клітин Caco-2 на лунку для оцінки потенційного посилення транспорту G-Rg3 шляхом додавання верапамілу.Через 3 тижні культивування клітини промивали HBSS і попередньо інкубували при 37°C.400 мкл 10 мкМ G-Rg3 (G-Rg3r, G-Rg3s або суміші з 50 або 100 мкМ верапамілу) вводили на базолатеральний або апікальний бік моношару, а 600 мкл розчину HBSS додавали до іншого. бік.Зберіть 100 мкл культурального середовища у визначений час (0, 15, 30, 45, 60, 90 і 120 хвилин) і додайте 100 мкл HBSS, щоб досягти цього об’єму.Зразки зберігали при -4 °C до виявлення за допомогою UPLC-MS/MS.Вираз Papp = dQ/(dT × A × C0) використовується для кількісної оцінки видимої односпрямованої апікальної та базолатеральної проникності і навпаки (Pa-b та Pb-a відповідно);dQ/dT — зміна концентрації, A (0,6 см2) — площа поверхні моношару, C0 — початкова концентрація донора.Коефіцієнт витоку розраховується як Pb-a/Pa-b, що представляє швидкість витоку досліджуваного препарату.
Самців щурів Wistar голодували протягом 24 годин, пили лише воду та анестезували шляхом внутрішньовенної ін’єкції 3,5% розчину пентобарбіталу.Інтубована силіконова трубка має кінець дванадцятипалої кишки як вхід і кінець клубової кишки як вихід.Використовуйте перистальтичний насос, щоб накачати вхідний отвір 10 мкМ G-Rg3r або G-Rg3s в ізотонічному HBSS зі швидкістю потоку 0,1 мл/хв.Ефект верапамілу оцінювали шляхом додавання 50 мкМ або 100 мкМ сполуки до 10 мкМ G-Rg3r або G-Rg3s.UPLC-MS/MS проводили на перфузійних екстрактах, зібраних через 60, 90, 120 і 150 хвилин після початку перфузії.Відсоток абсорбції визначається кількісно за формулою % абсорбції = (1 – Cout/Cin) × 100%;концентрація G-Rg3 на виході та вході виражається Cout і Cin відповідно.
Клітини hEL висівали в 96-лункові планшети з щільністю 1 × 104 клітин на лунку та обробляли B(a)P (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 мкМ) або G-Rg3, розчиненим у ДМСО .Потім препарати розводили культуральним середовищем до різних концентрацій (0, 1, 2, 5, 10, 20 мкМ) протягом 48 годин.Використовуючи комерційно доступний набір для аналізу MTS, клітини піддавали стандартному протоколу, а потім вимірювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів при 490 нм.Рівень життєздатності клітин груп, які одночасно отримували B(a)P (10 мкМ) і G-Rg3 (0, 1, 5, 10, 20 мкМ), оцінювали відповідно до вищезазначеного методу та порівнювали з групою без лікування.
Клітини hEL висівали в 6-лункові планшети з щільністю 1 × 105 клітин/лунку та обробляли 10 мкМБ(a)P у присутності або за відсутності 10 мкМ G-Rg3.Через 48 годин обробки ДНК екстрагували з клітин hEL за допомогою QIAamp DNA Mini Kit згідно з протоколом виробника.Утворення аддуктів BPDE-ДНК було виявлено за допомогою набору ELISA для аддукту BPDE-ДНК.Відносні рівні аддукту BPDE-ДНК вимірювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів шляхом вимірювання поглинання при 450 нм.
Клітини hEL висівали в 96-лункові планшети з щільністю 1 × 104 клітин на лунку та обробляли 10 мкМБ(a)P за відсутності або в присутності 10 мкМ G-Rg3 протягом 48 годин.Активність GST вимірювали за допомогою комерційного набору для аналізу активності GST згідно з протоколом виробника.Відносну активацію GST вимірювали за абсорбцією при 450 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів.
Клітини hEL промивали охолодженим PBS і потім лізували за допомогою буфера для аналізу радіоімунопреципітації, що містить інгібітори протеази та інгібітори фосфатази.Після кількісного визначення білка за допомогою набору для аналізу загального білка 30 мкг білка в кожному зразку відокремлювали за допомогою 12% SDS-PAGE і переносили на мембрану PVDF за допомогою електрофорезу.Мембрани блокували 5% знежиреним молоком та інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4°C.Після інкубації з вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону, додавали реагенти з посиленою хемілюмінесценцією для візуалізації сигналу зв’язування.Інтенсивність кожної смуги білка кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення ImageJ.
Програмне забезпечення GraphPad Prism 7.0 використовувалося для аналізу всіх даних, виражених як середнє ± стандартне відхилення.Варіації між групами лікування оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента або одностороннього дисперсійного аналізу зі значенням P <0,05, що вказує на статистичну значущість.
Усі дані, отримані або проаналізовані під час цього дослідження, включені до цієї опублікованої статті та файлів додаткової інформації.
Torre, LA, Siegel, RL і Jemal, A. Статистика раку легенів.прислівник.Термін дії минув.ліки.біологія.893, 1–19 (2016).
Hecht, S. Тютюнові канцерогени, їх біомаркери та рак, індукований тютюном.Нац.Капелан раку.3, 733–744 (2003).
Phillips, DH і Venitt, S. ДНК і білкові аддукти в тканинах людини в результаті впливу тютюнового диму.інтернаціональність.Ж. Рак.131, 2733–2753 (2012).
Yang Y., Wang Y., Tang K., Lubet RA та Yu M. Вплив Houttuynia cordata та силібініну на бензо(а)пірен-індукований пухлиноподібний процес легень у A/J мишей.Рак 7, 1053–1057 (2005).
Tang, W. та ін.Протираковий натуральний продукт, виділений з китайських лікарських матеріалів.щелепа.ліки.6, 27 (2011).
Yang, Y. та ін.Ефективність поліфенону Е, червоного женьшеню та рапаміцину на індукований бензо(а)піреном пухлиноподібний процес легень у мишей A/J.Рак 8, 52–58 (2006).
Wang, CZ, Anderson, S., Du, W., He, TS і Yuan, KS Red, участь у лікуванні раку.щелепа.Дж. Натт.ліки.14, 7–16 (2016).
Lee, TS, Mazza, G., Cottrell, AS і Gao, L. Ginsenosides в коренях і листі американського женьшеню.Дж. Агрік.Харчова хімія.44, 717–720 (1996).
Attele AS, Wu JA і Yuan KS Фармакологія женьшеню: багато компонентів і багато ефектів.біохімія.фармакології.58, 1685–1693 (1999).
Час публікації: 17 вересня 2023 р